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1、第四章 固定化酶和固定化細胞 （ 2學時） 主要內容： 1 固定化酶的定義與優(yōu)點 2 酶固定化技術發(fā)展史 3 固定化酶的制備方法 4 固定化酶的特性 5 固定化活細胞 6 酶催化反應器及其類型 游離酶的使用 蒸汽 酶解罐簡易圖 加熱滅酶 酶無法回收 穩(wěn)定性差 1 固定化酶的定義與優(yōu)點 所謂固定化酶 (immobilized enzyme)， 是 指在一定的空間范圍內起催化作用 ， 并能 反復 和連 續(xù) 使用的酶 。 固定化酶的優(yōu)點： （ 1） 同一批固定化酶能在工藝流程中 重復多次地使用 ； （ 2） 固定化后 ， 和反應物分開 ， 有利于控制生產過程 ， 同時也 省去了熱處理使酶失活的步驟

2、； （ 3） 穩(wěn)定性顯著提高 ； （ 4） 可長期使用 ， 并可預測衰變的速度； （ 5） 提供了 研究酶動力學的良好模型 。 2 酶固定化技術發(fā)展史 起始研究 1916年 系統(tǒng)研究 1950年 - 工業(yè)化應用 1969年 - 1916年 ， Nelson和 Griffin將蔗糖酶吸附在骨炭粉上 ， 吸附以后酶不溶于水且具有和液體酶同樣的活性 ， 實 現(xiàn)了酶的固定化 ， 可惜長期未得到重視 。 1953年 Grubhofer和 Schleith將聚氨基苯乙烯樹脂重 氮化 ， 然后將淀粉酶等與這種載體結合 ， 制成了固定 化酶 。 60年代后期 ， 酶固定化技術迅速發(fā)展 ， 出現(xiàn)了 很多新的酶固

3、定化方法 。 1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐糜?DL-氨基酸的光學拆分上，來生產 L-氨基酸， 開創(chuàng)了 固定化酶應用于工業(yè)生產的先例 。 1973年，將固定 化微生物細胞首次應用于工業(yè)生產。 目前 ， 固定化技術已經取得了許多重要成果 ， 充分發(fā)揮了 固定化酶和固定化細胞在改革工藝和降低成本方面的巨大 潛力 。 但從目前的發(fā)展狀況來看 ， 盡管酶種類繁多 ， 但已經固定 化的酶卻相對有限 ， 采用固定化酶技術大規(guī)模生產的企業(yè) 尚屬少數(shù) ， 真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于 葡萄糖 異構酶 、 葡萄糖氧化酶和青霉素?；?等為數(shù)不多的 十幾 個酶種 ， 故仍需大力研究開發(fā)使更多的

4、固定化酶和細胞能 適用于工業(yè)規(guī)模生產 。 應用現(xiàn)狀： 3 固定化酶的制備方法 酶的固定化方法主要可分 為四類：吸附法 、 包埋法 、 共價鍵結合法和交聯(lián)法 。 對于特定的目標酶 ， 要根 據(jù)酶自身的性質 、 應用目 的 、 應用環(huán)境來選擇固定 化載體和方法 。 在具體選擇時，一般應遵循以下 6個原則。 （ 1） 酶與載體的結合部位不應當是酶的活性部位 ， 固 定化時應采取盡可能溫和的條件 。 （ 2） 酶與載體必須有一定的結合程度 ， 利于反復使用 。 （ 3） 用于固定化的載體必須 有一定的機械強度 ， 不易 破壞或受損 。 （ 4） 固定化應盡可能不妨礙酶與底物的接近 ， 以提高 催化效率

5、和產物的量 。 （ 5） 所選載體應不和底物 、 產物或反應液發(fā)生化學反 應 。 （ 6） 固定化酶的成本適中 ， 以利于工業(yè)使用 。 3.1吸附法 吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵 相互作用而達到固定目的的方法 ， 是固定化中最 簡單的方法 。 酶與載體之間的親和力是范德華力 、 疏水相互作 用 、 離子鍵和氫鍵等 。 吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法 。 物理吸附法是通過 物理方法 將酶直接吸附在水不溶性載體 表面上而使酶固定化的方法 。 是制備固定化酶最早采用的 方法 。 常用的載體：纖維素 、 膠原 、 淀粉及面筋 、 活性炭 、 氧化 鋁 、 皂土 、 多孔玻璃 、 硅

6、膠 、 二氧化鈦 、 羥基磷灰石等 。 優(yōu)點：操作簡單 、 價廉 、 條件溫和 ， 載體可反復使用 ， 酶 與載體結合后 ， 活性部位及空間構象變化不大 ， 固定化酶 活力較高 。 缺點：酶和載體結合不牢固 ， 在使用過程中容易脫落 ， 常 與交聯(lián)法結合使用 。 （ 1）物理吸附法 離子吸附法 (ion adsorption)是 將酶與含有離子 交換基團的水不溶性載體以靜電作用力相結合的 固定化方法 ， 即通過離子鍵使酶與載體相結合的 固定化方法 。 DEAE-纖維素吸附的 -淀粉酶 、 蔗糖酶已作為商 品固定化酶 。 具有操作簡便 、 條件溫和 、 酶活力不易喪失等優(yōu) 點 。 此外 ， 吸附

7、過程同時可以純化酶 。 （ 2）離子吸附法 3.2包埋法 包埋法是將 酶包埋在高聚物的細微凝膠網格中或 高分子半透膜內的固定化方法 。 前者又稱為凝膠 包埋法 ， 酶被包埋成網格型；后者又稱為微膠囊 包埋法 ， 酶被包埋成微膠囊型 。 （ 1）凝膠包埋法 凝膠包埋法常用的載體 有 海藻酸鈉 凝膠 、 角叉 菜膠 、 明膠 、 瓊脂凝膠 、 卡拉膠等天然凝膠以及 聚丙烯酰胺 、 聚乙烯醇 和光交聯(lián)樹脂等合成凝 膠或樹脂 。 1-2%海藻酸鈉 +酶液 E E E E 5%CaCl2溶液 （ 2）微膠囊包埋法 微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半 透膜微膠囊內的方法 。 它使酶存在于類似細胞內的

8、環(huán)境中 ， 可以防止 酶的脫落 ， 防止微囊外的環(huán)境直接接觸 ， 從而 增加了酶的穩(wěn)定性 。 常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺 、 火棉膠 、 醋酸纖維素等 。 適合于 小分子 為底物和產物的酶的固定化 。 如 脲酶 、 天冬酰胺酶 、 尿酸酶 、 過氧化氫酶等 。 3.3共價鍵結合法 共價鍵結合法 (covalent binding） 是 將酶與 聚合物載體以共價鍵結合的固定化方法 。 酶蛋 白上可供載體結合的功能基團有以下幾種： （ 1） 酶蛋白 N末端的 -氨基或賴氨酸殘基的 -氨基 。 （ 2） 酶蛋白 C末端的 -羧基 、 天門冬氨酸殘基的 -羧 基以及谷氨酸殘基的 -羧基 。 （ 3

9、） 半胱氨酸殘基的 巰基 。 （ 4） 絲氨酸 、 蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基 。 （ 5） 組氨酸殘基的咪唑基 。 （ 6） 色氨酸殘基的吲哚 基 。 （ 7） 苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán) 。 其中最普遍的共價鍵結合基團是 氨基 、 羧基以及 苯環(huán) 。 常用來和酶共價偶聯(lián)的載體的功能基團有 芳香氨基 、 羥基 、 羧基和羧甲基等 。 這種方法是 固定化酶研究中最活躍的一大類方法 ， 但必須注意 ， 參加共價結合的氨基酸殘基應當是 酶催化活性非必需基團 ， 如若共價結合包括了酶 活性中心有關的基團 ， 會導致酶的活力損失 。 用共價鍵結合法制備的固定化酶 ， 酶和載體之間都是通過 化學反應以共價

10、鍵偶聯(lián) 。 由于共價鍵的鍵能高 ， 酶和載體 之間的結合相當牢固 ， 即使用高濃度底物溶液或鹽溶液 ， 也不會使酶分子從載體上脫落下來 ， 具有酶 穩(wěn)定性好 、 可 連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點 。 但是采用該方法時 ， 載體活化的難度較大 ， 操作復雜 ， 反 應條件較劇烈 ， 制備過程中酶直接參與化學反應 ， 易引起 酶蛋白空間構象變化 ， 酶活回收率一般為 30%左右 ， 甚 至酶的底物的專一性等性質也會發(fā)生變化 ， 往往需要嚴格 控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶 。 3.4交聯(lián)法 交聯(lián)法 （ cross-linking） 是 使用雙功能或多功能試劑使酶 分子之間相互交聯(lián)呈網狀結構的固定

11、化方法 。 由于酶蛋白的功能團 ， 如氨基 、 酚基 、 巰基等參與反應 ， 所 以酶的活性中心構造可能受到影響 ， 使酶明顯失活 。 常用的雙功能試劑有戊二醛 、 己二胺 、 異氰酸衍生物 、 雙偶 氮聯(lián)苯和 N,N-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等 ， 其中使用最廣泛 的是戊二醛 。 戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生 Schiff反應 ， 形成薛夫堿 ， 從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶 。 以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點 （ 見表 4-1） 。 往往一種酶可以用 不同方法固定化 ， 但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶 。 在實際應用時 ， 常將兩種或數(shù)種固定化方法并用 ， 以取長補短

12、 。 4 固定化酶的特性 4.1固定化酶的形狀 固定化酶的形式多樣 ， 依不同用途有顆粒 、 線 條 、 薄膜和酶管等形狀 。 其中 顆粒占絕大多數(shù) ， 它和線條主要用于工業(yè) 發(fā)酵生產 ， 如裝成酶柱用于連續(xù)生產 ， 或在反 應器中進行批式攪拌反應； 薄膜主要用于酶電極 ， 應用于分析化學； 酶管機械強度較大 ， 亦宜用于工業(yè)生產 。 4.2酶活力 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力 低 ， 其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相 結合； 當酶與載體結合時 ， 它的高級結構發(fā)生了變化； 酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響 。 也有在個別情況下 ， 酶經固定化后其活

13、力升高 ， 可能 是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離 酶活力高 。 4.3固定化酶的穩(wěn)定性 1） 操作穩(wěn)定性 一般情況下，半衰期在一個月以上，即有工業(yè)應用價值。 3）熱穩(wěn)定性 大多數(shù)酶在固定化后，熱穩(wěn)定性提高，但有些酶采用吸附法固定化時會降低。 2） 貯藏穩(wěn)定性 可延長酶的貯藏有效期。如果貯藏條件 比較好，亦可較長時間保持活力。 4）對蛋白酶的 穩(wěn)定性 由于酶固定化后受到空間位阻的影響， 蛋白酶不能有效接觸，因此抵抗力提高。 5）酸堿 穩(wěn)定性 多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性提高。極少 數(shù)酶固定化后由于酶活性構象的敏感區(qū)受 到牽連導致穩(wěn)定性下降。 4.4固定化酶的反應特性 固定化酶的反應特

14、性 ， 例如 ， 底物特異性 、 酶反應的 最適 pH、 酶反應的最適溫度 、 動力學常數(shù) 、 最大反應 速度等均與游離酶有所不同 。 （ 1）底物特異性 固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關系。 一般來說， 當酶的底物為小分子化合物時，固定化酶的 底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。 而當酶的底物為大分子化合物時 ， 如蛋白酶 、 -淀粉酶 、 磷酸二酯酶等 ， 一般隨著底物分子量的增大 ， 固定化酶 的活力下降 。 這是由于載體引起的 空間位阻作用 ， 使大分子底物難以 與酶分子接近而無法進行催化反應 ， 酶的催化活力難以 發(fā)揮出來 ， 催化活性大大下降 。 例如 ， 糖化酶用 C

15、MC疊氮衍生物固定化時 ， 對分子量 8000的直鏈淀粉的活性為游離酶的 77 ， 而對分子量 為 50萬的直鏈淀粉的活性只有 15% 17 。 （ 2）反應的最適 pH 酶被固定后 ， 其最適 pH和 pH曲線常會發(fā)生偏 移 。 一般來說 ， 產物為酸性時 ， 固定化酶的最適 pH與游離酶相比升高；產物為堿性時 ， 固定 化酶的最適 pH與游離酶相比降低 。 （ 3）反應的最適溫度 固定化酶的最適反應溫度多數(shù)較游離酶高 。 如色氨酸酶經共價結合后最適溫度比固定前提 高 5 15 ， 但也有不變甚至降低的 。 固定化 酶的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化 載體的影響 。 （ 4）米氏常數(shù)

16、酶經固定化后 ， 酶蛋白分子的高級結構的變化 以及載體電荷的影響可導致底物和酶的親合力 的變化 。 使用載體結合法制成的固定化酶 Km有時變動 的原因 ， 主要是由于載體與底物間的靜電相互 作用的緣故 。 （ 5）最大反應速度 固定化酶的最大反應速度與游離酶大多數(shù)是相同 的 。 有些酶的最大反應速度會因固定化方法的 不同而有所差異 。 5 固定化活細胞 20世紀 70年代 ， 在固定化酶的基礎上科學家們研制成固 定化細胞 （ Immobilized Cell） ， 并且用于生產 。 直接固定那些含有所需胞內酶的細胞 ， 并且利用這樣的細 胞來催化化學反應 。 70年代末 ， 法國研究成功固定化

17、細胞生產啤酒 ， 80年代 初我國居乃琥等用固定化細胞批量生產啤酒和酒精取得重 要研究成果 。 固定化細胞按其生理狀態(tài)又可分為固定化死細胞和活細胞 兩大類 。 固定化細胞的優(yōu)點和缺點： 固 定 化 活 細 胞 優(yōu)點 缺點 必須保持菌體的完整 ， 防止菌體的自溶 ， 否則 影響產物的純度； 必須抑制細胞內蛋白 酶對目的酶的分解； 胞內多酶的存在 ， 會 形成副產物； 載體 、 細胞膜或細胞 壁會造成底物滲透與擴 散的障礙等 。 無需進行酶的分離和 純化 ， 減少酶活損失 ， 降 低成本； 可進行多酶反應 ， 且不 需添加輔助因子； 活細胞保持了酶的原始 狀態(tài) ， 穩(wěn)定性更高 ， 對污 染的抵抗力

18、更強； 細胞生長停滯時間短 ， 細胞多 ， 反應快等等 。 物理吸附法 包埋法 6 酶催化反應器及其類型 以酶為催化劑進行反應所需要的設備稱 之為酶催化反應器，簡稱 酶反應器 。 6.1酶反應器的類型 酶反應器有兩種類型： 一類是直接用游離酶進行反應 ， 即均相酶反應器； 另一類是應用固定化酶進行的非均相酶反應器 。 均相酶反應能在批量式攪拌桶反應器或超濾膜反應器中進 行 ， 而非均相酶反應則可在多種反應器中進行 ， 適用于連 續(xù)催化反應 ， 包括： 連續(xù)流攪拌桶反應器 、 填充床反應器 、 流化床反應器 、 連續(xù)攪拌桶 -超濾和循環(huán)式反應器等 。 6.2反應器的結構特點 這類反應器結構簡單

19、， 造價較低 ， 傳 質阻力很小 ， 反應能迅速達到穩(wěn)態(tài) ， 主要應用在 飲料等食品工業(yè)中 。 其缺點是操作麻煩 ， 在反復回收過程 中固定化酶容易損失 ， 所以工業(yè)規(guī)模 的固定化酶很少采用 。 但是 ， 常用于 游離酶 。 圖 4-2 批量式攪拌桶反應器 6.2.1 批量式攪拌桶反應器 這種反應器在運轉過程中 ， 底 物以恒定的流速流入反應器 ， 與此同時 ， 反應液則以同樣的 流速流出反應器 。 反應桶內裝 有攪拌器 ， 使反應組分與 固定 化酶顆粒 混合均一 ， 出口處有 過濾膜 ， 可使不斷補充新鮮底 物與反應液流量維持動態(tài)平衡 ， 如圖 4-3。 6.2.2 連續(xù)流攪拌桶反應器 圖

20、4-3 連續(xù)流攪拌桶反應器 6.2.3 填充床反應器 圖 4-4填充床反應器 PBR具有高效率、 易操作、結構簡單 等優(yōu)點。 它適用于各種形狀 的固定化酶和不含 固體顆粒、黏度不 大的底物溶液，以 及有產物抑制的轉 化反應。 其缺點是傳質系數(shù) 和傳熱系數(shù)相對較低。 當?shù)孜锶芤汉腆w 顆粒或黏度很大時， 不宜采用 目前工業(yè)生產及研究中應用最為普遍的反應器。 6.2.4 流化床反應器 圖 4-5 流化床反應器 主要被用來處理一些 粘度高 的液體和顆粒細小 的底物，如 用于水解牛乳中的蛋白質。同 時，亦可用于需要供氣體或排 放氣體的酶反應（即固、液、 氣三相反應）。 但因 FBR混合均勻，故不適 用

21、于有產物抑制的酶反應。 6.2.5 連續(xù)攪拌桶 -超濾反應器 (CSTR UF) 圖 4-6 連續(xù)攪拌桶 -超濾反應器 適用于顆粒較細 的固定化酶、游離 酶和細胞以及小分 子產物與大分子底 物。 如： 纖維素的連續(xù)糖 化、 -淀粉酶水解淀 粉 6.2.6 循環(huán)反應器（ Recycle Reactor， RCR） 外循環(huán)反應器 內循環(huán)反應器 循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸 機會，以達到所需的轉化率。這種反應器可 用于 難溶或者不溶性底物 的轉化反應。 6.3膜式反應器 膜式反應器是 20世紀 70年代以來發(fā)展起來的一種新型反 應器 ， 它是利用膜的分離功能 ， 同時完成反應和分離過程 的一

22、種反應器 。 6.3.1膜式反應器的類型： 根據(jù)酶的存在狀態(tài) 、 相數(shù) 、 膜組件型式 、 膜材料類型 、 耦 合方式 、 傳質推動力等的不同 ， 酶膜反應器有不同的分類 方式 。 根據(jù)膜組件的型式不同 ， 可把酶膜反應器分為板框 式 、 螺旋卷式 、 管式和中空纖維式酶膜反應器 。 以下以螺 旋卷膜式反應器和中空纖維膜式反應器為例來說明 。 （ 1）螺旋卷膜式反應器 此反應器的螺旋結構是將 含酶的膜片與支持材料交替 地纏繞在中心棒上 。 所用的 膜片一般是膠原蛋白；而支 持材料則是一種稱為凡克塞 的惰性聚合網狀物 。 把上述螺旋元件裝進圓筒 ， 筒兩端加蓋板 ， 并安裝進出 口管 ， 這樣

23、， 就制成了螺旋 卷膜式反應器 。 螺旋模型可將流體流動的單 元分隔成許多獨立空間 ， 改 善接觸效果 ， 消除短路； 另外 ， 網狀支持材料可以提 高每一流動間隔的混合效果 ， 加快物質傳遞 。 （ 2）中空纖維膜式反應器 外層： 中空纖維膜 水 和 小 分 子 產 物 多孔海綿狀的支 持層（固定酶） 半透性膜 大分子底物 用這種固定化酶填充的 反應器 可以提供較大的 催化表面 ， 缺點：中空纖維的制造 極為困難，難以保證纖 維束內流體流動的均勻 性，以及存在較大的物 質傳遞阻力等。 6.3.2 膜式反應器的特點 （ 1） 膜的選擇透過性使某些組分 (如產物 )連續(xù)脫除 ， 使 反應轉化率不

24、受 化學平衡轉化率的限制 ， 提高了反應的轉化率 。 （ 2） 酶膜反應器可將目的產物分離出去 ， 而酶可以重復利用 ， 可實現(xiàn)連 續(xù)操作 ， 并有可能提高復雜反應的選擇性 。 （ 3） 膜作為酶的固定化載體可以使酶在類似生物膜的環(huán)境中高效發(fā)揮作 用 。 （ 4） 可實現(xiàn)對流傳質代替自由擴散 ， 強化了傳質速率 ， 提高了反應速率 。 （ 5） 可以簡化工藝流程和操作步驟 ， 降低生產成本和增加產量的作用 。 （ 6） 膜作為相分離器和相接觸器 ， 避免了乳化和破乳等問題 ， 也擺脫了 液泛的限制 。 但是膜反應器在使用過程中也存在著一些問題 ， 這些問題 嚴重制約了膜反應器的推廣應用： 膜孔

25、分布與形態(tài)結構的均一性差 ， 造成酶分子和小分子激活劑 (金 屬離子或輔助因子等 )的泄漏損失 。 酶在膜表面的隨機吸附引起酶空間構型的改變或活性位點的遮蔽 ， 降低或破壞酶的催化活性 。 酶分子在酶膜反應器中容易因湍流等原因而發(fā)生剪切失活 。 有些情形下 ， 由于產物分子在靠近膜面的位置逐漸積聚而形成凝 膠層 ， 造成酶膜反應器中嚴重的產物抑制 。 濃差極化和膜污染使酶膜反應器的傳質速率和生產能力急劇下降 ， 膜孔堵塞 、 膜厚增加使膜的結構形態(tài)發(fā)生不利變化 ， 膜需要頻繁 地清洗或更換 。 6.3.3 膜式反應器的應用 其在食品中的應用如： 透過果膠水解來降低果汁粘度； 通過將乳糖轉化為可以消化的糖類來降低牛奶和乳 清中乳糖的含量； 通過多酚化合物和花色素的轉化來進行白酒的處理； 從牛奶產品中去除過氧化物等 。 本章重點： 1、 固定化酶的優(yōu)點及應用實例 。 2、 酶被固定化后的理化性質的變化 ， 對工業(yè)應用的利弊