第三章 消毒與滅菌,1滅菌：應(yīng)用物理或化學(xué)方法殺滅物體中所有的病原微生物、非病原微生物以及芽胞和霉菌孢子的方法。 2消毒：應(yīng)用物理或化學(xué)方法殺滅物體中的病原微生物，而對(duì)非病原微生物及芽胞，孢子不要求全部殺死。 3防腐：應(yīng)用物理或化學(xué)方法阻止和抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖的方法。 4無(wú)菌操作法：防止或杜絕一切細(xì)菌進(jìn)入動(dòng)物體或其他物體的方法。 5濾過(guò)除菌：液體或氣體通過(guò)濾過(guò)作用除去其中所存在的細(xì)菌。一般用0.22微米濾膜，但不能除去病毒，霉形體及L型細(xì)菌。,介紹幾個(gè)基本概念,第一節(jié) 物理因素,溫度 干燥 滲透壓 輻射 過(guò)濾 其他物理因素,一、溫度 （一）高溫對(duì)微生物的影響,高溫對(duì)微生物有明顯的致死作用，其主要原因是高溫能使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，酶失去活性，核酸結(jié)構(gòu)遭到破壞等，從而導(dǎo)致其死亡。 多數(shù)細(xì)菌，酵母菌和霉菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和病毒在50-65 10 min可以致死。 細(xì)菌芽孢，在121 下20min才能致死， 同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。,干熱滅菌(dry heat sterilization ) 焚燒滅菌法：常用于廢棄物動(dòng)物尸體等處理。 燒灼滅菌法：是直接火焰滅菌，如接種環(huán)滅菌。 烘烤滅菌法；實(shí)驗(yàn)室用干燥箱烘。一般是1602小時(shí)即可達(dá)到滅菌目的。,濕熱滅菌(mosist heatsterilization) 在同溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好；因?yàn)椋?a比干熱更易使菌體蛋白凝固。 b濕熱穿透力強(qiáng)； c濕熱可以釋放大量潛熱。,濕熱滅菌法 高壓蒸汽滅菌法 煮沸消毒法 流通蒸汽消毒法 間歇蒸汽滅菌法 巴氏消毒法,高壓蒸汽滅菌法 是濕熱滅菌中最好的方法， 通常1.05kg/cm2,的壓力下面 （此時(shí)溫度121）處理15 30min。要排冷空氣，否則 會(huì)形成假壓力，雖然壓力達(dá) 到要求，溫度卻達(dá)不到相應(yīng) 溫度，而影響滅菌效果。,B、煮沸消毒法 物品在水中煮沸 15min，可殺死所有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。 在水中加入的a2CO3 或的石碳酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。,C、間歇滅菌法(fractional sterilization） 是用常壓蒸汽反復(fù)幾次進(jìn)行滅菌的方法。 主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基，不耐熱的藥物和營(yíng)養(yǎng)物等 方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內(nèi)加熱到沸騰維持15-30min殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，取出冷卻后在37恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，使芽孢萌發(fā)，再用此法滅菌，反復(fù)三次，即可達(dá)到滅菌目的。,D、巴氏消毒法(pasteurization) 是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。 具體做法是6365處理30min或7172度處理15 s,速冷卻至10下。 這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營(yíng)養(yǎng)，可保留食品飲料原有風(fēng)味。 d) 為節(jié)省時(shí)間，又達(dá)到巴氏消毒的效果，現(xiàn)多用高溫瞬時(shí)滅菌132下1-2 s。,（二）低溫對(duì)微生物的影響,常溫冰箱保存細(xì)菌和病毒：（細(xì)菌40；病毒2070）。 低溫保存食品應(yīng)迅速冷凍，否則擾亂細(xì)胞膠體狀態(tài)，使水分形成結(jié)晶，冰結(jié)晶還能機(jī)械地刺傷菌體胞膜，胞壁。 冷凍真空干燥法：采取迅速冷凍和抽真空除水原理；如凍干疫苗和凍干菌種。,二 、干燥,水分是微生物的正常生命活動(dòng)必不可少的。干燥會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失水而造成代謝停止以致死亡。 微生物的種類(lèi)，環(huán)境條件，干燥的程度等均影響對(duì)微生物殺滅的效果。休眠孢子抗干燥能力也很強(qiáng)，在干燥條件下可長(zhǎng)期不死，這一特性已用于菌種保藏，如用砂土管來(lái)保藏有孢子的菌種。 在日常生活中也常用烘干、曬干和熏干等方法來(lái)保存食物。,三、滲透壓,細(xì)菌處于低滲液中，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹乃至破裂，稱(chēng)胞漿壓出。 細(xì)胞處于高滲液中會(huì)脫水，引起細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁分離，稱(chēng)質(zhì)壁分離，導(dǎo)致死亡。 等滲溶液對(duì)微生物生長(zhǎng)有利,四、輻射,輻射是能量通過(guò)空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。 可見(jiàn)光線 肉眼可見(jiàn)的光線是在紅外線和紫外線之間，波長(zhǎng)為400800nm。 日光 利用日光暴曬是常用的簡(jiǎn)易消毒方法，許多細(xì)菌繁殖體在日光直射下2h很易死亡。,紫外線：,殺菌機(jī)理：,波長(zhǎng)200300m的紫外線具有殺菌作用,干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,紫外線穿透力較弱,不耐熱物品的表面消毒,應(yīng)用范圍：,特點(diǎn)：,殺菌機(jī)理：,應(yīng)用范圍：,電離輻射：,包括高速電子、x射線和 射線。,產(chǎn)生游離基,破壞DNA。,一次性醫(yī)用塑料制品的消毒，,食品的消毒不破壞其營(yíng)養(yǎng)成分。,五、濾過(guò)除菌法,濾菌器:用物理阻留的方法，將液體或空氣中的細(xì)菌除去,以達(dá)到除菌目的。含有微細(xì)小孔0.22微米,只允許液體或氣體通過(guò)，而大于孔徑的細(xì)菌等顆粒不能通過(guò)。 適用范圍：血清、毒素、抗生素以及空氣等的除菌。,濾菌器,六 、其他物理因素,超聲波 超聲波是由超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的，對(duì)細(xì)胞有破壞作用，能使大多數(shù)細(xì)胞裂解死亡。 微波 微波是一種波長(zhǎng)短而頻率較高的電磁波。微波對(duì)微生物的殺菌作用，主要是由于微生物在微波電磁場(chǎng)作用下，吸收微波的能量而產(chǎn)生熱效應(yīng)所致。,第二節(jié) 化學(xué)因素,各種消毒劑可按其作用水平分為3類(lèi)： （1）高效消毒劑：可以殺滅一切微生物，包括細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌芽孢、結(jié)核桿菌、真菌和病毒等。這類(lèi)消毒劑又稱(chēng)為滅菌劑。 如甲醛、戊二醛、過(guò)氧乙酸和環(huán)氧乙烷等。 （2）中效消毒劑 除細(xì)菌芽孢外，可殺滅各種微生物。如乙醇、酚、含氯消毒劑和碘消毒劑等。 （3）低效消毒劑 可殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌和有囊膜病毒，但不能殺滅細(xì)菌芽孢、結(jié)核桿菌和無(wú)囊膜病毒。如新潔爾滅、洗必太等。,一、常用消毒劑的實(shí)用性能 見(jiàn)下表,二、影響消毒劑作用的因素,消毒劑的性質(zhì) 消毒劑的濃度與作用時(shí)間 微生物的類(lèi)型及數(shù)量 環(huán)境中有機(jī)物的存在,三、選擇適當(dāng)?shù)南緞?殺菌譜廣、有效濃度低、作用快。 性質(zhì)穩(wěn)定、易溶于水、不易受酸堿影響。 無(wú)腐蝕性、無(wú)毒；不易殘留。 價(jià)格低、便于運(yùn)輸，可長(zhǎng)期保存。,第三節(jié) 生物因素,共生：兩種或多種生物生活在一起時(shí)，彼此并不損害而相互有利，稱(chēng)為共生。 寄生：一種生物從另一種生物獲得所需的營(yíng)養(yǎng)，賴(lài)以為生，并對(duì)后者呈現(xiàn)傷害作用者，稱(chēng)為寄生。 拮抗：當(dāng)兩種微生物生活在一起時(shí)，一種微生物能抑制或殺死另一種微生物，此現(xiàn)象稱(chēng)為拮抗。 協(xié)同：兩種或多種生物在同一環(huán)境中，互相協(xié)助，共同完成某種作用，而為其任何一種所不能單獨(dú)達(dá)到。,一、抗生素與細(xì)菌素,（一）抗生素 是某些微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的能抑制或殺滅其他微生物的一種化學(xué)物質(zhì)。它主要來(lái)源于放線菌、某些真菌和細(xì)菌等。 抗生素的作用機(jī)理： a.干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成 b.影響細(xì)胞膜的通透性 c.阻礙菌體蛋白質(zhì)的合成 d.改變核酸代謝,（二）細(xì)菌素 大腸桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素稱(chēng)大腸菌素；葡萄球菌產(chǎn)生的稱(chēng)葡萄球菌素；霍亂弧菌產(chǎn)生的稱(chēng)弧菌素等，每類(lèi)細(xì)菌素又可分為不同的型別；細(xì)菌素僅對(duì)近緣細(xì)菌有作用。,1928年A.Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素,澳大利亞病理學(xué)家霍華德.弗羅里與弗萊明1940提純出青霉素。 共同獲得1945年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).,三、 噬菌體,病毒種類(lèi)很多，根據(jù)病毒寄生的對(duì)象來(lái)分，有植物病毒、動(dòng)物病毒和微生物病毒。 噬菌體：是病毒中的一種，一般把侵染細(xì)菌、放線菌的病毒叫噬菌體。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌體） 噬菌體在自然界廣泛存在，在1995年發(fā)表的ICTV的病毒分類(lèi)與命名第六次報(bào)告中共報(bào)道了4000余種，分別劃歸為49個(gè)病毒科. 據(jù)Bradley(1967)歸納，噬菌體共有六類(lèi)形態(tài)。,1、組成：主要由蛋白質(zhì)和核酸組成。 2、基本形態(tài)：蝌蚪形、微球形和纖絲形。,（一）噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與組成,以大腸桿菌T4噬菌體為例 頭部：廿面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)衣殼構(gòu)成，內(nèi)含一條DNA。 頸部：薄盤(pán)狀，附頸須。 尾鞘：長(zhǎng)95nm, 衣殼粒螺旋對(duì)稱(chēng)；可伸縮。 尾髓:中空，DNA可由此進(jìn)入細(xì)胞。 基板: 六角形盤(pán)狀物，其上有刺突、尾絲。 刺突: 有吸附功能。 尾絲: 有識(shí)別吸附功能。,大腸桿菌T4噬菌體構(gòu)造,3、蝌蚪形噬菌體的構(gòu)造,（二）、噬菌體(phage)的繁殖,噬菌體并沒(méi)有個(gè)體的生長(zhǎng)過(guò)程，而只有其基本成分的合成和裝配，即首先將各個(gè)部件合成出來(lái)，然后裝配，所以一般將噬菌體的繁殖稱(chēng)做復(fù)制。 根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系： 烈性噬菌體：指感染宿主細(xì)胞后，能夠使宿主細(xì)胞裂解的噬菌體. 溫和噬菌體（或溶源性噬菌體）：噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。,烈性噬菌體的繁殖過(guò)程一般分為五個(gè)階段： 即吸附、侵入、復(fù)制、裝配和釋放。,1、烈性噬菌體的繁殖,吸附：噬菌體和宿主細(xì)胞上的特異性吸附部位進(jìn)行特異性結(jié)合，噬菌體以尾絲牢固吸附在受體上后，靠刺突“釘”在細(xì)胞表面上。 侵入：核酸注入細(xì)胞的過(guò)程。噬菌體尾部所含酶類(lèi)物質(zhì)可使細(xì)胞壁產(chǎn)生一些小孔，然后尾鞘收縮，尾髓刺入細(xì)胞壁，并將核酸注入細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)胞外。 復(fù)制 ：包括核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。噬菌體核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞后，會(huì)控制宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)，然后以噬菌體核酸中的指令合成噬菌體所需的核酸和蛋白質(zhì)。,裝配： 主要步驟有： DNA分子的縮合通過(guò)衣殼包裹DNA而形成頭部尾絲及尾部的其它部件獨(dú)立裝配完成頭部與尾部相結(jié)合最后裝上尾絲，至此，一個(gè)個(gè)成熟的形狀、大小相同的噬菌體裝配完成。,釋放： 方式： 裂解：多以裂解細(xì)胞的方式釋放。 分泌：噬菌體穿出細(xì)胞，細(xì)胞并不裂解。 通常情況下，一個(gè)噬菌體通過(guò)上述五個(gè)過(guò)程能合成100300個(gè)噬菌體。烈性噬菌體的這種生長(zhǎng)繁殖方式也稱(chēng)為一步生長(zhǎng)，,一步生長(zhǎng)曲線,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)：1個(gè)菌體被1個(gè)噬菌體感染,避免二次吸附；細(xì)菌群體被噬菌體同步感染。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程: 敏感菌10ml Phage 1ml 混勻，5min,使之吸附 離心或用抗phage血清處理, 去除過(guò)量phage 高倍稀釋,吸附phage的菌懸液(避免多次吸附) 37培養(yǎng),定時(shí)取樣,取樣人為裂解處理（每5min） 樣品中加入氯仿裂解細(xì)胞,24-48h,裂解液加入敏感菌液中,適當(dāng)稀釋混合液,涂布于瓊脂培養(yǎng)基上,計(jì)數(shù)噬菌斑,噬菌斑: 概念：將少量噬菌體與大量敏感菌混合培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，在平板表面布滿宿主細(xì)胞的菌苔上,可以用肉眼看到一個(gè)個(gè)透明的不長(zhǎng)菌的小圓斑，稱(chēng)為噬菌斑。(每個(gè)噬菌斑一般是由一個(gè)噬菌體粒子形成的。) 應(yīng)用: 噬菌斑可用于檢出、分離、純化噬菌體和進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)。,噬菌斑,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以噬菌斑數(shù)為縱坐標(biāo),繪制成的曲線為一步生長(zhǎng)曲線。 可分以下階段： 潛伏期 裂解期 穩(wěn)定期,一步生長(zhǎng)曲線,潛伏期：從噬菌體吸附細(xì)菌到細(xì)菌細(xì)胞釋放 新的噬菌體之前的這段時(shí)期.曲線平行于橫軸，噬菌體數(shù)無(wú)變化.樣品中無(wú)游離的噬菌體。(潛伏期前的噬菌斑數(shù)是噬菌體數(shù),也就是感染噬菌體的細(xì)菌數(shù)). 裂解期：曲線直線上升,子代噬菌體不斷釋放到培養(yǎng)基中,直到達(dá)到一個(gè)極限. 穩(wěn)定期:感染細(xì)胞后復(fù)制的子代噬菌體全部釋放，噬菌斑數(shù)穩(wěn)定，一次感染結(jié)束。,裂解量:每一受感染細(xì)胞所釋放的新的噬菌體的 平均數(shù)。 穩(wěn)定期噬菌斑數(shù) 裂解量 = 潛伏期噬菌斑數(shù) 不同的噬菌體或同種噬菌體感染敏感菌后所釋放的噬菌體數(shù)不同,與噬菌體種類(lèi)、宿主細(xì)胞菌齡以及環(huán)境因數(shù)有關(guān)。,2、溫和噬菌體與溶源性細(xì)菌,溫和噬菌體：噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。 原噬菌體（或前噬菌體）： 即整合在宿主核DNA上的噬菌體的核酸。 溶原性細(xì)菌：指在核染色體上整合有原噬菌體的細(xì)菌?？蛇M(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖,而不被裂解。,溶原性細(xì)菌的特點(diǎn)： 可穩(wěn)定遺傳：子代細(xì)菌都含有原噬菌體，均具有溶原性。 可自發(fā)裂解：溫和噬菌體的核酸也可從宿主DNA上脫落下來(lái)，恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)，進(jìn)行大量的復(fù)制，變成烈性噬菌體，自發(fā)裂解幾率10-210-5 。 可誘導(dǎo)裂解：用化學(xué)、物理方法誘導(dǎo) 具有“免疫性”：溶原菌對(duì)其本身產(chǎn)生的噬菌體或外來(lái)的同源的噬菌體不敏感，對(duì)同源噬菌體具免疫性，對(duì)非同源噬菌體沒(méi)有免疫性。 可復(fù)愈：自然遺失前噬菌體，但不發(fā)生自發(fā)裂解和誘導(dǎo)裂解 溶源轉(zhuǎn)變：由于溶原菌整合了溫和噬菌體的核酸而使自己產(chǎn)生一些新的生理特征。,（三）、噬菌體的危害和應(yīng)用,噬菌體的危害： 主要是引起發(fā)酵中的噬菌體污染 例：丙酮、丁醇發(fā)酵中的噬菌體污染 抗生素發(fā)酵中的噬菌體污染 食品工業(yè)上的噬菌體污染 防治： 控制活菌排放 選育抗性生產(chǎn)菌株 生產(chǎn)中輪換使用菌種 藥物防治例如用金霉素、四環(huán)素等。,噬菌體的應(yīng)用： 1.作為分子生物學(xué)研究的工具 2.用于鑒定未知菌，可到型。 3.用于臨床治療傳染病 4.檢驗(yàn)植物病原菌 5.測(cè)定輻射劑量,