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1、生物傳感器 中國(guó)科學(xué)院研究生院 姚 鑫 E-mail: 學(xué)習(xí)這門(mén)課的目的 通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，了解各類生物傳感器的基本原理、 特點(diǎn)、技術(shù)方法和應(yīng)用。了解生物傳感器的及發(fā)展趨勢(shì)，為 以后從事相關(guān)領(lǐng)域研究打好基礎(chǔ). 參考書(shū) 張先恩主編，生物傳感器，化學(xué)工業(yè)出版社，北京， 2006 布萊恩 R. 埃金斯 著，羅瑞賢等譯，化學(xué)傳感器與生物 傳感器，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2005 幾個(gè)生物傳感器的例子 DNA-表面等離子激元共振儀(SPR) 多肽-電化學(xué) DNA-電化學(xué) PNA/DNA-SPR 葡糖淀粉酶 支鏈淀粉 酶-石英晶體微天平 Figure 2. (A) Time courses of frequ

2、ency changes of the amylopectinimmobilized QCM, responding to the addition of glucoamylase at (a) 16, (b) 27, (c) 38, and (d) 54 nM. The curve (e) shows the hydrolysis of the pullulan-immobilized QCM at 540 nM glucoamylase (25 C, 20 mM acetate buffer, pH 4.8, 0.1 M NaCl). 傳感器 傳感器:是一種裝置,是檢測(cè)或測(cè)量一種物理性質(zhì)并

3、進(jìn)行記錄,顯示或以其他方式 作出響應(yīng). 化學(xué)傳感器:一種裝置,通過(guò) 某種化學(xué)反應(yīng)以選擇性方式 對(duì)特定的待分析物質(zhì)產(chǎn)生響 應(yīng)從而對(duì)分析質(zhì)進(jìn)行定性或 定量測(cè)定 傳感器 物理傳感器:用以測(cè)量 距離,重量,溫度,壓力 和電性能 生物傳感器:一種裝置,其采 用某種生物敏感元件與轉(zhuǎn)換 器相連接.檢測(cè)物質(zhì)也可以 是純化學(xué)物質(zhì),識(shí)別元件是 生物質(zhì) 第一章 緒 論 分析生物技術(shù)的一個(gè)重要領(lǐng)域便是生物傳感器(biosensor),它是一 個(gè)典型的多學(xué)科交叉產(chǎn)物,結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物理學(xué)和信息科 學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，能夠?qū)λ枰獧z測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行快速分析和追蹤。 生物的基本特征之一，是能夠?qū)ν饨绲母鞣N刺激作出反應(yīng)。

4、其所以 能夠如此，首先是由于生物能感受外界的各類刺激信號(hào)，并將這些信號(hào) 轉(zhuǎn)換成體內(nèi)信息處理系統(tǒng)所能接收并處理的信號(hào)。例如，人能通過(guò)眼、 耳、鼻、舌、身等感覺(jué)器官將外界的光、聲、溫度及其它各種化學(xué)和物 理信號(hào)轉(zhuǎn)換成人體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)等信息處理系統(tǒng)能夠接收和處理的信號(hào)。 生物傳感器的出現(xiàn)，是科學(xué)家的興趣和科學(xué)技術(shù)發(fā)展及社會(huì)發(fā)展 需求多方面雙驅(qū)動(dòng)的結(jié)果，經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一個(gè)涉及內(nèi)容 廣泛、多學(xué)科介入和交叉、充滿創(chuàng)新活力的領(lǐng)域。 1.1 生物傳感器的發(fā)展歷程 20世紀(jì)60年代酶法分析：專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，但是測(cè)定周期 長(zhǎng)。 離子選擇電極( ion selective electrod

5、e, ISE)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行欲 處理無(wú)試劑分析(non-reagental analysis)，但是只能檢測(cè)無(wú)機(jī)離子 1956 Leland C. Clark Jnr 隔離式氧電極 1962 Leland C. Clark Jnr 酶?jìng)鞲衅? enzyme transducer) 1967 S. J. Updike 葡萄糖酶電極 1975 Yellow Springs Instrument(YSI) 葡萄糖測(cè)定儀 1975 C. Divis 用完整活細(xì)胞取代純酶制作傳感器 1977 GA. Rechnitz 用糞便鏈球菌完整活細(xì)胞與氨敏電極組合成測(cè)精氨酸 的微生物電極 1977 I

6、so Karube和J. Janata 測(cè)BOD的微生物傳感器和測(cè)抗原的免疫傳感器 l 隨后出現(xiàn)了細(xì)胞器傳感器、細(xì)胞傳感器和組織切片傳感器 l 20世紀(jì)70年代中期到80年代，生物技術(shù)、生物電子和微電子學(xué)不斷地滲透、融合， 致使生物傳感器不再局限于生物反應(yīng)的電化學(xué)過(guò)程，而是根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的 各種信息(如光效應(yīng)、熱效應(yīng)、場(chǎng)效應(yīng)和質(zhì)量變化等)了設(shè)計(jì)各種精密的探測(cè)裝置。 l 1974 K. Mosbach 熱生物傳感器 l 1974 Janata 酶場(chǎng)效應(yīng)晶體管 l 1980 D. W. Lubbers 和N. Optiz 酶光纖傳感器 l 1983 Giulbault 壓電晶體酶?jìng)鞲衅?l1

7、976 A. H. Clemens等報(bào)道了以葡萄糖酶電極為基礎(chǔ)的第一個(gè)人工腎臟，隨后被Miles公司開(kāi) 發(fā)成生命穩(wěn)定系統(tǒng)Biostator，用于重癥糖尿病人床邊監(jiān)護(hù)。 l 1983 B.Liedberg利用表面等離子激元共振(Surface Plasmon Resonance)方法，能 夠適時(shí)的對(duì)生物親和反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，在次基礎(chǔ)上，瑞典Pharmacia公司在1990年推出 商用儀器BIAcore，成為目前研究生物分子之間互相作用最優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)工具。 l 1984 A.E.G. Cass 首次建立了介體酶電極方法,利用化學(xué)介體戊二醛取代分子氧作 為氧化還原酶酶促反應(yīng)的電子受體,促成了1987年美國(guó)

8、MediSene 公司開(kāi)發(fā)成功印刷 酶電極. 發(fā)展迅速 文章方面: web of science 中輸入 “biosensor”共檢索到10035篇文章，約從1993- 2006年。 功能方面：活體( in vivo)測(cè)定、多指標(biāo)測(cè)定和 聯(lián)機(jī)在線(on line)測(cè)定。 檢測(cè)對(duì)象：各種常見(jiàn)的生物化學(xué)物質(zhì)，在臨床、 發(fā)酵、食品、化工和環(huán)保等方面均顯示了廣泛的應(yīng)用 前景。 1984 華盛頓召開(kāi)的國(guó)際生物工程年會(huì)上將生物傳感 器列為當(dāng)代生物工程的重要領(lǐng)域之一 1985 Elsevier科學(xué)出版公司創(chuàng)刊生物傳感器國(guó) 際學(xué)術(shù)期刊，1990 更名為生物傳感器和生物電子 學(xué)(Biosensors 2)凡是酶

9、可以催化的反應(yīng),微生物也可以催化; 3)催化速度接近,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模式近似. 微生物反應(yīng)的特殊性: 1)微生物細(xì)胞的膜系統(tǒng)為酶反應(yīng)提供了天然的適宜環(huán)境,細(xì)胞可以在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí) 間內(nèi)保持一定的催化活性; 2)在多底物反應(yīng)時(shí),微生物顯然比單純酶更適宜作催化劑; 3)細(xì)胞本身能提供酶促反應(yīng)所需要的各種輔助因子和能量; 4)微生物細(xì)胞比酶的來(lái)源更方便、更便宜. 微生物作為傳感器分子識(shí)別元件時(shí)不利因素： 1)微生物反應(yīng)通常伴隨細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)亡，不易建立分析標(biāo)準(zhǔn)； 2)細(xì)胞是多酶系統(tǒng)，許多代謝途徑并存，難以排除不必要的反應(yīng)； 3)環(huán)境變化會(huì)引起微生物生理狀態(tài)的復(fù)雜化,不適當(dāng)?shù)牟僮鲿?huì)導(dǎo)致代謝轉(zhuǎn)換現(xiàn)象, 出現(xiàn)不期

10、望有的反應(yīng). 2.3.2微生物反應(yīng)類型 1)同化與異化 (根據(jù)微生物代謝流向) 同化作用(assimilation)或組成代謝: 細(xì)胞將底物攝入并通 過(guò)一系列生化反映轉(zhuǎn)變成自身的組成物質(zhì),并儲(chǔ)存能量. 異化作用(disassimilation)或分解代謝:細(xì)胞將自身的組成 物質(zhì)分解以釋放能量或排出體外. 2)自養(yǎng)與異養(yǎng) (根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求) 自養(yǎng)(autotrophic):自養(yǎng)微生物的CO2作為主要碳源,無(wú)機(jī)氮化 物作為氮源,通過(guò)細(xì)菌的光合作用或化能合成作用獲得能量. 異樣(heterotrophic):異養(yǎng)微生物以有機(jī)物做碳源,無(wú)機(jī)物或 有機(jī)物作氮源,通過(guò)氧化有機(jī)物獲得能量. 絕大多數(shù)

11、微生物種類都屬于異養(yǎng)型. 3) 好氣性與厭氣性 (根據(jù)微生物反應(yīng)對(duì)氧的需求與否) 好氧(aerobic)性微生物:在有空氣的環(huán)境中才易生長(zhǎng)繁殖的 微生物. 厭氧(anaerobic)性微生物:必須在無(wú)分子氧的環(huán)境中生長(zhǎng)繁 殖的微生物. 4)細(xì)胞能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移 微生物反應(yīng)所產(chǎn)生的能量大部分轉(zhuǎn)移為高能化合物. 高能化合物是指含轉(zhuǎn)移勢(shì)高的基團(tuán)的化合物,其中以ATP最 為重要,它不僅潛能高,而且是生物體能量轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵物質(zhì),直 接參與各種代謝反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)移. 有兩類反應(yīng)可以產(chǎn)生ATP. 2.3.3分析微生物學(xué) 分析微生物學(xué)(analytical microbiology)是利用微生物 完成定量分析任務(wù)

12、的學(xué)科.有些情況下,微生物測(cè)定法比化學(xué) 方法更專一和靈敏,效率亦更高. 細(xì)胞增殖和呼吸法最常用. b 2.4 免疫學(xué)反應(yīng) 免疫指機(jī)體對(duì)病原生物感染的抵抗能力. 自然免疫是非特異性的,即能抵抗多種病原微生物的損害. 獲得性免疫是特異性的,在微生物等抗原物質(zhì)刺激后才形成( 免疫球蛋白等),并能與該抗原起特異性反應(yīng). 2.4.1抗原 1)抗原的定義:抗原(antigen)是能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng) 的物質(zhì),但從廣義的生物學(xué)觀點(diǎn)看,凡是具有引起免疫反應(yīng)性能 的物質(zhì),都可稱為抗原. 抗原有兩種性能: 刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng) 免疫原性(immunogenicity) 完全抗原(complete an

13、tigen,Ag) 與相應(yīng)免疫反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) 反應(yīng)原性(reactionogenicity) 半抗原(hapten) 2)抗原的種類 按抗原物質(zhì)的來(lái)源,抗原分為三類: (1) 天然抗原 (2) 人工抗原 (3) 合成抗原 3)抗原的理化性質(zhì) (1)物理性狀 分子質(zhì)量對(duì)免疫原性的影響: 分子質(zhì)量越大抗原性越強(qiáng),原因在于復(fù)雜的大分子物質(zhì)表面 抗原決定族較多,化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定,在體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng),降解和 排除速率較慢,有利于持續(xù)刺激肌體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生免疫應(yīng)答. 抗原構(gòu)型對(duì)免疫原性的影響:環(huán)壯構(gòu)型直線構(gòu)型 聚合態(tài)分子單體分子 (2)化學(xué)組成 絕大多數(shù)為蛋白質(zhì),可為純蛋白質(zhì),也可為結(jié)合蛋白質(zhì)

14、4)抗原決定簇(antigen determinant) 抗原決定簇是抗原分子表面的特殊化學(xué)基團(tuán)，抗原的特異性取決于抗 原決定簇的性質(zhì)、數(shù)目和空間排列。 .4.2抗體 抗體(antibody)是由抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的具有特異性免疫功能的球蛋白， 又稱免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)。人類免疫球蛋白有五類，即IgG、 IgM、IgA、IgD和IgE。 圖-免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)模式圖 重鏈(heavy chain,H鏈): 分子質(zhì)量較大,420- 460個(gè)氨基酸組成 輕鏈(light chain,L鏈): 分子質(zhì)量較小,213- 216個(gè)氨基酸組成 SS SS SS C 端 N端

15、 L鏈 H鏈 C區(qū) 抗原結(jié)合區(qū) V區(qū) 2.4.3抗原-抗體反應(yīng) 抗原抗體的相互作用是所有免疫化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ).它們之間的反應(yīng)是指 抗原與抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng).這種反應(yīng)可發(fā)生于體內(nèi)(in vivo),也 可發(fā)生在體外(in vitro).體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作 用;體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物質(zhì)性狀、抗體的類型及反應(yīng)的特點(diǎn)而分為凝聚 、沉淀、溶解反應(yīng)等不同的類型。 抗體與抗原的特異性結(jié)合點(diǎn)位于Fab L鏈及H鏈的高變區(qū)(抗體活性中心 ),其構(gòu)型取決于抗原決定簇的空間位置,兩者可形成互補(bǔ)性構(gòu)型. 抗原、抗體結(jié)合時(shí)準(zhǔn)確對(duì)位的兩個(gè)條件： 結(jié)合部位的形成要互補(bǔ)于抗原的形狀 抗體活性

16、中心帶有與抗原決定簇相反的電荷 抗體的特異性是相對(duì)的，表現(xiàn)在： 部分抗體不完全與抗原決定簇相對(duì)應(yīng) 即便是針對(duì)某一種半抗原的抗體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也可能不一樣 抗原抗體結(jié)合在一定pH或離子強(qiáng)度下也是可逆的。 基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)主要應(yīng)于以下幾個(gè)方面： 1)用已知抗原檢測(cè)未知抗體 2)用已知抗體檢測(cè)未知抗原 3)定性或定量檢測(cè)體內(nèi)各種大分子物質(zhì) 4)用已知抗體檢測(cè)某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì) 影響抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的因素 1)抗原抗體的性質(zhì):抗原-抗體反應(yīng)的整體強(qiáng)度受3個(gè)因素控制:抗體 對(duì)表位的內(nèi)在親和力,抗原抗體的結(jié)合價(jià)以及參與反應(yīng)成分的立 體結(jié)構(gòu). 2)電解質(zhì):抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后,由

17、親水性膠體變?yōu)槭杷阅z 體,電極質(zhì)的存在會(huì)使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而沉淀或凝集, 出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng). 3)酸堿度:蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì),抗原抗體的反應(yīng)必須在合適 的pH環(huán)境中進(jìn)行. 4)溫度:一般在37,高溫抗原抗體變性,低溫反應(yīng)太慢. 2.4.4免疫學(xué)分析 免疫分析是利用抗體與抗原的特異性結(jié)合作用來(lái)選擇性識(shí)別和 測(cè)定可以作為抗體或抗原的待測(cè)物.抗原-抗體反應(yīng)的特異性和 專一性決定了免疫反應(yīng)具有很高的選擇性. 1)沉淀法 可溶性抗體與其相應(yīng)的抗原在液相中相互接觸,可形成不溶性 抗原-抗體復(fù)合物而發(fā)生沉淀,包括擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和電泳試驗(yàn),此為 經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),靈敏度水平為g/ml. 2)放射免疫測(cè)定

18、法(radiation immunoassay, RIA) 利用放射性同位素示蹤技術(shù)和免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)的方法, 靈敏度高,特異性強(qiáng),準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好;同位素危害 3)免疫熒光測(cè)定法(immuno fluorescent assay) 高度的特異性和敏感性,可定位 serum carcinoembryonic antigen (CEA) 4)酶聯(lián)免疫測(cè)定法(enzyme linked immunoassay, ELISA) 用酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng). 靈敏度不高,但是特異性,重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性很好,成本低,穩(wěn)定性好和操作 安全等,應(yīng)用最廣. 酶免疫分析主要有兩種:夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法

19、. 夾心法要求抗原至少有兩個(gè)結(jié)合點(diǎn),不能用于檢測(cè)半抗原,多用于測(cè)定大 分子物質(zhì).產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合在固相上的抗原量成比例關(guān)系. E EE 固體抗原待檢抗原 酶標(biāo)記抗體 底物 酶促反應(yīng) 檢 測(cè) 夾心法測(cè)抗原示意圖 競(jìng)爭(zhēng)法產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體量成正 比例關(guān)系,與樣品中的抗原量成反比關(guān)系.主要用于測(cè)定小分子 抗原. E EE E + EE E 檢 測(cè) 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原示意圖 5)電化學(xué)免疫分析(electrochemistry immunoassay, ECIA) 電化學(xué)免疫分析是將免疫技術(shù)和電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的一種 標(biāo)記免疫分析方法. 用作電化學(xué)免疫分析的生物酶及反應(yīng)體系須滿足以下條

20、件 : 酶具有高或性,可在短時(shí)間內(nèi)將大量底物分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物; 產(chǎn)物具有電化學(xué)或性; 酶底物和酶在緩沖溶液中穩(wěn)定; 酶產(chǎn)物的副反應(yīng)很少; 容易與抗體或抗原結(jié)合,且不降低活性; 在測(cè)定條件下體系底物非活性. 2.5核酸與核酸反應(yīng) 2.5.1核酸組成與結(jié)構(gòu) 1)核酸的組成成分 核酸是所有生命體的遺傳信息分子,包括脫氧核糖核酸 (DNA, deoxyribonucleic acid)和核糖核酸(RNA, ribonucleic acid). 兩類核酸都是由單核苷酸(nucleotide)組成的多聚物.核 酸分子中的核苷序列組成密碼,其功能是儲(chǔ)存和傳輸遺傳信息 ,指導(dǎo)各類型蛋白質(zhì)的合成. 單核苷酸的組成

21、: 堿基,脫氧核糖或是核糖,磷酸基團(tuán) 腺嘌呤(adenine,A),鳥(niǎo)嘌呤(guanine,G) 胞嘧啶(cytosine,C), 胸腺嘧啶(thymine,T) DNA的堿基組成 Chargaff規(guī)則的內(nèi)容 . 所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C . DNA的堿基組成具有種的特異性， 即不同種的DNA堿基組成不一樣 . 對(duì)同一生物物種，DNA的堿基組成 沒(méi)有組織和器官的特異性 . DNA的堿基組成不隨年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況及 環(huán)境的改變而改變 Chargaff規(guī)則的意義 該規(guī)則為后來(lái)建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型奠定的基礎(chǔ)，并為 闡明DNA的生物學(xué)功能提供了重要依據(jù)。 2) DNA結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu)

22、: 脫氧核苷酸在長(zhǎng)鏈上的排列順序 二級(jí)結(jié)構(gòu): 雙螺旋鏈(堿基配對(duì)規(guī)則) 氫鍵(最主要的力) 維持雙螺旋鏈穩(wěn)定因素: 堿基堆積力(van der Waals) 分子內(nèi)部堿基對(duì)間的疏水鍵 Watson和Crick于1953年根據(jù)DNA晶體的X-射線衍射 圖譜和Chargaff規(guī)則等數(shù)據(jù)提出雙螺旋結(jié)構(gòu)。 一級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu): B型 A型 C型 Z型:左旋 不同構(gòu)象只是螺距、直徑、 每圈含堿基數(shù)目不同 3) RNA 結(jié)構(gòu) RNA在細(xì)胞中主要以單鏈形式存在,可暫時(shí)形成雙螺旋,或自折疊 成雙螺旋區(qū)域. 尿嘧啶(uracil,U) 2.5.2 DNA變性(denature) 核酸的紫外吸收特性 DNA在26

23、0nm處有最大的紫外吸收值 因嘌呤堿和嘧啶堿對(duì)250280nm的光波有強(qiáng)的吸收作用，對(duì)260nm光波的 吸收能力最大。 當(dāng)核苷酸摩爾數(shù)相同時(shí)，A260的大小有如下關(guān)系：?jiǎn)魏塑账?單鏈DNA 雙鏈DNA 從左到右稱為減色效應(yīng)(hypochromism), 從右到左稱為增色效應(yīng) (hyperchromic effect)。 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)比雙螺旋松馳結(jié)構(gòu)對(duì)紫外(260nm)的吸收要小，最大可 降低約34%。因?yàn)镈NA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的堿基對(duì)彼此之間又形成了堿基堆積力， 影響了堿基對(duì)260nm光的吸收。當(dāng)DNA雙螺旋松散后，所得的光吸收值幾乎是 其組成中所有堿基光吸收值的總和。 DNA的紫外吸收特性

24、的應(yīng)用 估計(jì)核酸樣品的純度 一般：A260/A2801.82.0，DNA純度符合要求 A260/A2802.0,提示DNA樣品中含有RNA 實(shí)質(zhì) 破壞了核酸的空間結(jié)構(gòu)，但不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)(共價(jià)鍵）的斷裂。 引起變性的因素 加熱（熱變性）、介質(zhì)中的pH過(guò)低或過(guò)高、加入有機(jī)溶劑、加入尿素等 介質(zhì)中的pH過(guò)酸或過(guò)堿對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的影響：過(guò)量酸使A、G、C上 的氮原子質(zhì)子化，不利于氫鍵形成；過(guò)量堿使G、T上的氮原子去質(zhì)子化， 亦不利于氫鍵形成。 高溫時(shí)DNA雙鏈會(huì)分離,稱為解鏈(melting).當(dāng)溫度返回常溫時(shí),DNA或 RNA能夠重新回到天然結(jié)構(gòu),稱為復(fù)性(annealing).當(dāng)光吸收強(qiáng)度增加

25、到最大 值的一半時(shí),所對(duì)應(yīng)的溫度稱為解鏈溫度(melting temperature), Tm. 2.5.3核酸分子雜交 定義 應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA （或RNA）片斷按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子，這一過(guò)程 稱為核酸的分子雜交。 雜交的兩條鏈 一條是待測(cè)的單鏈的核酸分子，如克隆的基因片斷、PCR產(chǎn) 物、基因組DNA或細(xì)胞總RNA等。 另一條可以是探針 核酸探針是指特定的已知堿基序列的核酸片斷，可以是DNA 、cDNA、mRNA及RNA等。在現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，探針 的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術(shù)手段。 意義 核酸雜交是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技

26、術(shù)在分 子生物學(xué)研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，如用于基因組中特定基因序 列的定性和定量檢測(cè)、基因突變分析以及某些遺傳性疾?。ㄈ?地中海貧血、血友病、苯丙酮酸尿癥等）的診斷。 2.5.4核酸功能 一、 DNA功能:DNA是遺傳信息的載體,其所攜帶的信息不僅是 安全可靠的,還可以讀取和利用,并代代穩(wěn)定相傳.DNA通過(guò)三個(gè) 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)上述功能: 自我復(fù)制(self application)、自我修復(fù)(sefl- repair)和轉(zhuǎn)錄(transcription) 成mRNA并隨后被翻譯(translation)成 蛋白質(zhì)。 DNA 自我復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞分裂之前,分三個(gè)步驟: 1)在螺旋酶(helicase)的作

27、用下,一部分雙鏈被打開(kāi); 2) DNA聚合酶與DNA的一條鏈結(jié)合,并沿3端到5端移動(dòng),利用 該鏈為模板,合成一段核酸引鏈(leading strand),該鏈重新形成雙 螺旋鏈. 3)由于DNA合成只能按5端至3端方向進(jìn)行,另一個(gè)DNA聚合酶 也同時(shí)與另一條單鏈結(jié)合并進(jìn)行DNA片段的合成,并有連接酶 將這些片段連接起來(lái),形成滯后鏈(lagging strand). 上面的過(guò)程形成兩個(gè)完全一樣的DNA分子，稱為復(fù)制 (replication).復(fù)制的DNA分子被均等的分配到兩個(gè)子細(xì)胞，使 它們具有完全相同的遺傳學(xué)信息。 DNA分子的每一條鏈都是 一個(gè)模板，所合成的鏈稱為互補(bǔ)(complement

28、ary)鏈。 如果復(fù)制過(guò)程中發(fā)生堿基錯(cuò)配(mismatch)，將發(fā)生基因點(diǎn)突變 。細(xì)胞主要有兩道防線防止突變的發(fā)生，一個(gè)是DNA聚合酶的 校正(proof reading)功能，當(dāng)發(fā)生一個(gè)堿基錯(cuò)配后， DNA聚合 酶的一個(gè)亞基將識(shí)別并將以切除，以重新進(jìn)行正確合成；另一 個(gè)是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，有多種模式。它們?cè)贒NA復(fù)制完成 以后，能夠?qū)NA繼續(xù)進(jìn)行檢查，識(shí)別出錯(cuò)配堿基，并將之切 除修復(fù)。這樣就保證了生物遺傳的穩(wěn)定性。 轉(zhuǎn)錄過(guò)程是將DNA所攜帶的遺傳信息拷貝到短壽命的信使RNA (mRNA)上。步驟如下： 1)DNA被轉(zhuǎn)錄部分解螺旋,RNA聚合酶與一條DNA的一條單鏈 結(jié)合,該結(jié)合部位稱為啟

29、動(dòng)子區(qū)域(promoter region). 2)RNA聚合酶以所結(jié)合的DNA鏈為模板,合成延伸一段序列互補(bǔ) 的RNA鏈. 3)完全合成的RNA脫離RNA聚合酶/ DNA復(fù)合物,并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì) 開(kāi)始參與翻譯. 2) RNA功能 RNA有信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體 RNA(rRNA)三類，以及新近發(fā)現(xiàn)的小分子核內(nèi)RNA(snRNA).分 別有自己的功能。 n mRNA將DNA所含有的信息轉(zhuǎn)錄下來(lái)并來(lái)到蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器(核 糖體),在此它將直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成. n rRNA是蛋白質(zhì)合成機(jī)器核糖體結(jié)構(gòu)的一部分.真核生物含有4 種rRNA,在蛋白質(zhì)合成中有幾種作用:28s r

30、RNA具有催化作用,它 構(gòu)成核糖體60s亞基胎基轉(zhuǎn)移酶活性; 18s rRNA通過(guò)識(shí)別作用,校 正mRNA和肽基化rRNA的位置; rRNA的三維空間結(jié)構(gòu)形成裝配 整個(gè)核糖體的骨架. n tRNA直接將mRNA所轉(zhuǎn)錄的DNA信息解碼成蛋白質(zhì)的氨基酸 序列. 2.6催化抗體( catalytic antibody) 催化抗體也稱抗體酶(abzymes),是抗體(antibody)和酶(enzyme)的復(fù) 合詞,是具有催化活性的單克隆抗體.它通常是人工合成物,但也存在于正常人 體內(nèi)和病患者體內(nèi). 2.7催化性核酸 2.7.1 催化性RNA 類型與結(jié)構(gòu) 催化性RNA具有較 弱的裂解和連接酶 活性,其

31、催化具有 RNA序列選擇性 順式剪切(cis-cleaving) 反式剪切(trans-cleaving). 超二級(jí)結(jié)構(gòu)(motif) 錘頭RNA(hammerhead RNA) 發(fā)夾RNA(hairpin RNA) 組I內(nèi)含子(group I intron) 組II內(nèi)含子(group II intron) RNA酶P中的RNA組分 肝炎-RNA 都能切斷磷酸二酯鍵 2.7.2催化性DNA(catalytic DNA) 催化性RNA的主要缺點(diǎn)是比較脆弱,容易受核酸酶的攻擊而 水解.如在雙螺旋形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)域和催化域的某些特殊部位 用DNA取代后能改善生物學(xué)穩(wěn)定性. 為了獲得能夠剪切RNA的DN

32、A序列,一般用體外篩選方法. 無(wú)天然存在的催化性DNA,人工合成的催化性DNA是潛在的生 物傳感器的分子識(shí)別元件. 2.8生物學(xué)反應(yīng)中的物理量變化 1)生物反應(yīng)的熱力學(xué)：自發(fā)反應(yīng)總伴隨著自由能(free energy)的降低,生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程都伴隨熱力學(xué)變化:分子相轉(zhuǎn)換 、分子間相互作用、酶催化反應(yīng)、微生物細(xì)胞反應(yīng)。 2)生物發(fā)光(bioluminescence):是由于某些生物體內(nèi)一些特殊 物質(zhì)(如熒光素)的氧化而產(chǎn)生的現(xiàn)象. 3)顏色反應(yīng)和光吸收:生物反應(yīng)中的顏色變化包括生物體內(nèi)產(chǎn) 生色素和生物體或酶與底物作用后產(chǎn)生顏色物質(zhì)兩個(gè)方面. 4)阻抗變化:微生物反應(yīng)可使培養(yǎng)基中的電惰性物質(zhì)代謝為電活 性產(chǎn)物.當(dāng)微生物生長(zhǎng)和代謝旺盛時(shí),培養(yǎng)基中生成的電活性分 子和離子增多,使培養(yǎng)液的導(dǎo)電性增大,阻抗降低;反之,則阻抗升 高.