《烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后Wistar鼠大腦皮層炎癥反應(yīng)效果分析8200字》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后Wistar鼠大腦皮層炎癥反應(yīng)效果分析8200字（3頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后Wistar鼠大腦皮層炎癥反應(yīng)效果分析8200字 　心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation， CPR）后血漿致炎因子水平迅速升高，高水平的炎癥因子可導(dǎo)致器官損傷，甚至多臟器功能障礙[1-3]。炎癥因子水平如TNF-α 對(duì)缺血腦組織具有嚴(yán)重的損害作用，其水平高低與神經(jīng)功能預(yù)后密切相關(guān)，拮抗TNF-α對(duì)缺血腦組織具有保護(hù)作用[3-4]。 　　烏司他?。║linastatin，UTI）是從人尿中提取的蛋白酶抑制劑，對(duì)腦的缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用[5-6]。既往的研究表明UTI的保護(hù)作用和抗炎癥反應(yīng)

2、有關(guān)[7-8]， UTI 可減少核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 激活，下調(diào)致炎因子的表達(dá)[9]。本研究欲從UTI對(duì)CPR后腦組織炎癥反應(yīng)的影響探討UTI減輕CPR后腦損傷的可能機(jī)制。 　　1 材料與方法 　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 　　36只健康成年雄性Wistar大鼠，15～16月齡，體質(zhì)量（395.5±36.7）g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前晚禁食不禁水。動(dòng)物麻醉：戊巴比妥鈉（sigma公司，德國(guó)）30 mg/kg，由腹腔內(nèi)注入，酌情給予

3、1/4的首劑量維持。 　　1.2 手術(shù)操作 　　麻醉成功后，固定于操作臺(tái)上。胸、背部皮膚備皮。用16 G鞘管經(jīng)口氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)（RODENT VENTILATOR 683. Harvard Apparatus， Inc. USA），通氣頻率75次/min，潮氣量15 mL/kg，根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，PCO2控制在35～45 mmHg之間（1 mmHg=0.133 kPa）。常規(guī)Ⅱ?qū)?lián)心電監(jiān)護(hù)，24 G留置針（Becton Dickinson Medical Devices CO， Ltd，中國(guó)蘇州）穿刺右股動(dòng)靜脈，動(dòng)脈管接高敏感換能器監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。4通道生理信號(hào)采集分

4、析系統(tǒng)（BIOPAC SYSTEMS MAP150， Inc. MP100A-CE Santa Barbara，USA）連續(xù)記錄心率、血壓信息。 　　1.3 實(shí)驗(yàn)分組和標(biāo)本采集 　　36只Wistar大鼠按照筆者前期的心外膜致顫的研究方法[10-12]誘發(fā)室顫（ventricular fibrillation， VF），VF持續(xù)7 min后進(jìn)行CPR，2 min后進(jìn)行除顫，每3 min給予腎上腺素20 μg/kg 靜脈注射，如此周而復(fù)始，直至恢復(fù)自主循環(huán)（return of spontaneous circulation， ROSC），如持續(xù)15 min未ROSC，宣布復(fù)蘇失敗。RO

5、SC后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，烏司他丁治療組和對(duì)照組。烏司他丁組ROSC后立即給予烏司他?。◤V州天普生物制藥公司，廣州）10 000 U/kg （UTI組），對(duì)照組ROSC后立即給予等體積的PBS（PBS組）靜脈注射。VF（0）前和ROSC后2、4、8 h采血檢測(cè)血漿炎癥因子TNF-α和IL-6水平。ROSC后2、4、8 h 每組各時(shí)間點(diǎn)處死3只動(dòng)物取大腦皮層液氮保存用于檢測(cè)TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的核/漿轉(zhuǎn)換率。ROSC后72 h 處死動(dòng)物，取大腦行NISSL和TUNEL凋亡染色，計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)和凋亡神經(jīng)元細(xì)

6、胞數(shù)。 　　1.4 熒光定量PCR檢測(cè)腦組織TNF-α和IL-6的mRNA水平 　　總RNA提?。喝∧X組織用Trizol提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，并通過凝膠電泳檢測(cè)其完整性。cDNA 的合成： 取5 μL 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 嚴(yán)格按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（上海生工生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作。Real-time PCR：根據(jù)Genbank大鼠的基因序列設(shè)計(jì)β-actin、TNF-α和IL-6引物。β-actin-F： GCGCTCGTCGT CGACAAC 和 β-actin-R： ATACCCACC

7、A TCACACCCT; TNF-α-F： CCACCACGCTCTTCTGTC 和 TNF-α-R： GCCCATTT GGG AACTTCT; IL-6-F： TCACAGAGGATACCACCCA 和 IL-6-R： AGAATT GC CATTGCACAAC。在電泳儀（9700 Sequence Detection System，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件： 94 ℃ 15 s， 55 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。TNF-α和IL-6 mRNA 的表達(dá)為目的基因和β-actin的比值。 　　1.5 血漿、腦組織勻漿

8、中TNF-α和IL-6蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定 　　取大腦皮層勻漿，用BCA法測(cè)定勻漿蛋白濃度。用ELISA法檢測(cè)血漿和腦組織中TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度，試劑盒購(gòu)自Rapidbio公司（美國(guó)），嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。 　　1.6 NF-κB p65蛋白水平檢測(cè) 　　處理不同時(shí)段腦組織凍存標(biāo)本，按照核/胞漿蛋白提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說明， 提取胞漿蛋白和核蛋白， BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳， 按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜， 5%的脫脂奶粉封閉2 h， 滴加一抗（1∶500） 4 ℃過夜， T

9、BST 洗膜，5 minx3次， 滴加HRB標(biāo)記的二抗（1∶20 000） 室溫下孵育1 h， TBST洗膜，5 minx3次， Milipore 發(fā)光液浸泡1 min，Koda 膠片曝光，顯影、定影，計(jì)算蛋白灰度。NF-κB p65（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)），PCNA （Newcastle-upon-Tyne， 英國(guó)），GAPDH （Sigma-Aldrich Company，美國(guó)）。 　1.7 腦組織NISSL和TUNEL染色 　　參照筆者以往的研究方法進(jìn)行NISSL和TUNEL染色[11-12]。在光鏡（OLYMPUS BX51，日本）下觀

10、察分析結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)視野，計(jì)算每400倍視野下100像素內(nèi)頂葉皮層區(qū)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)。 　　1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 　　數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料依據(jù)正態(tài)檢驗(yàn)（Kolmogorov-Smirnov）結(jié)果分別用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）或四分位數(shù)法表示，依據(jù)正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果用成組t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney rank），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 　　2 結(jié)果 　　2.1 誘發(fā)VF和CPR情況 　　所有動(dòng)物均成功誘發(fā)VF并獲得ROSC，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ROSC后成昏迷狀態(tài)，需要機(jī)械輔助通氣。PBS組有4只，UTI組有7

11、只動(dòng)物存活到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組動(dòng)物VF前的生理學(xué)參數(shù)和復(fù)蘇相關(guān)指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。 　　表1 兩組動(dòng)物VF前的生理學(xué)參數(shù)和復(fù)蘇相關(guān)指標(biāo)（x±s） 　　Table 1 Physiologic variables and CPR requisite parameters in the two groups（x±s） 　　 指標(biāo)VF+PBS 　　（n=4）VF+UTI 　?。╪=7）P值 　　體質(zhì)量 （g）384±23394±160.419 　　心率（次/min）83±1182±120.215 　　平均動(dòng)脈壓（mmHg）142±23144±180.167 　　基礎(chǔ)生命支持時(shí)間（s）406±28394±320