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1、 1、細(xì)胞凋亡的一般概念 細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。 其實(shí)從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來說，細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。細(xì)胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個功能性概念，描述在一個多細(xì) 胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過程中尾部的消失伴隨大量細(xì)胞死亡，高等 哺乳類動物指間

2、蹼的消失、顎融合、視網(wǎng)膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細(xì)胞死亡的參與。 動物發(fā)育過程中存在的細(xì)胞程序性死亡是一個發(fā)育學(xué)概念，而細(xì)胞凋亡則是一個形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。但是一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個概念可以 交互使用，具有同等意義。 雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。 壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞 脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化

3、或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。 形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。 細(xì)胞凋亡的一個顯著特點(diǎn)是

4、細(xì)胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并 有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連 接部位被切斷，產(chǎn)生不同長度的寡聚核小體片段。 實(shí)驗(yàn)證明，這種DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體 DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。 細(xì)胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細(xì)胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達(dá)和某些生物大分子的合成作為調(diào)控因子。如發(fā)現(xiàn)的TFAR-19就是在

5、細(xì)胞凋亡時高表達(dá)一種分子，再如在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質(zhì)合成抑制劑即能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞Caspase （半胱天冬蛋白酶）處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，Caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡。細(xì)胞是如何準(zhǔn)確而又精確調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡呢？ 1凋亡抑制分子：迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA，IAPs，F(xiàn)LIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。 （1）P35是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結(jié)果表明P35以競爭性結(jié)合方式與靶分子形成 穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體并且抑制C

6、aspases活性，同時P35在位點(diǎn)DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與 caspase的結(jié)合更強(qiáng)，CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。（2）FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區(qū)（Prodomain）完全相同，C端長短不一。 FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結(jié)合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspa

7、se8，10募集到死亡受體復(fù)合體 和它們的起始化。 （3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitors of Apoptosis protien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細(xì)胞死亡應(yīng)答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結(jié)合它的酶原，對Caspase則即可以結(jié)合活化的，又可結(jié)合酶原，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。 （4）Bcl-2家族： 這一家族有眾多成員，根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的，如：Bcl-2、Bcl-xl、 Bcl-w、

8、Mcl-1；一類是促進(jìn)凋亡的，如：Bax、 Bak、 Bad、 Bid、 Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)，如Bid、 Bad。 Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4） ，并且通常有一個羧端跨膜結(jié)構(gòu)域。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。這些同源結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實(shí)現(xiàn)或功能調(diào)節(jié)的重要形式。 2凋亡的執(zhí)行階段 盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspa

9、se不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程，到目前為止，至少已有14種 Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。 根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細(xì)胞的加工，如Pro-IL-1和Pro-IL-1，形成有活性的IL-1和IL-1；第二類參與細(xì)胞凋亡，包括 caspase2,3,6,7,8,9.10。 參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類： 啟動酶（inititaor）和效應(yīng)酶（effector）它們分別在死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。 細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶的活化（

10、Caspase）進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程細(xì)胞凋亡的啟動是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說對細(xì)胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識還是不全面的，目前比較清楚的通路主要有： 1、死亡受體通路受體Fas、TRAILR、TNFR1及ILlR與其相應(yīng)的配體FasL、TRAIL、TNFa及IL一1結(jié)合后，相對濃度迅速升高，同時與這些受體相關(guān)的接頭分子(adaptor)FADD、TRADDFADD的相對濃度也隨之升高，從而導(dǎo)致下游信號級聯(lián)分子caspase一8、easpase一10以及caspase一3、caspase一6和c

11、aspase一7的相繼活化(表現(xiàn)為活性濃度相繼升高)，活化的caspase一3和caspase一7對DFF45的切割導(dǎo)致核酸酶DFF40的活化，活性濃度增加，從而完成對DNA的剪切引發(fā)細(xì)胞凋亡。 2、線粒體通路 線粒體是細(xì)胞生命活動控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。（1）不依賴于胱解酶的途徑 一旦受到應(yīng)激信號刺激，核酸內(nèi)切酶ENDOG便從線粒體膜間區(qū)釋放，它可誘導(dǎo)DNA片段化，而AIF可以從線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，一方面直接導(dǎo)致染色質(zhì)凝集和大片段DNA降解，另一方面促進(jìn)細(xì)胞色素C（CytC）的釋放。 （2）依賴于胱解酶的途徑 凋亡信號需要借助線粒體通路來放大

12、，而Bid(bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein)是將凋亡信號從caspase-8向線粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使。 在正常細(xì)胞中，Bid位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞表面的凋亡受體被活化后，活化的caspase-8通過剪切Bid，形成有活性的羧基端片段tBid，tBid遷移到線粒體內(nèi)，促使包括Cyt C在內(nèi)的線粒體蛋白的釋放。被釋放的Cyt C再與Apaf-1、proCaspase-9和dATP形成一種被稱之為凋亡體(Apoptosome)的復(fù)合體，該復(fù)合體二聚化后再激活caspase-9，后者回饋于非線粒體途徑，激活caspase-3和caspase-7誘導(dǎo)

13、細(xì)胞的凋亡。 3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路 許多細(xì)胞在凋亡早期會出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度(Ca2+)迅速持續(xù)的升高，從而導(dǎo)致鈣依賴磷酸酶Cn(calcineurin)對Bad去磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另外還會激活胞質(zhì)中的鈣依賴性蛋白酶calpain，calpain的過量積累會導(dǎo)致caspase-12的表達(dá)，激活的caspase-12可進(jìn)一步剪切caspase-3而引發(fā)細(xì)胞凋亡。 4、生存因子抗凋亡通路（1）神經(jīng)生長因子NGF 近年研究發(fā)現(xiàn)NGF通過其受體TrkA轉(zhuǎn)導(dǎo)NGF的抗凋亡信號，促進(jìn)神經(jīng)再生。NGF與TrkA的結(jié)合可激活PI-3激酶(PI-3K)，表現(xiàn)為PI-3K活性濃度的升高。PI-3K以胞漿絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶AktPKB為底物，活化的AktPKB活性濃度上調(diào)可使Bad的Ser136Ser112殘基磷酸化使之與Bcl-2解離，而游離的Bel-2起抗凋亡作用；同時活化的AktPKB還可磷酸化IKK，進(jìn)而激活核因子B （NF- B）引發(fā)的生存因子抗凋亡途徑。 （2 ）白細(xì)胞介素3（IL-3 ） IL-3R與IL-3結(jié)合后，(1)通過激活PI-3K，走與NGF重疊的抗凋亡信號路徑；(2)激活cAMP以及cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)，PKA使Bad磷酸化，從而促使細(xì)胞生存。