組織制片技術,病理組織制片技術 定義,要實現(xiàn)對病變組織的顯微鏡形態(tài)學檢查，需要將獲得的病變組織制片。我們將切片制作所采用的一系列技術。,組織制作基礎制作流程,封片 染色 烤片 貼片 展片 切片 包埋 浸蠟 透明 脫水 洗滌 固定 取材,一、取材 定義,按照病理檢查的目的和要求，切取適當大小和數(shù)量的組織塊，用于制作組織切片的過程。,切片刀,取材 要求,(1)材料新鮮：取材組織愈新鮮愈好，人體組織一般在離體后，動物組織在處死后迅速固定，以保證原有的形態(tài)學結構。 (2)組織塊的大?。核〗M織塊較理想的體積為2.0cm2.0cm0.3cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內部，但根據(jù)制片材料和目的不同，組織塊的較理想體積也不同，如制作病理外檢、科研切片，其組織塊可以薄取0.10.2cm即可，這樣可以縮短固定脫水透明的時間，若制作教學切片厚取0.3 0.5cm，這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學切片。 (3)勿擠壓組織塊: 切取組織塊用的刀剪 要鋒利，切割時不可來回銼動。夾取組織時切勿過緊，以免因擠壓而使組織、細胞變形。,4)規(guī)范取材部位: 要準確地按解剖部位取材，病理標本取材按照各病變部位、性質的不同，根據(jù)要求規(guī)范化取材。 (5)選好組織塊的切面:根據(jù)各器官的組織結構，決定其切面的走向。縱切或橫切往往是顯示組織形態(tài)結構的關鍵，如長管狀器官以橫切為好。 (6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用水沖洗干凈后再放入固定液中。 (7)保持組織的原有形態(tài):新鮮組織固定后，或多或少會產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能維持原形。,取材臺,二、固定 定義,將組織浸入某些化學試劑。使組織細胞內所含物質盡量保持在生活狀態(tài)時形態(tài)結構和位置的過程。,固定 目的,防止自溶和腐敗 凝固或沉淀細胞內物質 硬化組織 增加組織的折光率,固定 方法,(1)小塊組織固定法：這是最常用的方法，從人體或動物體取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進行固定，通常，標本與固定液的比例為1:420，但組織塊不宜過大過厚，否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm2.0cm0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內部，或需要對整個臟器或整個動物體進行固定。這時宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達整個組織和全身，從而得到充分的固定。 (3)蒸汽固定法：比較小而厚的標本，可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，則應在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。,常用固定液 特性,滲透力強，能迅速滲入組織內部 不會使組織過度收縮或膨脹 能硬化、固定組織，使細胞成分的形態(tài)和位置與生活狀態(tài)時相似。 使組織對染料產(chǎn)生較強的親和力，并產(chǎn)生較佳的折光率。,常用的固定液,單純固定液 10%甲醛（福爾馬林）：甲醛濃度為40%，指10ml甲醛加入90ml的水配成的。 乙醇（80%90%最好） 乙酸（醋酸、冰醋酸） 紅色字體為常用固定液,固定液,中性甲醇液： 甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g配制而成，PH值達到。此固定液是人體組織和動物組織常用之固定液，特別是作免疫組織化學染色固定時效果較好。 乙醇-醋酸-甲醇液 乙醇-甲醇液（AF液）： 95%或無水乙醇90ml，40%甲醛10ml配制而成 Bouin液 Zenker液,混合固定液,紅色字體為常用固定液,固定的注意事項,及時固定（夏天超過4h，冬天超過24h組織會干涸、自溶、腐敗。） 固定容器宜大 固定液應足量（為被固定組織體積的1020倍） 防止組織變形 確定恰當?shù)墓潭〞r間（1224h）,固定液,組織固定的常見問題,固定液使用時間較長，有效濃度降低 固定時間正常， 但固定時間效果差 固定液的量不足 標本過薄 標本扭曲變形，過脆過硬 固定液濃度過高，過程過強 固定時間長 標本之間重疊或與容器壁、底部緊貼 標本局部固定不良 標本過多，容器太少 標本輕，漂浮于固定液面 標本過大，過厚 標本中心固定不透 固定液滲透力強，濃度高使組織表層迅速硬化 固定時間短 固定液失效,固定不充分 固定充分,三、洗滌、脫水、透明,洗滌 定義,用水或乙醇等組織經(jīng)過固定處理后， 未與組織結合的固定液及沉淀物清洗掉 的過程。,洗滌 目的,去掉未與組織結合的固定液及沉淀物 避免組織中留有較多的固定液而妨礙脫水 組織中生成的沉淀物或結晶而影響染色和觀察 可減少甲醛色素,洗滌的方法,含水固定液的洗滌方法（常用的是甲醛，用自來水沖洗即可） 含乙醇固定液的洗滌方法（用乙醇或乙醇混合液固定的組織，一般不需要清洗） 特殊固定液的洗滌方法（使用的固定液不同，洗滌的方法也不一樣）,脫水 定義,標本經(jīng)過固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，必須將組織塊內的水分置換出來，這一過程。,無論是用石蠟切片，還是用火棉膠切片，都必須除去組織中所含水分，因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容，常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。,及時的進行核對,脫水 目的,組織塊經(jīng)鞏固定和水洗后，含有大量水分，而水與苯、二甲苯等透明劑不混溶,故在組織前必須用能與透明劑相混合的脫水劑(如乙醇等),把組織內的水分置出來,為下一步做準備。,常用的脫水劑,乙醇（最常用的脫水劑） 沸點78.4，脫水能力強，能硬化組織，可較好地與二甲苯混合。 脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時，此過程可用脫水機自控完成。 柔嫩組織的脫水應從50%或30%乙醇開始 組織在高濃度乙醇（無水乙醇）中留置時間不宜過長。,丙酮 沸點56，可用于染色前后的脫水，對組織的脫水作用，收縮作用均比乙醇強，價格較高，一般很少單純使用。,丙酮也是一種脫水能力很強的脫水劑，但因其脫水能力很強，對組織有劇烈收縮作用，在制作科研、教學切片時一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟，還要經(jīng)過一個能溶于石蠟的溶劑替代過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等,異丙醇 是乙醇的良好的代用品，不含水，可代替無水乙醇。,脫水的方法,自低到高溶度依次進行，使組織中所含水分逐漸減少直至被脫水劑代替。,脫水機,透明 定義,用某些化學試劑將組織中的脫水劑置換出來，以利于浸蠟和包埋，因組織塊浸入這此試劑后常呈半透明狀,透明 目的,透明是制片過程中很重要的環(huán)節(jié)。大多數(shù)脫水劑不能和包埋劑（如石蠟）混溶，而透明劑即可與脫水劑混溶，又能和包埋劑（如石蠟）混溶，能起到橋梁作用。,常用的透明劑,苯 甲苯 二甲苯（最常用的透明劑） 三氯甲烷 汽油 香柏油 冬青油 松油醇,常用的透明 方法,將脫水后的組織塊先用乙醇-二甲苯混合液處理或直接浸入透明劑中，置換透明劑23次即能達到目的。 透明的時間的長短取決于標本的種類和組織塊的厚薄，一般活檢標本透明1520min即可。,四、浸蠟、包埋,浸蠟 定義,經(jīng)過透明的組織塊在溶化的石蠟中浸漬，使組織中的透明劑被完全置換出來的過程,浸蠟的 目的,使石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑 。,浸蠟的 種類,石蠟 明膠 火棉膠 樹脂 碳蠟,又是包埋劑。 既是透明劑，,浸蠟的方法,熔點：5658 溫度：5860（高于石蠟熔點23）,浸蠟的 注意事項,首先，應保證所用石蠟的質量，盡量不含雜質，否則易造成切片刀刀口受損或切片破碎、劃痕增多。 其次，浸蠟用的石蠟熔點應控制在5558。蠟溫過低，浸蠟不良；蠟溫過高回燙傷組織，是組織收縮、變硬、切片時易脫片、卷片。 再次，要控制好浸蠟時間。時間過短，蠟沒有完全滲入組織、組織過軟；時間過長，造成組織硬脆。兩者均可造成切片困難。另外，應盡量去除沾在組織上的二甲苯，在浸蠟。,浸蠟機,包埋 定義,將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟凝固后，組織即被包在其中稱蠟塊，此過程稱為包埋。,包埋的目的,有利于組織塊的妥善保存 有利于切成薄片 可使組織具有一定硬度和韌性,包埋方法,石蠟包埋法（最常用） 火棉膠包埋法 碳蠟包埋法 明膠包埋法,包埋的注意事項,包埋時，框要比組織塊大，保證蠟塊 組織周圍都有蠟邊，對管、腔、壁組織要垂直包埋，而胃、腸、膽囊等組織，應將能看到的組織學各層面作為切面，其他組織則將切面朝下，小塊多顆組織盡量放在一起并保持在同一水平面；包埋的蠟質不能含有雜質、紙絮、縫線等異物，最好是經(jīng)過多次溶化、沉淀過的蠟。以利于切片。,包埋機,組織包埋盒,四、切片,常用的切片方法,石蠟切片 冰凍切片 火棉膠切片,切片前準備,(1)修整蠟塊 可視其組織的大小，在組織邊緣約0.10.2cm處，切去余蠟部分。,否則易造成組織皺縮不平。,(2)準備好切片用具,切片刀 毛筆 眼科鑷子（彎） 漂烘溫控儀,(3)安裝蠟塊,將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上,(4)安裝切片刀,將切片刀安裝在切片機的刀臺上，把刀臺上的緊固螺絲旋緊，使切片時不產(chǎn)生振動，能保持一定的切片厚度,組織切片刀,(5)切片的厚度,切片機的厚度調節(jié)器上刻有050m或025m，可任意選擇其厚度，石蠟切片的厚度一般在46m,切片制作過程,將切片刀安裝于刀架上（調整好刀的角度，一般為2030左右） 將蠟塊固定在切片組織塊夾具上 調整組織塊夾具的調節(jié)蠟旋，使蠟塊切面與刀口平行。 先粗修（ 3050um ） 細修（ 10um ）,切片的注意事項,切片前蠟塊要冷凍，但不能把剛包埋好的熱蠟塊冷凍，否則蠟塊會產(chǎn)生裂痕，一夾就碎。 蠟塊裝機時，應注意組織包埋的方向，組織的層次、纖維、肌肉等走向應與切片刀平行。 蠟塊在切片機固定加緊后要修塊，組織塊上下留邊各2mm,蠟片厚度一般在3-5um 同一把切片刀每次要固定角度 切片有縱紋,可能與切片刀有小缺口或修塊時未把雜物去除,以及石蠟不潔有關,切片機,五、展片,展片 定義,連續(xù)轉動旋轉輪，切片的蠟片相連成狀，需要將其展平整才能貼在載玻片上，此過程為展片。,展片,撈片,展片困難時，可先將蠟帶放入30%乙醇處展，在用載玻片撈起蠟帶放入溫水中。待蠟帶中的組織完全展平后，即可將其撈出，稱為撈片。,撈片,六、貼片、烤片,貼片、烘片,待切片在恒溫水面上充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水，置入6065恒溫箱內或切片漂烘溫控儀的烘箱內烤片1530分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。,烤片機,七、染色,染色 定義,用染液對組織切片進行處理，使組織中的不同成分被染上相應的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于顯微鏡觀察和分析的方法。,常用的染色方法,蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin）染色法 簡稱H.E染色法。 這種方法對任何固定液固定的組織和應用各種包埋法的切片均可使用。,蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質染成藍色，如細胞核中的染色質等；伊紅是一種酸性染料，可使組織中的嗜酸性物質染成紅色，如多數(shù)細胞的胞質、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。,H.E染色程序如下,脫蠟 脫苯 復水 染色 脫水 透明 封固,切片脫水透明要徹底,染色后，要徹底脫水透明，才能進行樹膠封蓋，成為永久標本。如果脫水透明不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下模糊不清，過一段時間染片就褪色。脫水要經(jīng)過多次無水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯進行脫水。如采用后者，染片要經(jīng)過多次二甲苯以除去石炭酸。,注意,切片在染色前必須脫蠟干凈：未完全脫蠟的組織切片，染色后組織和細胞模糊不清。脫蠟要用兩級或三級脫蠟劑如二甲苯，時間為1020分鐘，應視所用二甲苯的新舊以及室溫情況而定。脫蠟時間寧可長些，不應過短,一張高質量的HE切片要求,1. 切片完整、貼片恰當 2. 切片較薄而均勻 3. 無皺折 4. 無刀痕 5. 染色清晰、核漿分明、透明度好 6. 無固縮、龜裂、污染 7. 封膠適當、玻片清潔 8. 字體端正、號碼清楚,切片完全干涸，會使組織收縮、割裂，形成所謂”龜裂”現(xiàn)象。也會使部分細胞核透明不良，看起來像黑色的細胞核。 完成染色后，每張片子要在顯微鏡下觀察，檢查制片過程中有沒有發(fā)生差錯。,八、封片,封片注意事項,所用樹膠濃度要適中 樹膠用量多少應根據(jù)組織大小、厚薄而定 應迅速敏捷滴膠 封片時，切片上應保留適當?shù)亩妆?，以防干封，產(chǎn)生氣泡。 為防止氣泡，封片時，樹膠不宜攪動。 如遇有小泡時可用鑷子輕壓蓋玻片，排除氣泡。,謝謝！,