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1、型糖尿病自身抗體檢測,,糖尿病的分型診斷的進展,1979年WHO提出了原發(fā)性臨床糖尿病分為胰島素依賴型和非胰島素依賴型，依賴型與非依賴型的區(qū)別主要依據(jù)胰島素細胞功能受損的程度，臨床上是否依賴胰島素而言，并不反映其發(fā)病本質 1997年WHO建議取消依賴型與非依賴型，改為1、2型。 1、2型的區(qū)別要看病因是否由胰島細胞自身免疫破壞造成，1型與2型是完全不同的兩類疾病，但2型非依賴型可發(fā)展成1型胰島素依賴型，成人緩慢進展型就經歷了這個過程。,WHO （1997年）建議的糖尿病分型方案,1型糖尿?。═1DM） 胰島細胞破壞導致胰島素絕對缺乏：A.免疫型；B.特發(fā)型 2型糖尿病（T2DM） 胰島素抵抗為

2、主體的胰島素相對缺乏，或胰島素分泌受損為主體的胰島素抵抗 其他特殊類型糖尿病 妊娠期糖尿病,1型糖尿病的流行病學,主要見于15歲以前的兒童和未成年人； 亞洲及我國發(fā)病率相對較低（我國兒童中的發(fā)病率為0.59/10萬每年，全國T1DM的總數(shù)至少200-400萬） 各國的1型糖尿病較以前有逐年增加趨勢； 不少地區(qū)的1型糖尿病的發(fā)病率與季節(jié)有關,1型糖尿病的發(fā)病機制,遺傳易感性 環(huán)境因素 感染、飲食、地理、氣候 細胞自身免疫損傷 細胞破壞、功能損害 胰島素分泌缺乏,,,,,1型糖尿病的病程,,,,,,,,,,細胞量,1型糖尿病的病程,遺傳易感性,環(huán)境因素

3、 胰島素正常 自身抗體陽性 血糖正常,胰島素 血糖正常 應激血糖,胰島素 血糖,80% 細胞破壞 胰島素缺乏 臨床糖尿病,1型糖尿病和2型糖尿病的比較,1型糖尿病和2型糖尿病的區(qū)分,一般<30歲，起病急，中到重度癥狀 明顯體重下降，消瘦，尿酮或DKA 空腹或餐后C肽低下 免疫標記物(GADA,ICA,IA-2) 是 否 T1DM T2DM,,,,,免疫介導型1型糖尿病亞型的特征,抗胰島細胞抗體(ICA),1974年Bottazzo采用間接免疫熒光法在胰島素依賴性糖尿病患者血清中首次檢測到抗胰島細胞抗體（isl

4、et cell autoantibodies, ICA）。 ICA是針對胰島細胞內多種抗原的一組抗體,其靶抗原至今尚未完全闡明。,,與糖尿病相關的自身抗原不僅在細胞表達，這些抗原的組織分布可分為： (1) 細胞特異的，如胰島素； (2)胰島細胞特異的； (3)神經內分泌特異的，如分子量為65 kD的谷氨酸脫羧酶（GAD65kD）、ICA512、神經節(jié)苷脂（ganglioside）、腦硫脂（sulfatides）等； (4)較廣泛的分布，如HSP62等。 目前所知的ICA主要抗原的是谷氨酸脫羧酶（GAD）和酪氨酸磷酸酶（IA2）,檢測方法： 間接免疫熒光法 組織化學染色法 免

5、疫沉淀化學法 ELISA法,,,目前ICA的檢測方法主要是以猴胰腺為基質的間接免疫熒光法，但易受組織的固定方法的影響。 抗胰島細胞抗體與胰腺的內分泌部位反應，可見所有胰島細胞胞漿呈現(xiàn)均質到顆粒型熒光。,檢測方法的標化： 1983年瑞典的Ludvigsson為一名1型糖尿病新發(fā)病者做了血漿置換,這份血漿在青少年糖尿病基金會(FDA)組織的ICAs定標實驗中,在參加這項工作的所有實驗室檢測時均為ICAs陽性,于是用這份血樣定出了ICAs的JDF單位,并逐漸成為國際上較為通用的單位。,,敏感度81 %(44 %100 %) ，特異度96 %(64 %100 %) 特異度較GADA和IA2A差

6、 ICA可作為早期預測指標能早于T1DM發(fā)病8年前被檢測出 高滴度的ICA（大于20-40JDF單位）預示疾病進展的高危險性。 大部分T1DM病人的ICAs在發(fā)病2年后消失，ICA持續(xù)陽性超過23年者，僅占T1DM的10%。 ICA滴度的持續(xù)高水平通常與細胞的損傷有關，ICA的水平與C肽水平呈負相關。 ICA和其他胰島自身抗體（如GAD或IAA）同時陽性對疾病更有診斷價值，這類病人發(fā)生T1DM的危險性是僅ICA陽性的病人的3-5倍。,,ICA在不同人群中的陽性率,ICA的檢測對1型糖尿病有很好的預測價值,谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab),谷氨酸脫羧酶 氨基丁酸（GABA）的合成酶 表達于人腦及

7、胰島中均有，主要位于細胞漿中 具有抑制生長抑素和胰高糖素分泌的作用，并可調節(jié)胰島素的分泌和胰島素原的合成,1990年，Beakkeskov首次證明GAD是1型糖尿病的自身抗原 GAD分子存在65kD和67kD兩種形式，兩者在氨基酸水平上有65%的同源性和80%的相似性，免疫源性也基本相同，目前認為T1DM中抗GAD65抗體更常見,,檢測方法： 免疫沉淀酶活性法 放射免疫法 ELISA法 間接免疫熒光法 化學發(fā)光法,,,最常用的GAD-Ab的檢測方法是ELISA法和放免法。 放免法由于存在放射性污染目前已逐漸被ELISA法替代 ELISA法采用親和素和生物素擴大級聯(lián)反應增強了檢測的敏感

8、性,,,,,,,,,,,,,,,,,,GAD檢測方法的評價,GAD 自身抗體:41 個實驗室測定了血清GADab ,其中多數(shù)運用重組人GAD 的RIA法,其調整敏感性是091 %(平均81 %) 。ELISA 法與RIAs 法比較,有較好效果,其調整敏感性77 % ,雙管測定的陽性或陰性一致性為100 %。 在125例血清RIA法的陽性率為22.4%， ELISA的陽性率為26.4%， 兩者的顯著相關（P=0.025)。均 與ICA顯著相關P值分別為0和0.01。 說明ELISA法可以替代RIA法做為1型糖尿病自身抗體篩選的有效手段。 （RIA試劑歐蒙公司 ； ELISA試劑美國BLOMER

9、ICA 公司）,GAD在T1DM發(fā)病機理中的作用,分子模擬(molecular mimicry) 機制致病學說： 病毒蛋白如柯薩奇B 病毒p2C 蛋白肽段, 胰島細胞抗原分子谷氨酸脫羧酶(GAD) 的部分肽段序列相似,前者(外源性蛋白多肽) 在誘導機體產生免疫的同時,亦可能誘發(fā)針對自身胰島細胞的攻擊，導致細胞的損傷。,GAD-Ab具有與細胞緩慢損傷相關性好、出現(xiàn)早、持續(xù)時間長、年齡跨度大、陽性率高、檢測易標準化等特點，是目前公認的診斷LADA及預測胰島功能的免疫學指標 GAD-Ab可于發(fā)病前10年測出，且在此期間呈高低度持續(xù)存在，約80%新發(fā)患者血清中GAD陽性且水平較穩(wěn)定，病程10年以上仍

10、存在高滴度GAD抗體 。,GAD的臨床應用,GAD抗體在大多數(shù)T1DM患者中陽性，且陽性率不隨病程延長而下降。 實驗顯示新診斷的患兒中GAD抗體陽性率為74%，長病程者為67%，而他們的ICA陽性率分別為64%和14%。 如在初發(fā)T1DM患者中查到GAD抗體有助于排除T2DM，以助于DM診斷分型并指導治療。 在T1DM一級親屬（高危人群）， 33.3% 的GADA陽性者可能患TIDM。 TIDM一級親屬中GAD抗體陽性率為15%左右，其中1/3在618個月后發(fā)展為T1DM。 GADA在僵人綜合征（SMS）中的陽性率為100%, 此外還見于與T1DM相關的多腺體自身免疫綜合征。,GAD在不同人群

11、中的陽性率,,抗酪氨酸磷酸酶抗體(ICA 512/IA 2ab),ICA 512/IA 2是利用1型糖尿病患者或其前期病人的血清免疫篩選胰島細胞的cDNA文庫得到的一個新的細胞自身抗原。 其氨基酸序列與T淋巴細胞蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)CD45相似，而堿基序列與人胰島素瘤克隆的 cDNA (IA2)相近。Northern印跡示ICA 512/IA 2在胰島、腦和垂體中均有表達。 Rabin等發(fā)現(xiàn)ICA512實際上是ICA的一個片段。,IA2A存在于大約65%（55%-75%）的新發(fā)T1DM病人中，而正常對照人群中陽性率小于1%。 IA-2Ab 特異性強,在不伴1型DM的自身免疫病患者中較少發(fā)

12、現(xiàn)。 T1DM患者中IA2A陽性率可能受多種因素影響，15歲以上T1DM者IA2A陽性率最高，隨增齡陽性率逐漸下降，但其發(fā)生率與DGA抗體無關。 攜帶IA-2抗體的個體在5歲時患型糖尿病的風險是34歲時的11倍。,檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附分析法( ELISA) 放射配體分析法(RLA) 35S標記的放射免疫沉淀法,,抗胰島素自身抗體(IAA),IAA的識別的抗原表位是胰島素A鏈的A8-A13殘基和B鏈的B1-B3殘基 IAA與逆轉錄病毒的p73蛋白間存在交叉反應，提示內源性的逆轉錄病毒感染與T1DM的發(fā)生有關 IAA與胰島素治療誘導的抗胰島素抗體相似,IAA在新診斷的T1DM患者中的陽性率為4

13、0%，多見于兒童（4歲），在成人中的陽性率僅為4%，在5歲以前發(fā)生的IAA陽性率達50%，IAA滴度隨增齡而降 IAA與ICA相關，在高危人群中約40%ICA陽性者IAA陽性。 IAA水平與T1DM發(fā)生的速度呈相關性，高滴度IAA者發(fā)病較快,,檢測方法 放免法；ELISA法 不同實驗室及不同方法測定IAAs,結果的一致性顯著低于IA2A和GADAs。,,自身抗體對T1DM的診斷 敏感性和特異性,,T1DM患者中胰島自身抗體的陽性率常因種族、發(fā)病年齡、病程和臨床亞型不同而不同。單一的自身抗體的檢測缺乏最佳的敏感性和特異性，目前常采用多項自身抗體的聯(lián)合檢測，對T1DM的診斷準確性更高 IA2A

14、b 聯(lián)合GADAb 及IAA 兩種以上抗體陽性具有68 %的陽性預測價值, 80 %敏感性和100 %特異性。,預測率最高的組合是ICA加IA-2A和（或）IA-2抗體。另一項研究發(fā)現(xiàn)采用兩步篩查法，即先篩查IA-2A和（或）GAD抗體，然后篩查IAA和（或）ICA，對糖尿病的預測敏感度最高 。 另有人認為ICA的檢測缺乏穩(wěn)定性，通常所用的間接免疫熒光法僅能做到半定量，而推薦使用IA22Ab 聯(lián)合GAD2Ab 及IAA的篩選組合。 近來,國外還建立了一種GAD-Ab 和IA2-Ab 一步性聯(lián)合檢測法。其結果與GAD-Ab、IA2-Ab 分別檢測結果高度一致。此法簡單高效、成本低、重復性好,并可

15、用毛細血管血作為標本,適于在一般人群特別是少兒中進行普查。,,,胰島細胞 自身抗體的組合 預測型糖尿病,跟蹤的年數(shù),糖尿病的發(fā)病率,Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies (GAD, ICA512, Insulin),Percent not Diabetic,Years of Follow-up,3 Ab n = 41 17 8 1 2 Abs n = 44 27 15 4 2 1 1 Abs n = 93 23 14 10 6 4,Verge et al. Diabetes, 199

16、6;45;926,Gestational Diabetes: Risk at 2 years Type 1 Diabetes by AutoantibodiesICA, GAD65, ICA512(IA-2),Sensitivity GAD=63%; Sensitivity 3 Abs=82% Ziegler et al. Diabetes 1997: 46:1459-67, N=437,Progression,Insulin GAD IA-2,,A. Ziegler,First antibody is insulin/proinsulin,,10,,8,,6,,4,,2,,0,,8,,6,,4,,2,,0,,,,,,,IAA,,,,10,,8,,6,,4,,2,,0,,8,,6,,4,,2,,0,,,,,,,,Age (years),Cumulative frequency (%),A. Ziegler,,