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1、激光捕獲顯微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破壞組織結(jié)構(gòu)，保存要捕獲的細(xì)胞和其周圍組織形態(tài)完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標(biāo)細(xì)胞 ，通常用于從組織中精確地分離一個(gè)單一的細(xì)胞。 背景：機(jī)體組織包含有上百種不同的細(xì)胞，這些細(xì)胞各自與周圍的細(xì)胞、基質(zhì)、血管、腺體、炎癥細(xì)胞或免疫細(xì)胞相互粘附。在正?；虬l(fā)育中的組織器官內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)、相鄰細(xì)胞的信號(hào)以及體液刺激作用于特定的細(xì)胞，使這些細(xì)胞表達(dá)不同的基因并且發(fā)生復(fù)雜的分子變化。在病理狀態(tài)下，如果同一類型的細(xì)胞發(fā)生了相同的分子改變，則這種分子改變對(duì)于疾病的發(fā)生可能起著關(guān)

2、鍵性的作用。然而，發(fā)生相同分子改變的細(xì)胞可能只占組織總體積的很小一部分；同時(shí)，研究的目標(biāo)細(xì)胞往往被其它組織成分所環(huán)繞。為了對(duì)疾病發(fā)生過(guò)程中的組織損害進(jìn)行分子水平分析，分離出純凈的目標(biāo)細(xì)胞就顯得非常必要。1996年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NIH）國(guó)家腫瘤研究所的[2]開(kāi)發(fā)出激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美國(guó)Arcturus Engineering公司成功研制激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)商品化銷售。應(yīng)用該技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準(zhǔn)確獲取所需的單一細(xì)胞亞群，甚至單個(gè)細(xì)胞，從而成功解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題。這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)已成為美國(guó)“腫

3、瘤基因組解剖計(jì)劃”的一項(xiàng)支撐技術(shù)[1]。 原理：LCM的基本原理是通過(guò)一低能紅外激光脈沖激活熱塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近紅外激光波長(zhǎng)），在直視下選擇性地將目標(biāo)細(xì)胞或組織碎片粘到該膜上[2]。LCM 系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物臺(tái)（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機(jī)及彩色顯示器。用于捕獲目標(biāo)細(xì)胞的熱塑膜直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰與后繼實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn) 0.5ml離心管相匹配。 機(jī)械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目標(biāo)部位。顯微鏡直視下選擇目標(biāo)細(xì)胞，發(fā)

4、射激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內(nèi)迅速凝固。組織與膜的粘合力超過(guò)了其與載玻片間的粘合力，從而可以選擇性地轉(zhuǎn)移目標(biāo)細(xì)胞。激光脈沖通常持續(xù)0.5~5.0毫秒，并且可在整個(gè)塑料帽表面進(jìn)行多次重復(fù)，從而可以迅速分離大量的目標(biāo)細(xì)胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，將所選擇的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，從而可以分離出感興趣的分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]。 EVA膜約100~200μm厚，能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區(qū)域的溫度提高到90C，保持?jǐn)?shù)毫秒后又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。采用低能量紅外激光的同時(shí)也可避免損傷性光化學(xué)反應(yīng)

5、的發(fā)生。 優(yōu)缺點(diǎn)：LCM最顯著的優(yōu)點(diǎn)在于其迅速、準(zhǔn)確和多用途的特性。結(jié)合組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及所需的切割精確度，通過(guò)選擇激光束的直徑大小，可以迅速獲取大量的目標(biāo)細(xì)胞。LCM與以顯微操作儀為基礎(chǔ)的顯微切割技術(shù)相比[4]，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)分離細(xì)胞速度快，無(wú)需精巧的操作技能；(2)捕獲細(xì)胞和剩余組織的形態(tài)學(xué)特征均保持完好，可以較好地控制捕獲細(xì)胞的特異性；(3)捕獲細(xì)胞與塑料帽結(jié)合緊密，減少了組織損失的風(fēng)險(xiǎn)。相比而言，除了激光切割彈射微分離系統(tǒng)[5]以經(jīng)染色的用于存檔的切片也可被成功進(jìn)行顯微切割。 盡管LCM應(yīng)用廣泛，但對(duì)于常規(guī)染色、固定且不加蓋玻片的組織切片，其視覺(jué)分辨率受到很大限制。而對(duì)于那些本

6、身缺乏一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的復(fù)雜組織（如淋巴組織，廣泛浸潤(rùn)的腺癌等），要準(zhǔn)確分離出某一類細(xì)胞幾乎是不可能的。Fend等[6]通過(guò)采用特殊染色，尤其是免疫組化方法，使目標(biāo)細(xì)胞或想要去除的細(xì)胞變得更加醒目，從而解決了上述難題。 應(yīng)用LCM，偶爾會(huì)出現(xiàn)無(wú)法將選擇的細(xì)胞從切片上移走的情況，出現(xiàn)這種結(jié)果有兩種原因：(1)細(xì)胞與熱塑膜之間的粘合力不足，通常是由于組織未完全脫水或激光的能量設(shè)置過(guò)低造成的；(2)組織切片與載玻片間的粘合力過(guò)強(qiáng)，通常發(fā)生在顯微切割干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的冰凍切片。針對(duì)不同樣本組織（包括免疫組化染色的組織切片），一些研究小組分別詳盡報(bào)道了采用適合的處理方法，以達(dá)到最佳的顯微切割條件[7]。 應(yīng)

7、用：LCM較以往的顯微切割技術(shù)有了突破性的進(jìn)展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，包括前列腺癌[8]、腎癌、肺癌、甲狀腺癌[9]、食管癌、胃癌、肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM還成功應(yīng)用于其它一些疾病的研究中，如Crohn病[10]、肌萎縮性側(cè)索硬化癥[11]、子宮內(nèi)膜異位癥、獲得性免疫缺陷綜合征、結(jié)核病、丙型肝炎等。而應(yīng)用LCM所分離的組織也多種多樣，包括單個(gè)細(xì)胞、單一細(xì)胞群（主要是癌巢）、血管等類型。 展望：LCM成功解決了組織異質(zhì)性問(wèn)題，且具有迅速、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病基因水平的研究中，并顯示出了良好的應(yīng)用前景[1]。但今后

8、可能還需要以下幾個(gè)主要方面的發(fā)展和完善：理論上，除上述組織及細(xì)胞以外，LCD還可應(yīng)用于其他所有組織細(xì)胞（如脾臟巨噬細(xì)胞、肝臟Kuffer細(xì)胞等）的分離，但其各自的切片制備、染色等技術(shù)方法尚需要進(jìn)行探索；開(kāi)發(fā)相應(yīng)的應(yīng)用程序，僅需輸入目標(biāo)細(xì)胞或組織的特異性參數(shù)即可實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制LCD[12]，從而大大縮減所需的人力和時(shí)間；提高捕獲單個(gè)細(xì)胞的精確度，以減少非目標(biāo)組織的沾染；進(jìn)一步優(yōu)化快速免疫組化染色的步驟，改進(jìn)DNA和 RNA抽提技術(shù)，實(shí)現(xiàn)從少量捕獲細(xì)胞或組織中獲得高質(zhì)量的核酸。 變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromat

9、ography，DHPLC） 原理：在部分變性的條件下，通過(guò)雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來(lái)，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。 用離子對(duì)反向高效液相色譜法：⑴在不變性的溫度條件下，檢測(cè)并分離分子量不同的雙鏈DNA分子或分析具有長(zhǎng)度多態(tài)性的片段，類似RFLP分析，也可進(jìn)行定量RT—PCR及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性測(cè)定（MSI）；⑵在充分變性溫度條件下，可以區(qū)分單鏈DNA或RNA分子，適用于寡核苷酸探針合成純度分析和質(zhì)量控制；⑶在

10、部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性復(fù)性過(guò)程，不僅分別形成同源雙鏈，同時(shí)也錯(cuò)配形成異源雙鏈，根據(jù)柱子保留時(shí)間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，從而識(shí)別變異型。根據(jù)這一原理，可進(jìn)行基因突變檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性分析SNPs等方面的研究。 優(yōu)點(diǎn)：近年來(lái)建立并迅速發(fā)展的DHPLC是一種新型基因突變篩查技術(shù)，既能夠自動(dòng)化、高通量進(jìn)行，且除PCR之外，勿需進(jìn)行PCR引物修飾、購(gòu)買特殊試劑、檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)或作其它的樣品處理。而目前已有的許多DNA突變分析技術(shù)諸如單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP)、變性梯度凝膠電泳法(

11、denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能滿足此要求。DHPLC具有高通量檢測(cè)、自動(dòng)化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測(cè)DNA片段和長(zhǎng)度變動(dòng)范圍廣、相對(duì)價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的SSCP、DGGE等方法相比，DHPLC有較多的優(yōu)點(diǎn)。SSCP的結(jié)果受血樣質(zhì)量、提取方法等因素的影響，并且需要跑膠、電泳；DGGE則需要標(biāo)記引物，存在放射性污染，這兩種方法都比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而DHPLC則高度自動(dòng)化，可以自動(dòng)取樣，檢測(cè)每個(gè)樣品只需要8分鐘左右。DHPLC與其他檢測(cè)DNA突變方法的最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。當(dāng)然，只能檢測(cè)雜合突變是DHPLC的不足之

12、處，但是這可以利用混合的方法（即將純合突變樣品和野生型樣品混合）來(lái)解決。 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）于2002年由Schouten等首先報(bào)道，是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測(cè)45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究。 原理：MLPA的基本原理包括探針和靶序列DNA進(jìn)行雜交，之后通過(guò)連接、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，分析軟件對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析最后

13、得出結(jié)論。每個(gè)MLPA探針包括兩個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段，一個(gè)由化學(xué)合成，一個(gè)由M13噬菌體衍生法制備；每個(gè)探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中，兩個(gè)寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶連接兩部分探針。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)兩個(gè)探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基的差別，就會(huì)導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用一對(duì)通用引物擴(kuò)增連接好的探針，每個(gè)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度都是唯一的，范圍在130～480bp。最后，通過(guò)毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)

14、增產(chǎn)物，Genemarker軟件分析，得出結(jié)論。只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰，如果檢測(cè)的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失、擴(kuò)增突變，那么相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰便會(huì)缺失、降低或增加，因此，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數(shù)的異?；螯c(diǎn)突變存在。 應(yīng)用： 檢測(cè)染色體亞端粒的基因重排 智力低下是遍及全世界的嚴(yán)重危害兒童身心健康的一類疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感染、中毒、腦疾病等，但是很大一部分患兒的病因不明。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，包括亞端粒在內(nèi)的基因重排是引起智力低下的重要原因[M,N]，因?yàn)閬喍肆５幕蚍浅ＸS富，微小的改變就會(huì)累及眾多的基因，從而導(dǎo)致疾

15、病的發(fā)生。目前，應(yīng)用較多的檢測(cè)染色體亞端粒的方法包括染色體核型分析，熒光原位雜交（FISH），但是前者不能檢出亞端粒微小的基因重排，而后者費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、又非常昂貴，不易推廣。MLPA-P036和MLPA-P070試劑盒，針對(duì)每一個(gè)染色體的末端都設(shè)計(jì)有一個(gè)特異性探針，它經(jīng)濟(jì)、高效、快速，可以用于檢測(cè)亞端粒的基因重排[P,Q]，揭示部分智障患兒的發(fā)病原因。 檢測(cè)染色體的非整倍性改變[S,T] 目前，檢測(cè)染色體的非整倍性改變的方法主要為染色體核型分析，但是它在檢測(cè)羊水細(xì)胞、絨毛或是其他胎兒細(xì)胞時(shí)，需要進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，若培養(yǎng)失敗、細(xì)胞過(guò)少或染色體形態(tài)較差時(shí)，常常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用MLPA檢測(cè)這類標(biāo)

16、本時(shí)，不需要體外培養(yǎng)，少量標(biāo)本即可進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)易發(fā)生非整倍性改變的染色體（13，18，21，X，Y）上的幾個(gè)熱點(diǎn)基因設(shè)計(jì)特異性探針，根據(jù)特定基因拷貝數(shù)的改變，即可確定染色體數(shù)目的異常。 檢測(cè)單核苷酸的多態(tài)性（SNP）和點(diǎn)突變 根據(jù)MLPA的原理可知，靶序列DNA只要有一個(gè)堿基的改變，便可導(dǎo)致雜交不完全，使其擴(kuò)增產(chǎn)物缺失，因此，MLPA高度特異性的檢測(cè)可用于多種SNP和點(diǎn)突變。 幾種常見(jiàn)的兒童遺傳性疾病的檢測(cè) 1）智力低下綜合征 多種已知的智力低下綜合征與染色體特定區(qū)域的基因改變相關(guān)。這些患兒臨床表現(xiàn)復(fù)雜，個(gè)體差異大，缺乏特征性表現(xiàn)，醫(yī)生很難作出準(zhǔn)確診斷。MLPA-P064試劑盒，針

17、對(duì)特定的染色體區(qū)域設(shè)計(jì)了43個(gè)探針，可以明確幾種疾病的診斷[A]，包括：1p-缺失綜合征，Williams綜合征，Smith-Magenis綜合征，Miller-Dieker綜合征，Digeorge綜合征[W]，Alagille綜合征，Sotos綜合征。根據(jù)同樣的原理，MLPA-P096試劑盒可檢測(cè)的疾病包括：Wolf-Hirschhorn綜合征，Cri du Chat綜合征，WAGR綜合征，Downs綜合征等。 2）X連鎖型智力低下[C] X連鎖型智力低下可以分為綜合征型和非綜合征型，前者具備特征性的臨床表現(xiàn)，而后者沒(méi)有特異性癥狀，智力低下常常為患兒的唯一表現(xiàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19個(gè)基因與

18、X連鎖型智力低下相關(guān)，MLPA-P106可以檢測(cè)其中14個(gè)相關(guān)基因的改變。 3）假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥[D,E,F] 假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥包括Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）和Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良，臨床表現(xiàn)主要為骨盆帶肌和下肢近端肌肉無(wú)力，腓腸肌假性肥大等，致病基因位于Xp21.2，包括70多個(gè)外顯子。疾病的發(fā)生與DMD基因的缺失、重復(fù)或點(diǎn)突變相關(guān)。MLPA-P034和MLPA-P035試劑盒設(shè)計(jì)了80多個(gè)探針可以檢測(cè)每一個(gè)外顯子的缺失或重復(fù)突變，及部分點(diǎn)突變。 4）Prader-Willi綜合征（PWS）和Angelman綜合征（AS）[H,I] PWS和AS都是由染色體15

19、q11-13缺失或同源二倍體所致。如果是父源性染色體15q11-13缺失或母源性同源二倍體則引起PWS，如果是母源性染色體15q11-13缺失或父源性同源二倍體則引起AS。在人類，父源15q11-13區(qū)域存在非甲基化的SNRPN印跡基因，母源性15q11-13區(qū)域存在完全甲基化的SNRPN印跡基因。甲基化特異性的MLPA試劑盒ME028采用半定量式的方式可以檢測(cè)基因拷貝數(shù)的改變，探針?biāo)R(shí)別的DNA序列包括甲基化敏感的核酸內(nèi)切酶HhaⅠ位點(diǎn)，因此可以分析CpG島的甲基化狀態(tài)，從而區(qū)別PWS和AS。 5）其他疾病的檢測(cè) MLPA還可以用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤[J]、a-地中海貧血[K]等疾病的診斷。成

20、神經(jīng)細(xì)胞瘤是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的腫瘤，明確特征性基因的改變對(duì)確認(rèn)神經(jīng)腫瘤發(fā)生的過(guò)渡階段、治療和預(yù)后都有重要意義，為臨床提供極大的幫助。 優(yōu)缺點(diǎn)：MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、高效：一次反應(yīng)可以檢測(cè)45個(gè)靶序列拷貝數(shù)的改變。2、特異：可以檢測(cè)點(diǎn)突變。3、快速：一次實(shí)驗(yàn)可以在24小時(shí)內(nèi)完成。4、簡(jiǎn)便：不同的試劑盒操作基本相同，容易掌握。 MLPA雖然具有很大優(yōu)點(diǎn)，但也有其局限性1、需要精確測(cè)量DNA的濃度，樣本容易被污染。2、不能用于單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)。3、MLPA用于檢測(cè)基因的缺失或重復(fù)，不適合檢測(cè)未知的點(diǎn)突變類型。4、不能檢測(cè)染色體的平衡易位。

21、單核苷酸多態(tài)性SNP 全稱Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。從理論上來(lái)看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4 種不同的變異形式,但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換,二者之比為2：1[1]。SNP 在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T ,原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化,而后自發(fā)地脫氨成為胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000 個(gè)堿基就有一個(gè)SNP ,人類基因組上的SNP 總量大概是3 10^6 個(gè) 。因此,SN

22、P成為第三代遺傳標(biāo)志,人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。 作用和成果：SNP研究是人類基因組計(jì)劃走向應(yīng)用的重要步驟。這主要是因?yàn)镾NP將提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛，研究表明在人類基因組中每300堿基對(duì)就出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，通過(guò)SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過(guò)家系來(lái)得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。SNP在基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮了

23、巨大的作用，通過(guò)對(duì)Y染色體SNP的分析，使得在人類進(jìn)化、人類種群的演化和遷徙領(lǐng)域取得了一系列重要成果。 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。 SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。

24、但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。 理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個(gè)或4個(gè)等位多態(tài)性，但實(shí)際上，后兩者非常少見(jiàn)，幾乎可以忽略。因此，通常所說(shuō)的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換(C T，在其互補(bǔ)鏈上則為G A)，也可能是顛換(C A，G T，C G，A T)。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點(diǎn)。轉(zhuǎn)換的幾率之所以高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因組DNA中，任何堿

25、基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。 從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來(lái)看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變

26、，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。 先形成的SNP在人群中常有更高的頻率，后形成的SNP所占的比率較低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不盡相同，但大約有85%應(yīng)是共通的。 特性：SNP自身的特性決定了它更適合于對(duì)復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究： 1、 SNP數(shù)量多，分布廣泛。據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1000個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP，人類30億堿基中共有300萬(wàn)以上的SNPs。SNP 遍布于整個(gè)人類基因組中，根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-r

27、egion SNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三類。 2、 SNP適于快速、規(guī)模化篩查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長(zhǎng)度，這就利于發(fā)展自動(dòng)化技術(shù)篩選或檢測(cè)SNPs。 3、 SNP等位基因頻率的容易估計(jì)。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)的混和樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，根據(jù)所得信號(hào)的比例確定混和樣本中各種等位基因的頻率。 4、 易于基因分型。SNPs 的二態(tài)性，也有利于對(duì)其進(jìn)行基因分型。對(duì)SNP進(jìn)行基因分型包括三方面的內(nèi)容：(1)鑒別基因型所采用的化學(xué)反應(yīng)，常用的技術(shù)手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應(yīng)、側(cè)翼探針切割反應(yīng)以及基于這些方法的變通技術(shù)；(2)完成這些化學(xué)反應(yīng)所采用的模式，包括液相反應(yīng)、固相支持物上進(jìn)行的反應(yīng)以及二者皆有的反應(yīng)。(3)化學(xué)反應(yīng)結(jié)束后，需要應(yīng)用生物技術(shù)系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。