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1、2022年高中生物《多聚酶鏈式反應擴增DNA片段》教案3 新人教版選修1
教學目標:
(一)知識與技能
1、了解PCR技術的基本操作
2、理解PCR的原理
3、討論PCR的應用
(二)過程與方法
在多聚酶鏈式反應擴增DNA片段的實驗過程中,應避免外源DNA污染,嚴格控制溫度等反應條件
(三)情感、態(tài)度與價值觀
通過對PCR實驗的操作及結果分析,培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和實事求是的科研精神
教學重點:PCR的原理和PCR的基本操作
教學難點:PCR的原理
教學過程:
(一)引入新課
在現(xiàn)代生物技術中,DNA技術可謂是尖端技術。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測
2、、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列,就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢?今天我們來研究學習DNA分子的擴增技術――PCR技術。
(二)進行新課
1.基礎知識
PCR技術擴增DNA的過程,與細胞內DNA復制過程類似:
1.1細胞內DNA復制條件分析:
條件
組分
作用
模板
DNA的兩條單鏈
提供復制的模板
原料
四種脫氧核苷酸
合成DNA子鏈的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打開DNA雙螺旋
催化合成DNA子鏈
能量
ATP
為解螺旋和合成子鏈供能
引物
RNA
為DNA聚合酶提供合成的
3、3’端起點
1.2細胞內DNA復制過程
(1)DNA的反向平行結構:(結合投影圖)
核苷酸分子的結構與方向性:(分子結構模式圖)
由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈:(模式圖,體現(xiàn)方向性)。
DNA雙螺旋結構的反向平行結構:
(2)DNA的復制過程:
解 旋:解旋酶、ATP,DNA兩條鏈打開,,形成兩條DNA單鏈。
引物結合:在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結合,確保引物3’端與DNA單鏈準確配對。
DNA聚合酶結合:
子鏈合成:DNA聚合酶從引物3’端開始,將配對的脫氧核苷酸連接起來。
后續(xù)加工:DNA聚合酶I將引物切去,并合成空缺處的DNA單鏈,
4、再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(半不連續(xù)合成。先導鏈,滯后鏈)
子鏈合成特點:不能從頭合成;合成方向為“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘:DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成,還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復查一次,只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合,它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能,因此RNA的合成不需要引物,而是從頭合成的,它的錯配可能性較大,在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去,代之以高保真的DNA鏈。
[思考]DNA分子能準確復制的原因有哪些?
DNA雙螺旋結構提供模板;堿基互補配對;DNA聚合酶的復查功能。
[思考]細胞內哪些
5、物質是從頭合成的?RNA合成、蛋白質合成。
1.3DNA分子復制的人工控制
解開螺旋:在80~100℃時,DNA雙螺旋打開,形成兩條DNA單鏈,稱為變性。
恢復螺旋:在50℃左右時,兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構,稱為復性。
復制條件:緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。
反應場所:PCR儀(自動溫度周期性調節(jié))。
[思考]緩沖液相當細胞內的什么成分?(核基質)1.4PCR的反應過程
延伸
復性
變性
變性:在95℃時DNA解旋
復性:在50℃時引物與DNA單鏈結合
延伸:在72℃時合成DNA子鏈(兩個引物間的序列)2.實驗操
6、作
2.1 PCR反應體系:緩沖液、DNA模板,四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物,水
2.2 實驗操作步驟
2.3 按照PCR反應體系配方配制反應液;
(2)將PCR反應體系50μL用微量移液器轉移到微量離心管(0.5mL)中;
(3)將微量離心管放到PCR儀中;
(4)設置PCR儀的工作參數(shù)。
(5)DNA在PCR儀中大量擴增。
2.4 水浴法:將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應時間。
3.實驗注意事項
3.1避免外源DNA污染:所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。
3.2緩沖液和酶分裝成小份,-20℃低溫保存
7、。
3.3每添加一種反應成分,更換一個移液器的槍頭。
3.4混勻后離心處理,使反應液集中在離心管底部。
4.結果分析與評價
4.1反應液稀釋:取2μLPCR反應液,添加98μL蒸餾水;2.分光光度計調零:將100μL蒸餾水添加到比色杯中,在260nm處將分光光度計調整讀數(shù)為零。
4.2將100μL反應稀釋液倒入比色杯中,測定在260nm處的光吸收值。
4.3計算:DNA含量=50×光吸收值×稀釋倍數(shù)
(三)課堂總結、點評
多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
PCR原理
DNA的復制需要酶、原料、能量、引物
DNA的變性和復性受溫度影響
PCR過程
變性
復性
延
8、伸
操作步驟
配制PCR反應體系
移入離心管
放入PCR
設置工作參數(shù)
DNA擴增
測定含量
稀釋
調零
測定并讀數(shù)
計算
(四)實例探究
例1 在( )的溫度范圍內,DNA的雙螺旋結構解開
A. 10-20℃ B. 80-100℃ C. 20-30℃ D. 40-60℃
解析:蛋白質大多不能忍受60-80℃的高溫,而DNA在80℃以上才會變性。
答案:B
例2 關于DNA的復制,下列敘述正確的是( )
A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從5’端延
9、伸DNA鏈
B.DNA復制不需要引物
C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結合
D.DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸
解析:由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3’端即復制方向由3’端向5’端延伸;由于DNA分子是反向平行的,子鏈是依據(jù)堿基互補配對原則,在DNA聚合酶作用下合成的,其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。
答案:C
綜合應用
例3 下列有關PCR描述,不正確的是( )
A.是一種酶促反應
B.引物決定了擴增的特異性
C.擴增產量按y=(1+X)n
D.擴增對象是氨基酸序列
E.擴增對象是DNA序列
解析:PCR是一
10、種體外迅速擴增DNA片段的技術,它以極少量的DNA為模板,以四種脫氧核苷酸為原理,在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸,短時間內迅速復制上百萬份的DNA拷貝,其擴增產量為y=(1+X)n,y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),x表示平均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù),因此答案選D。
答案:D
課后探究
1、PCR與生物體DNA復制有何區(qū)別?
2、如果在案件偵破過程中,只收集到一根毛發(fā),但它所含的遺傳信息太少,該怎么辦呢?
★教后小記
教師在教學過程中,可以先引導學生回憶必修2的有關DNA復制的知識,在此基礎上,學生可加深對于PCR原理的認識。對于PCR反應過程的教學,應以讀圖識圖為主。教材中反應過程圖解詳細的描繪了參與PCR的各種組成成分;每一輪反應的三個基本步驟—變性、復性、延伸;每一步驟的作用。教師在教學中可以請學生在讀圖的同時,結合教科書中的文字說明來加深理解。當學生遇到難以理解的地方時,教師要及時給予解答。