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1、 DNA的 復(fù) 制God said to them: “Be fruitful and multiply！ ” 圣 經(jīng) 創(chuàng) 世 紀(jì) 第 一 節(jié) DNA復(fù) 制 概 貌一 、 DNA復(fù) 制 的 半 保 留 性 二 、 復(fù) 制 過(guò) 程 中 的 順 序 性復(fù) 制 從 原 點(diǎn) 開(kāi) 始邊 解 鏈 邊 復(fù) 制w 為 什 么 不 采 取 先 將 DNA全 部 解 鏈 ， 然 后 再 分 別 進(jìn) 行 復(fù) 制 的 方 法 ？ 三 、 DNA的 半 不 連 續(xù) 復(fù) 制 岡 崎 片 段 的 發(fā) 現(xiàn) DNA只 能 從 5到 3方 向 合 成不 能 從 兩 端 同 時(shí) 復(fù) 制 3， 5 磷 酸 二 酯 鍵 的 形 成 第

2、 二 節(jié) DNA的 復(fù) 制 酶 和 相 關(guān) 蛋 白一 、 DNA聚 合 酶1. 種 類 ： DNA聚 合 酶 I： 1956年 ， Kornbergw 具 有 聚 合 酶 、 3 -5 外 切 核 酸 酶 、5 -3 外 切 核 酸 酶 活 性w 主 要 生 理 功 能 ： 主 要 的 DNA修 復(fù) 酶 ， 并 參與 半 保 留 復(fù) 制 Roger, Kenneth, Sylvy, Arthur and Thomas. DNA聚 合 酶 II： 沒(méi) 有 5 -3 外 切 核 酸 酶 活 性 ， 次 要 的 DNA修 復(fù) 酶DNA聚 合 酶 III： 是 真 正 的 DNA復(fù) 制 酶w多 亞 基

3、w多 層 次 組 裝DNA聚 合 酶 IV和 V： 參 與 SOS修 復(fù) 2. DNA聚 合 酶 III的 結(jié) 構(gòu) ： DNA聚 合 酶 3-5核 酸 外 切 酶 激 活 外 切 酶 活 性 使 核 心 酶 結(jié) 合 為 二 聚 體 ； 結(jié) 合 復(fù) 合 物 結(jié) 合 ATP 與 亞 基 結(jié) 合 與 和 亞 基 結(jié) 合 與 SSB 蛋 白 結(jié) 合 與 和 亞 基 結(jié) 合 sliding clamp（ 滑 動(dòng) 夾 環(huán) ）核 心 酶 Pol III Pol III Pol III* sliding clamp 二 、 解 螺 旋 酶 (helicase)：A helicase is an enzyme

4、that uses energy provided by NTP hydrolysis to separate the strands of a nucleic acid duplex 三 、 SSB蛋 白 （ 單 鏈 結(jié) 合 蛋 白 ）The single-strand binding protein (SSB) attaches to single-stranded DNA, thereby preventing the DNA from forming a duplex 防 止 單 鏈 復(fù) 性維 持 單 鏈 剛 性 狀 態(tài)避 免 單 鏈 降 解The SSB binds as a mon

5、omer, but typically in a cooperative manner in which the binding of one protein molecule makes it much easier for another to bind 四 、 引 發(fā) 酶 (primase): The primase is a type of RNA polymerase that synthesizes short segments of RNA that will be used as primers for DNA replication. 為 什 么 DNA的 合 成 需 要 R

6、NA引 物 ？ 五 、 旋 轉(zhuǎn) 酶 (gyrase )：a Type II topoisomerase, acts to overcome the torsional stress imposed upon unwinding by introducing negative supercoils at the expense of ATP hydrolysis. 復(fù) 制 叉 前 進(jìn) 帶 來(lái) 扭 曲 張 力拓 撲 異 構(gòu) 酶 II： 引 入 負(fù) 超 螺 旋 六 、 DNA連 接 酶 （ DNA ligases ）DNA ligase makes a bond between an adjacen

7、t 3-OH and 5 -phosphate end where there is a nick in one strand of duplex DNA .1、 酶 活 化2、 AMP轉(zhuǎn) 移3、 3 -OH親 核 攻 擊 第 三 節(jié) DNA的 復(fù) 制 過(guò) 程一 、 原 核 生 物 的 復(fù) 制 （ E.coli）（ 一 ） 復(fù) 制 的 起 始 ：1. 復(fù) 制 原 點(diǎn) ： Ori C， 含 兩 個(gè) 系 列 的 重 復(fù) 單 位 ， 3個(gè) 13bp重 復(fù) 序 列 （ 富 含 AT） ， 和 4個(gè) 9bp重 復(fù)序 列 （ 識(shí) 別 位 點(diǎn) ） 2. 起 始 過(guò) 程 ： The origin is ini

8、tially recognized by a protein that forms a large complex with DNA. A short region of AT-rich DNA is melted. Helicase is bound to the complex and creates the replication fork. The first nucleotides of the new chain are synthesized into the primer DnaA protein is the initiation factor :w The four 9 b

9、p consensus sequences on the right side of oriC provide the initial binding sites for DnaA. It binds cooperatively to form a central core around which oriC DNA is wrapped. w Then DnaA acts at three A-T-rich 13 bp tandem repeats located in the left side of oriC. In the presence of ATP, DnaA melts the

10、 DNA strands at each of these sites to form an open complex w HU protein has the capacity to bend DNA, and is involved in building the structure that leads to formation of the open complex. w Transcriptional activation:RNA polymerase could be required to read into the origin from adjacent transcript

11、ion units. The act of transcription could be associated with a structural change that assists melting of DNA. Hu The replication fork is generated w 2-4 monomers of DnaA bind at the origin, and they recruit 2 prepriming complexes of DnaB-DnaC to bind, so that there is one for each of the two (bidire

12、ctional) replication forks. w DnaB protein is delivered to oriC by DnaC protein in the form of a hexameric (DnaB:DnaC)6 complex, but DnaC protein does not enter the protein assemblage at oriC .w DnaB protein has helicase activity and it further unwinds the DNA in the pre-priming complex in both dire

13、ctions, assisted by DNA gyrase. SSB tetramers coat single-stranded regions as they arise . Primer synthesis: each DnaB activates a DnaG primase, in one case to initiate the leading strand, and in the other to initiate the first Okazaki fragment of the lagging strand. （ 二 ） 復(fù) 制 的 延 伸 ：1. 復(fù) 制 體 ： 酶 和

14、相 關(guān) 蛋 白 在 復(fù) 制 叉 形 成 的 超 分子 復(fù) 合 物 2. 先 導(dǎo) 鏈 和 后 隨 鏈 的 同 時(shí) 復(fù) 制 Lagging template strand通 過(guò) 復(fù) 制體 形 成 一 個(gè) 環(huán) 狀 結(jié) 構(gòu) ， primase已經(jīng) 合 成 一 條 引 物 2 隨 著 岡 崎 片 段 的 合 成 ， 環(huán) 逐 漸 變 大 ，直 到 2片 段 末 端 接 近 前 一 岡 崎 片段 的 引 物 復(fù) 制 體 釋 放 環(huán) ， primase合 成 一 個(gè)新 的 引 物 3. 環(huán) 型 DNA的 復(fù) 制 類 型 ： 型 （ E.Coli） : an origin creates two replica

15、tion forks that move in opposite directions D-loop (mammalian mitochondrial DNA)： mtDNA的 復(fù) 制 在 H鏈 的 復(fù) 制 起 點(diǎn) OH開(kāi) 始 合 成 ; 當(dāng) 置 換 鏈 通 過(guò) L鏈 的 復(fù) 制 起 點(diǎn) OL時(shí) ， 開(kāi) 始 合 成新 的 H鏈 ; 新 的 L鏈 合 成 完 成 ， 子 代 雙 鏈 被 釋 放 。Key concepts: Mitochondria use different origin sequences Rolling circles（ X174 phage ）w A protein ni

16、cks the origin and binds to 5 end.w Using the rolling circle, the 3 OH end of the nick is extended into a new chain. w The positive strand has grown to double length and replication fork is back at the orgin.w A protein cuts the bouble-length positive strand in half,releasing the displaced half and

17、binds to the new 5 end.w Releasd plus strand forms covalent circle. 4. Restart of stalled replication forks :w Initiation of X174 replication requires the primosome complex to displace SSB from the origin. The primosome consists of six proteins: PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, and DnaC. A primosome as

18、sembles at a unique site, called the assembly site (pas). w The importance of the primosome for the bacterial cell is that it is used to restart replication at forks that stall when they encounter damaged DNA. At forks without a lagging strand, the single-stranded lagging-strand template can be boun

19、d directly by DnaB. At forks with a lagging strand, this strand must be unwound by PriA helicase to generate a single-stranded binding site for DnaB loading （ 三 ） 、 復(fù) 制 的 終 止 ：1. 環(huán) 形 DNA： 單 向 復(fù) 制 ： 復(fù) 制 終 點(diǎn) 復(fù) 制 起 點(diǎn) 雙 向 復(fù) 制 ： 兩 個(gè) 生 長(zhǎng) 點(diǎn) 的 簡(jiǎn) 單 碰 撞 (無(wú) 固 定 終 點(diǎn) ) 有 固 定 終 點(diǎn) （ 如 E.Coli） E.coli的 Ter終 止 位 點(diǎn) 當(dāng)

20、復(fù) 制 叉 前 移 ， 遇 到 20bp重 復(fù) 性 終 止 子 序 列 （ Ter） 時(shí) ，Ter-Tus復(fù) 合 物 能 阻 擋 復(fù) 制 叉 的 繼 續(xù) 前 移 ， 等 到 相 反 方 向 的復(fù) 制 叉 到 達(dá) 后 在 DNA拓 撲 異 構(gòu) 酶 IV的 作 用 下 使 復(fù) 制 叉 解 體 ，釋 放 子 鏈 DNA w T7 DNA兩 端 各 有 一 段 重 復(fù) 的 數(shù) 百 個(gè)核 苷 酸 ， 叫 末 端 冗 余 。w 兩 個(gè) 5端 有 空 缺 的 分 子 通 過(guò) 3端 凸 出的 重 復(fù) 序 列 互 補(bǔ) 配 對(duì) 。w 然 后 DNA聚 合 酶 從 3端 延 伸 填 補(bǔ) 起這 個(gè) 空 缺 ， 留 下

21、 最 后 的 裂 隙 由 連 接酶 封 閉 ， 產(chǎn) 生 了 一 個(gè) 連 環(huán) 分 子 。w 再 由 特 異 性 限 制 內(nèi) 切 酶 在 連 接 處 交錯(cuò) 切 割 ， 產(chǎn) 生 3 凹 端w 由 DNA多 聚 酶 在 3-OH上 延 伸 填 滿新 的 空 缺 ， 產(chǎn) 生 兩 條 完 整 的 雙 鏈 。2.線 性 DNA： 環(huán) 化 ， 如 DNA 形 成 連 環(huán) 分 子 ， 如 T7 DNA 1. 真 核 生 物 復(fù) 制 特 點(diǎn) ： 復(fù) 制 速 度 慢 基 因 組 較 大 ， 有 多 個(gè) 復(fù) 制 起 點(diǎn) 在 全 部 復(fù) 制 完 成 以 前 ， 起 點(diǎn) 不 開(kāi) 始 新 一 輪 復(fù) 制二 、 真 核 生

22、物 的 復(fù) 制 2. 真 核 生 物 DNA聚 合 酶 ：表 2-11 真 核 生 物 DNA聚 合 酶 的 特 性 比 較性 質(zhì) DNA聚 合 酶 DNA聚 合 酶 DNA聚 合 酶 DNA聚 合 酶 DNA聚 合 酶 亞 基 數(shù) 4 1 2 2-3 1在 細(xì) 胞 內(nèi)分 布 核 內(nèi) 核 內(nèi) 線 粒 體 核 內(nèi) 核 內(nèi) (?)功 能 DNA引 物 合 成 損 傷 修 復(fù) 線 粒 體DNA復(fù) 制 主 要 DNA復(fù)制 酶 DNA復(fù) 制 (?)3 5外切 無(wú) 無(wú) 有 有 有 5 3外切 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 無(wú) 3. 復(fù) 制 過(guò) 程 中 的 核 小體 復(fù) 制 叉 前 進(jìn) 是 核 小 體 解離 為 H32H

23、42 四 聚 體 和 H2AH2B 二 聚 體 新 合 成 的 組 蛋 白 也 被 組裝 成 H32H42 四 聚 體 和 H2AH2B 二 聚 體 舊 的 和 新 的 四 聚 體 、 二聚 體 ， 在 CAF-1因 子 的幫 助 下 ， 隨 機(jī) 地 被 組 裝到 復(fù) 制 叉 后 新 形 成 的 核小 體 中 4. 端 粒 的 復(fù) 制 ： 端 粒 (Telomere) 端 粒 是 真 核 染 色 體 的 末 端 序 列 ，富 含 G 。 主 要 由 一 串 十 分 簡(jiǎn) 單 和串 聯(lián) 重 復(fù) 的 序 列 組 成如 四 膜 蟲(chóng) ： GGGGTT 端 粒 功 能 ： 操 持 染 色 體 的 穩(wěn) 定

24、性 端 粒 酶 (Telomerase) ： 一 種 含RNA的 蛋 白 復(fù) 合 物 ， 能 使 端 粒 延伸 。 酶 所 含 的 RNA長(zhǎng) 約 150bp，是 合 成 端 粒 的 模 板 。 端 粒 酶 實(shí) 際上 是 一 種 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 。 復(fù) 制 過(guò) 程 ：a) 除 去 子 代 鏈 5端引 物b) 2.在 母 鏈 3末 端 添加 端 粒 序 列c) 3.以 新 合 成 的 端粒 序 列 為 模 板 合成 DNAd) 4.除 去 步 驟 3中 所使 用 的 引 物 ， 缺口 被 保 留 ， 但 未丟 失 DNA Elizabeth H. Blackburn Jack W. Szostak

25、 Carol W. Greider The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase 三 、 復(fù) 制 的 調(diào) 控 ：1. 復(fù) 制 原 點(diǎn) 的 甲 基 化 ： 復(fù) 制 原 點(diǎn) Ori C包 含 11個(gè) 拷 貝 的GATC序 列 ， 該 序 列 是 DAM 甲基 化 酶 的 作 用 位 點(diǎn) 。 DAM甲 基 化 酶 使 腺 嘌 呤 上 的 N6位 點(diǎn) 甲 基 化 。 復(fù) 制 前

26、， 雙 鏈 上 回 文 序 列 中 的 A都 被 甲 基 化 。 子 代 鏈 復(fù) 制 過(guò) 程 中 ，產(chǎn) 生 半 甲 基 化 DNA。 對(duì) dam - E.Coli 的 研 究 表 明 ， 半甲 基 化 的 Ori C不 能 發(fā) 動(dòng) 一 輪 新的 復(fù) 制 在 復(fù) 制 過(guò) 程 中 ， Ori C的 半 甲 基化 狀 態(tài) 約 保 留 13 min。 而 在 基 因組 其 它 區(qū) 域 的 GATC位 點(diǎn) ， 在 復(fù)制 后 1.5 min內(nèi) 即 被 甲 基 化 。 w ColEl質(zhì) 粒 DNA的 復(fù) 制 調(diào) 控 ：引 物 RNA前 體 的 轉(zhuǎn) 錄 起 始 于 復(fù) 制 起 點(diǎn) 上 游 555個(gè) 核 苷 酸

27、 處 ，需 經(jīng) RNaseH加 工 后 產(chǎn) 生 有 555個(gè) 核 苷 酸 的 引 物 ， 然 后 由DNA聚 合 酶 I在 引 物 的 3末 端 起 始 DNA合 成 。RNA1的 編 碼 區(qū) 在 引 物 RNA編 碼 區(qū) 的 5末 端 ， 轉(zhuǎn) 錄 方 向 與引 物 RNA相 反 ， 因 此 與 引 物 RNA的 5末 端 互 補(bǔ)RNA1通 過(guò) 氫 鍵 配 對(duì) 與 引 物 RNA前 體 相 互 作 用 ， 阻 止 了RNase H加 工 引 物 前 體 ， 使 其 不 能 轉(zhuǎn) 化 為 有 活 性 的 引 物而 對(duì) 復(fù) 制 起 負(fù) 調(diào) 控 作 用 。 w 當(dāng) 不 存 在 RNA 1時(shí) ，RNA引 物 前 體 形 成 自 身的 發(fā) 夾 結(jié) 構(gòu) ， 起 類 似 終止 子 的 作 用w 當(dāng) 前 體 RNA與 RNA1互補(bǔ) 配 對(duì) 時(shí) ， 類 終 止 子 效應(yīng) 消 失 ， 引 物 前 體 的 轉(zhuǎn)錄 被 繼 續(xù) ， 阻 止 了 RNase H加 工 引 物 前 體