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1、第1頁/共63頁第2頁/共63頁第3頁/共63頁第4頁/共63頁第5頁/共63頁第6頁/共63頁第7頁/共63頁第8頁/共63頁識別序列 大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。 也有少數(shù)限制酶識別序列由4、5、或8個核苷酸組成。第9頁/共63頁第10頁/共63頁第11頁/共63頁第12頁/共63頁平末端平末端第13頁/共63頁第14頁/共63頁第15頁/共63頁E.coliDNA連接酶 從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性末端的連接T4DNA連接酶從T4噬菌體中分離得到的。既能用于粘性末端的連接，又能用于平末端的連接，但是平末端的連接效率低。第16頁/共63頁為什么要用運載體？第17頁/共6

2、3頁第18頁/共63頁第19頁/共63頁第20頁/共63頁第21頁/共63頁原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動子，下游有終止子第22頁/共63頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子 外顯子 啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列： 包括非編

3、碼區(qū)和內(nèi)含子第23頁/共63頁原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是_的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第24頁/共63頁第25頁/共63頁供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶第26頁/共63頁1、目的基因的獲取1目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子2獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成第27頁/共63頁概念：基因文庫 （

4、gene library）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library)第28頁/共63頁基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.第29頁/共63頁基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系第30頁/共63頁cDNA文庫的構(gòu)建mRNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA） DNA聚合酶雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第31頁/共63頁基

5、因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第32頁/共63頁如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。第33頁/共63頁利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。第34頁/共63頁第35頁/共63頁v 人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成第36頁/共63頁3、基因表達(dá)載體（重組

6、質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_。（2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1過程:第37頁/共63頁2基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞第38頁/共63頁第39頁/共63頁質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種過程:第40頁/共63頁2

7、、基因表達(dá)載體的作用a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？第41頁/共63頁第42頁/共63頁第43頁/共63頁第44頁/共63頁1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第45頁/共63頁（2）基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體

8、DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。第46頁/共63頁（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第47頁/共63頁2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞方法:顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物第48頁/共63頁3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體

9、與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA第49頁/共63頁第50頁/共63頁(四)目的基因的檢測與鑒定檢測導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法DNA分子雜交表達(dá)檢測轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交翻譯檢測抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定第51頁/共63頁第52頁/共63頁知識延伸DNA分子雜交技術(shù) 該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第53頁/共63頁第54頁/共63頁DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測SARS病毒等）abcd第55頁/共63頁復(fù)習(xí)題1）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞有哪些方法?(試舉例說明)2）簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第56頁/共63頁非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動子原核真核第57頁/共63頁第58頁/共63頁第59頁/共63頁第60頁/共63頁第61頁/共63頁第62頁/共63頁感謝您的觀看！第63頁/共63頁