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1、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 一、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳實(shí)驗(yàn)，初步掌握聚焦電泳的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù),2、基本原理 2.1蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì).在不同的pH環(huán)境中所帶的正負(fù)電荷不同。若在某特定的pH環(huán)境中其凈電荷為零,此時(shí)的pH為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在電場(chǎng)下不泳動(dòng)。,2.2.等電聚焦 在常規(guī)電泳中,通常只是在恒定的緩沖液中進(jìn)行分離，假定有A, B兩個(gè)蛋白質(zhì)組分，分別帶有凈電荷-3和+1。在一個(gè)pH9的緩沖洗脫中,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)均放在靠陰極一側(cè)電泳,此時(shí)帶負(fù)電荷多的A蛋白質(zhì)受陽(yáng)極影響大,泳動(dòng)速度比B快,最終會(huì)超過B，這樣二者就會(huì)得到分離。 在等電聚焦電

2、泳中，分離是在連續(xù)的pH梯度中進(jìn)行的。如果把A,B二者的混合物放在一個(gè)pH3.5-10的pH梯度中的pH6的位置，則A蛋白質(zhì)的凈電荷為-2,減少兩個(gè)凈電荷；B蛋白質(zhì)的凈電荷為+2，多了兩個(gè)凈電荷。在相同的電場(chǎng)下,A移向陽(yáng)極,B移向陰極，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，這種行為稱為聚焦反應(yīng)。,蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點(diǎn)，這是一個(gè)”穩(wěn)態(tài)”過程,一旦達(dá)到等電點(diǎn)的位置，蛋白質(zhì)就會(huì)停止遷移。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的pH制約，即若向負(fù)極擴(kuò)散帶負(fù)電,會(huì)受到陽(yáng)極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位;若向正極擴(kuò)散帶正負(fù)電,會(huì)受到陰極的影響，迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此

3、，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。,2.3.兩性電解質(zhì) (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的, pH范圍2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.,(2) Servalyte(德國(guó)Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺與乙烯基亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中,再引入磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)合成的. pH范圍:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.,(3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia) 七氨基多羧基組成的 pH范圍: 2.5-5, 4-5.5, 5-8, 8-1

4、0, 3-10 等,(4)載體兩性電解質(zhì)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 合成的方式與Ampholine基本相同. pH范圍: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.0,3 pH梯度的形成 3.1在電場(chǎng)下載體兩性電解質(zhì)的變化 在沒有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等,凈電荷為零. 引入電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽(yáng)極移動(dòng),最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.,(1)靠近陽(yáng)極端的載

5、體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延; (2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陽(yáng)極順延。如圖,3.2pH梯度的形成過程 pH梯度形成的時(shí)間,視正負(fù)電極之間的距離和凝膠的厚度而定.一般一塊長(zhǎng)12cm的玻璃,電極間的有效距離為10cm，凝膠的厚度為1mm，使用Ampholine為載體兩性電解質(zhì),電泳1小時(shí)后pH梯度基本形成，2小時(shí)后無(wú)多大變化,如圖,4、實(shí)驗(yàn)流程 等電聚焦凝膠溶液配制 安裝電泳槽、調(diào)水平 鋪膠 加樣 電泳 停止電泳 取

6、膠固定 染色、脫色,二、實(shí)驗(yàn)方法 1、儀器準(zhǔn)備及清洗 (1)電泳槽,玻璃板三塊, 塑料模板 (2)燒杯 50 ml 一個(gè) (3)量筒100ml一個(gè) 10 ml一個(gè) (4)大培養(yǎng)皿 一個(gè),2、配試劑(每組用量) （1）固定液100ml 三氯乙酸10g 磺基水楊酸3.5g 95%乙醇35ml 加蒸餾水至100ml (2)脫色液100 ml 95%乙醇10 ml 冰醋酸7.5 ml 加蒸餾水至100ml,3、實(shí)驗(yàn)步驟 (1) 安裝電泳槽,調(diào)水平(先平放兩塊相同厚度玻璃板,上放塑料模板,一頭用鐵夾夾住),(2)配凝膠溶液 單體 2ml Ampholine 0.5ml ddH

7、2O 5.5ml TEMED 8l 10% AP 50l,(3)灌膠, 聚膠60分鐘 (4)取下玻璃板, 電泳槽上加少許液體石蠟,將坐標(biāo)紙浸透鋪平整, 坐標(biāo)紙上放帶膠玻璃板 (5)加電極條:取4張濾紙條,其中兩張濾紙條浸透1mol/L 磷酸,另兩張浸透1mol/L NaOH, 多余的液滴用濾紙質(zhì)吸去,然后對(duì)稱放在凝膠的兩側(cè).,(6)剪取加樣紙: 按坐標(biāo)紙的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加樣紙,撥去上下覆蓋的保護(hù)紙,取出8層擦鏡紙作為加樣紙,根據(jù)樣液濃度調(diào)節(jié)加樣紙的層數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)樣4層,其它樣液均為8層). (7)加樣: 將加樣紙分別吸取樣液,成一字形排放在兩電極之間的凝膠中央. (8)

8、連接電極: 將電極線的插頭插入電極板的插孔內(nèi),蓋上電極板,使鉑金絲壓在電極條上.蓋上安全罩,接通冷凝水.,(9)電泳: 將電泳儀正極輸出端與磷酸電極條相連, 負(fù)極輸出端與NaOH電極條相連,接通電源,60V恒壓15min, 8mA恒流至電壓上升到 550V,關(guān)閉電源,揭去加樣紙, 然后在550V恒壓3小時(shí)左右,等電流降至接近于零,停止電泳. (10)固定: 取出凝膠,浸泡在40ml的固定液中 搖動(dòng)約30min,傾出固定液.再加入60ml的固定液過夜. (11)染色: 傾出固定液,用蒸餾水漂洗一次,加入考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色60分鐘.,(12) 脫色: 傾出染色液(回收染色液).加入少量的脫色液脫色,直至背景清楚. (13)計(jì)算等電點(diǎn): 量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率,繪制等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算未知蛋白等電點(diǎn).,