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1、實驗八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,賈躍騰 羅世翔,實驗八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,賈躍騰 羅世翔,一、 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 實驗操作及注意事項 （P138）,實驗分組（每人做一管，每組配一份膠） 認清試劑（試劑和吸管對號、量器的使用） 封管 分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學(xué)聚合，A1C2H2G5，每組總體積為10ml，灌膠高度為7-8cm） 封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出現(xiàn)折光線時可進行下一步操作）,,,,,1.1 分離膠的配制,注意事項： 1、封管要嚴，防止漏液。 2、固定玻璃管要豎直，防止夾碎。 3、每組配一份膠，試劑與移液管對號，準確加量。 4、配膠后立即灌膠（

2、用滴管灌膠，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁緩緩加入,,,,濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，B1D2E1F4，每組總體積為8ml） 倒掉正丁醇 灌濃縮膠（灌膠高度為1.5cm,上面留1cm空隙加樣） 封正丁醇3mm（觀察界面，10分鐘左右出現(xiàn)折光線時可倒去正丁醇）,,,1.2 濃縮膠的配制,,,注意事項： 1、倒掉正丁醇，用濾紙吸干再灌濃縮膠。 2、配膠后立即灌膠（用滴管） 3、灌膠后立即清洗滴管，防止膠凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用膠塞將玻璃管固定于電泳槽上（豎直，防漏） 5、加電極緩沖液（注意液面）,安裝電泳槽（結(jié)構(gòu)、原理、電流及電極的方向、不漏水、除氣泡）加buffer（沒過上下管口）

3、樣品處理并加樣（20ul）電泳（6mA/管，距底1cm時停止）剝膠 固定（時間5min）染色（時間2min）漂洗脫色至背景透亮,1.3 安裝、加樣、電泳,二、電泳基本原理及相關(guān)知識,2.1 電泳的概念,帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象。 廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定.,2.2 電泳的基本原理,利用物質(zhì)的兩個差異來分離物質(zhì),1.電荷差異 (1)電荷性質(zhì) (2)電荷數(shù)量,2.分子差異 (1)分子大小 (2)分子形狀,2.3 電泳分離蛋白質(zhì)的原理,蛋白質(zhì)兩性解離與等電點 若向蛋白質(zhì)溶液中加入適量的酸或堿，使羧基和氨基的解離

4、度相同，此時溶液的 pH 值稱為該蛋白質(zhì)的等電點（PI）。 2. 溶液pH與蛋白質(zhì)等電點決定蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)與數(shù)量 3. 不同蛋白質(zhì)分子大小和分子形狀的差異,2.4 實驗室中常用到的電泳方法 （以介質(zhì)分類）,1. 紙電泳：是最早使用的一種電泳技術(shù)，濾紙為支持物 2. 醋酸纖維膜電泳：醋酸纖維膜為其支持物 3. 凝膠電泳 （1）瓊脂糖凝膠電泳 （2）聚丙烯酰胺凝膠電泳,三、聚丙烯酰胺凝膠電泳,3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。 1、聚丙烯酰胺凝

5、膠由單體丙烯酰胺和甲基雙丙烯酰胺聚合而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合過程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。 (1)在化學(xué)聚合過程中，以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑, TEMED催化AP產(chǎn)生自由基； (2)在光聚合過程中，以核黃素為催化劑，光催化核黃素產(chǎn)生自由基。自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲基鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,3.2 聚丙烯酰胺凝膠的特性 (1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶； (3)對pH和溫度變化較穩(wěn)

6、定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好； (5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g (6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑； (7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類 1. 根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為： （1）連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng) （2）不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝

7、膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 2. 根據(jù)蛋白質(zhì)樣品變性與否，分為： （1）變性電泳也就是SDS-PAGE，蛋白質(zhì)失去二三級結(jié)構(gòu)； （2）非變性電泳 蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。 3.根據(jù)電泳槽體系的類型，分為： （1）圓盤電泳 （2）板狀電泳 兩者電泳原理完全相同。,四、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）,SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapiro于1967年建立

8、，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素），其原理在于： 1.去電荷：由于SDS（十二烷基硫酸鈉）產(chǎn)生的十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別； 2.破壞結(jié)構(gòu)：SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶； 3.統(tǒng)一構(gòu)象：SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物形成近

9、似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為18A； 這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。,SDS-PAGE的原理,四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳,4.1 不連續(xù)PAGE的原理,,三個不連續(xù) 三個效應(yīng),凝膠孔徑不同 緩沖液pH不同 緩沖液離子成分不同,,濃縮效應(yīng) 電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng),4.2 不連續(xù)體系的組份 不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。 1. 濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。 2. 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝

10、膠緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。 3. 電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。 2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。,4.3 樣品濃縮效應(yīng) 1.凝膠孔徑不連續(xù)性； 2.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性； 在pH6.7的凝膠緩沖體系中 前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度) 當(dāng)進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解

11、離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； 3.電位梯度的不連續(xù)性。,,,,,Gly -,Pro -,Cl-,Gly -,Pro -,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro -,Pro -,Pro -,Gly -,Gly -,Gly -,,,,,,,pH為8.3的電泳緩沖液（Tris-Gly）,pH為6.7的濃縮膠,pH為8.9的分離膠,有效泳動率： MCl- M Pro- M Gly-,6%膠,3%膠,,,有效泳動率： MCl- M Gly- M Pro-,五、實驗結(jié)果的分析,5.1 相關(guān)理論,,,表-1 血清中各蛋白質(zhì)的相關(guān)特性,種 類,分子量(萬）,PI,分 布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,6.9,5.0,9.0,13.0,11.0,6.1,7.3,6.8,7.6,8.0,55,2.130.8,4.172.5,1.225,15.6,,,,,,,,前清蛋白,清蛋白,2-球蛋白 1-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,5.2 結(jié)果示意圖,謝謝！,