《5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段（26頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、1 1.DNA.DNA的基本單位的基本單位五碳糖五碳糖磷酸基團(tuán)磷酸基團(tuán)羥基羥基3，端端5，端端ATGCATGC5，端（含磷酸基團(tuán)）端（含磷酸基團(tuán)）3，端（含羥基）端（含羥基）3，端端5，端端2.2.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈的形成3.DNA3.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)4.4.復(fù)制過程復(fù)制過程參與的組分參與的組分在在DNADNA復(fù)制中的作用復(fù)制中的作用解旋酶解旋酶打開打開DNA雙鏈雙鏈DNA母鏈母鏈提供提供DNA復(fù)制的模板復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNA聚合酶聚合酶引物引物使使DNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸

2、端開始連接脫氧核苷酸催化合成催化合成DNA子鏈子鏈DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 DNA DNA聚合酶不能從頭開始合聚合酶不能從頭開始合成成DNADNA，而只能從，而只能從3 3端延伸端延伸DNADNA鏈。鏈。因此，因此，DNADNA復(fù)制需要引物。復(fù)制需要引物。小資料：小資料：引物是一小段引物是一小段DNA或或RNA，它能與，它能與DNA母鏈母鏈的一段堿基序列互補配對。用于的一段堿基序列互補配對。用于PCR的引物長度通常為的引物長度通常為2030個核苷酸。個核苷酸。3553因此，因此，DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的5，端向端向3，端延伸。端延伸。4.4.復(fù)制過程復(fù)制過

3、程 是一種體外迅速擴增是一種體外迅速擴增DNADNA片段的技術(shù)，片段的技術(shù)，它能以極少量的它能以極少量的DNADNA為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的制出上百萬份的DNADNA拷貝?？截?。遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和物學(xué)、基因克隆和DNADNA序列測定。序列測定。解旋酶（解旋酶（打開打開DNA雙鏈）雙鏈）DNADNA母鏈（母鏈（模板）模板）4 4種脫氧核苷酸（種脫氧核苷酸（合成子鏈原料）合成子鏈原料）DNADNA聚合酶（聚合酶（催化子鏈合成）催化子鏈合成）引物引物（RNA）（）（使使DNA聚合酶能聚合酶能從引物從引物3端開始連

4、接脫氧核苷酸）端開始連接脫氧核苷酸）自主閱讀自主閱讀P59，并，并思考：思考：體外擴增體外擴增DNADNA，需要怎樣環(huán)境？，需要怎樣環(huán)境？變性變性（80-100）TaqTaq聚合酶（耐高溫）聚合酶（耐高溫）20203030個核苷酸構(gòu)個核苷酸構(gòu)成成DNADNADNADNA母鏈母鏈4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸緩沖溶液，控制溫度緩沖溶液，控制溫度 DNA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱80-100）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：變性的目的：復(fù)性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈解開雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合有利于引物與兩條單鏈結(jié)合 在在80100 的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)，DNAD

5、NA的雙螺旋的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性變性PCRPCR技技術(shù)總術(shù)總結(jié)結(jié) 利用利用DNA分子的熱變性原理，通過控制分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴增。分子的擴增。四種脫氧核苷酸、耐熱四種脫氧核苷酸、耐熱的的DNADNA聚合酶、聚合酶、引物、引物、DNA DNA模板模板、緩沖溶液和控制溫度的溫緩沖溶液和控制溫度的溫控設(shè)備?？卦O(shè)備。子鏈的子鏈的5端向端向 3端延伸端延伸5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物變性變性95oC復(fù)性復(fù)性55oC延伸延伸72

6、oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次復(fù)制第二次復(fù)制第一次復(fù)制第一次復(fù)制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每次循環(huán)分為：每次循環(huán)分為：PCRPCR的反應(yīng)過程總結(jié)的反應(yīng)過程總結(jié)變性變性 復(fù)性復(fù)性延伸延伸PCR的反應(yīng)結(jié)果的反應(yīng)結(jié)果（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準(zhǔn)備準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液移液）（3）蓋嚴(yán)蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊輕輕彈擊管壁（管壁（混合混合）（4）將微量離心管放在離心機）

7、將微量離心管放在離心機上上離心約離心約10s（離心離心）（5）將離心管放入）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（儀的循環(huán)程序（反應(yīng)反應(yīng)）三、三、結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固1、關(guān)于、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯誤的一項是技術(shù)的應(yīng)用，錯誤的一項是A 古生物學(xué)、刑偵破案、古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定序列測定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案序列測定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向

8、的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是技術(shù)最突出的優(yōu)點是A 原理簡單原理簡單 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐熱性聚合酶有耐熱性D 快速、高效、靈活、易于操作快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸4、做、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是是A 反復(fù)洗滌反復(fù)洗滌 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高壓滅菌高壓滅菌 D 在在20 儲存儲存體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制與復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制體內(nèi)復(fù)制P

9、CRPCR技術(shù)技術(shù)解旋解旋在解旋酶作用下，細(xì)在解旋酶作用下，細(xì)胞提供胞提供ATPATP，部分解開，部分解開加熱到加熱到9494o oC,C,雙鏈全雙鏈全部解開，不需解旋酶部解開，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶細(xì)胞自身的細(xì)胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高溫）（不耐高溫）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶復(fù)制特點復(fù)制特點半保留復(fù)制，邊解旋半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點復(fù)制。邊復(fù)制，多起點復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向復(fù)制的方向 子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端端延伸延伸子鏈的子鏈的55端向端向 3 3端延伸端延伸課堂小結(jié)課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段片段PCR原理原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程過程變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸操作步驟操作步驟配制配制PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系移入離心管移入離心管放入放入PCR設(shè)置工作參數(shù)設(shè)置工作參數(shù)DNA擴增擴增測定含量測定含量稀釋稀釋調(diào)零調(diào)零測定并讀數(shù)測定并讀數(shù)計算計算