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1、課題課題2 2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一種重要的是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。農(nóng)業(yè)氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被農(nóng)被農(nóng)作物作物吸收。吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨分解成氨之后才能被之后才能被植物利用。植物利用。2 2、細(xì)菌利用尿素的原因、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兺寥乐械募?xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕改芎铣呻迕窩O(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ H+ H2 2O O + CO+ CO2 2NHNH3 33 3、常見的分解尿素的微生物、常見的分解尿素的微生物 芽孢桿菌

2、、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。尿素。4 4、課題目的、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌（一）篩選菌株（一）篩選菌株1 1、實(shí)例：、實(shí)例： DNA DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將是一種在體外將少量少量DNADNA大量復(fù)制大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（耐高溫（93930 0C C）的的D

3、NADNA聚合酶。聚合酶。啟示：啟示：尋找目的菌種時(shí)要尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：原因：因?yàn)闊崛獪囟纫驗(yàn)闊崛獪囟?07080800 0C C，淘汰了絕大多數(shù)微生，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有物只有TaqTaq細(xì)菌被篩選出來。細(xì)菌被篩選出來。 要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；包括營養(yǎng)、生理、生長條件等； 方法：方法：抑制大多數(shù)微生物不能生長；造成有抑制大多數(shù)微生物不能生長；造成有利于該菌生長的環(huán)境，利于該菌生長的環(huán)境， 結(jié)果：結(jié)果：培養(yǎng)

4、一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。平板稀釋等方法對它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2 2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理： 人為提供有利于人為提供有利于目的菌株目的菌株生長的條件生長的條件( (包括營養(yǎng)、包括營養(yǎng)、溫度、溫度、pHpH等等) )，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。15.0g15.0g瓊脂瓊脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH

5、2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的氮源為尿素氮源為尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受

6、到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4 4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理1 1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：、顯微鏡直接計(jì)數(shù)： 利用利用血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。品中微生物的數(shù)量。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目： 不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)；不適于對運(yùn)動細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度；需要相對高的細(xì)菌濃度； 個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)缺點(diǎn)2.2.

7、間接計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）活菌計(jì)數(shù)法） 原理：原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，落數(shù)，V V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)(ml)，M M代表稀釋

8、倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在3030300300的的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值可將為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個或三同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在5050個左個左右為最好

9、。右為最好。計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法比濁法比濁法膜過濾法膜過濾法例題：例題：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有（統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有（ ）A.A. B. B. C.C. D. D.涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法比濁法比濁法 生理指標(biāo)法生理指標(biāo)法 膜過濾法膜過濾法 設(shè)置對照的主要目的設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。 實(shí)例：實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A A同學(xué)從對應(yīng)的同學(xué)

10、從對應(yīng)的10106 6倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約出大約150150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約選擇出大約5050個菌落。分析其原因。個菌落。分析其原因。 原因：原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤( (或或者是混入了其他的含氮物質(zhì)者是混入了其他的含氮物質(zhì)) ) （三）設(shè)置對照：（三）設(shè)置對照： 小結(jié)：小結(jié)：通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服通過這個事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。力，對照的設(shè)置是必不可少的。 方案一：方案一：由其他同學(xué)用與由其他同學(xué)用與A A

11、同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：方案二：將將A A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。染。 結(jié)果預(yù)測：結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與如果結(jié)果與A A同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明A A無誤；無誤；如果結(jié)果不同，則證明如果結(jié)果不同，則證明A A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。配制有問題。（一）土壤取樣（一）土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事

12、先準(zhǔn)備好的信封中。左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：（二）制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。應(yīng)在火焰旁稱取土壤應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行分離不同的微生物采用不同的稀釋度分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在目的：保證獲得菌落數(shù)在303030030

13、0之間、適于計(jì)數(shù)的平板之間、適于計(jì)數(shù)的平板（三）樣品的稀釋（三）樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 原因：原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 1852 185萬，放線菌數(shù)約為萬，放線菌數(shù)約為477477

14、萬，萬，霉菌數(shù)約為霉菌數(shù)約為23.123.1萬。萬。 結(jié)論：結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。培養(yǎng)的條件。（四）取樣涂布（四）取樣涂布實(shí)驗(yàn)時(shí)要對培實(shí)驗(yàn)時(shí)要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。度、培養(yǎng)物等。如果得到了如果得到了2 2個或個或2 2個以上菌落數(shù)目在個以上菌落數(shù)目在3030300300的平板，的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如則說明稀釋操作比較成功

15、，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。，需要重新實(shí)驗(yàn)。（五）微生物的培養(yǎng)與觀察（五）微生物的培養(yǎng)與觀察 在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：細(xì)菌：30303737培養(yǎng)培養(yǎng)1 12d2d 放線菌：放線菌

16、：25252828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)3 34d4d。微生物的微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)與觀察 1. 1.通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2. 2.提示：選擇每個平板上長有提示：選擇每個平板上長有3030030300個菌落的個菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重

17、復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。實(shí)驗(yàn)不精確。操作提示操作提示 無菌操作無菌操作 做好標(biāo)記做好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間規(guī)劃時(shí)間 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PHPH升高，指示劑將變紅，說升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素明該細(xì)菌能夠分解尿素。 測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán)伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌培養(yǎng)

18、基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂紅美藍(lán)瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本課題知識小結(jié)本課題知識小結(jié): :1.1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B. B.至少接種一種細(xì)菌至少接種一種細(xì)菌 C.C.接種一個細(xì)菌接種一個細(xì)菌 D. D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.2.能合成脲酶的微

19、生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素AD3.3.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（ ） A.A.科學(xué)家從科學(xué)家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5 5個平板的菌落數(shù)依次為個平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.C.設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。種類最多。B