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1、幾種浮游植物檢測方法研究 分類號―― 密級 UDC 編號 廈 門 大 學(xué) 博士后研究工作報告 幾種浮游植物檢測方法的研究 StudiesonDetection ofseveral

2、 Approaches phytoplanktons 孟海軍 201 報告提交日期 1年2月 廈門大學(xué) 2011年2月

3、 題名頁 幾種浮游植物檢測方法的研究 on StudiesDetection ofseveral Approaches phytoplanktons 博士后姓名 孟海軍 流動站 一級學(xué)科 名稱環(huán)境科學(xué)與工程 專業(yè) 二級學(xué)科 名稱環(huán)

4、境科學(xué) 研究工作起始時間2006年8月01日 研究工作期滿時間2010年11月 廈門大學(xué) 201 1年2月 廈門大學(xué)博士后研究工作報告著作權(quán)使用聲明 本人完全了解廈門大學(xué)有關(guān)保留、使用博士后研究工作報告的規(guī) 定。廈門大學(xué)有權(quán)保留并向國家主管部門或其指定機構(gòu)送交該報告的 紙質(zhì)版和電子版，

5、有權(quán)將該報告用于非贏利目的的少量復(fù)制并允許該 報告進入學(xué)校圖書館被查閱，有權(quán)將該報告的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進 行檢索，有權(quán)將博士后研究工作報告的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的 博士后研究工作報告在解密后適用本規(guī)定。 本研究報告屬于： l、保密 ，2、不保密 兮7 紙本在年解密后適用本授權(quán)書； 電子版在年解密后適用本授權(quán)書。 請在以上相應(yīng)括號內(nèi)打“4” 作者簽名；芻沏暈 日期乙I&1月．。日

6、 ≯I土’f’ 日期：碡胡甲 目錄 第一章前言…………………………………………………………1 1．1常規(guī)的赤潮生物檢測技術(shù)………………………………………………2 1．1．1 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡檢測技術(shù)…………………………………．．2 1．1．2流式細胞技檢測技術(shù) FCM …………………．……………………3

7、 1．1．3基于色素的檢測技術(shù)……………………………………………．．3 1．2分子水平的檢測技術(shù)．………………………………………………．4 1．2．1 基于rDNA的分子檢測技術(shù)…………………………………………5 1．2．1．1寡核苷酸探針雜交技術(shù)…………………………………………．．7 熒光原位雜交技術(shù)………………………………………………7 三明治雜交技術(shù)……………．．…．……………………………．．8 1．2．1．2其他的DNA標(biāo)記技術(shù)…………．…………………………．

8、．．．．．…9 1．2．2基于蛋白質(zhì)的免疫熒光檢測技術(shù)．………．．．．………………………．11 1．2．3 I ectin探針…………………………………………………．．12 1．3自動化的赤潮藻檢測技術(shù)……………………………………………．13 第二章三種藻的SEM觀察結(jié)果……………………………………………．15 2．1材料與方法……………………………．…………………………．15 2．1．1 樣品采集、固定、觀察及培養(yǎng)．…．…．……………………………．．15 2．1．2樣品處理程序…………………．……………

9、…………．……．16 2．1．2．1玻片處理…………………………………………．…．……16 2．1．2．2樣品脫水處理…………………………………………．……16 2．1．3電鏡觀察方法…………………………………………………17 2．2結(jié)果與討論………………………………………………………．．17 2．2．1 纖小裸甲藻固定方法的比較．………………………………………17 2．2．4纖小裸甲藻的形態(tài)和體表線紋觀察結(jié)果………………………………18 2．2．5兩種青綠藻的形態(tài)觀察結(jié)果．………………………………

10、………21 第三章SSR與PCNA標(biāo)記的開發(fā)……………………………………………23 3．1材料和方法………………………………………………………．．23 3．1．1材料………………………………．…………………………23 3．1．2 PC的配置……………………………………………………．．23 3．1．3 MISA aicroSAte|lite tooIs 使用環(huán)境的建立及使用…………………．．23 3．1．4．1

11、 ActiveperI引擎的建立………………………………………．．23 PerI 3．1．4．2 SCFipt5．0的安裝及使用………………．…………………．23 3．1．4 Spurnik的使用方法……………………………………………．．25 3．1．5序列比對和拼接工具……………………………………………．26 3．1．6引物和探針設(shè)計………………………．………………………．26 3．1．8 PCR擴增反應(yīng)體系：……………

12、…．…………．…………………26 3．2結(jié)果與討論…………………………．………………………．……27 3．2．1PCNA標(biāo)記的開發(fā)……………．…………………………………．27 3．2．1．1 PCNA標(biāo)記開發(fā)的原理………．．．……………………………．…．27 3．2．1．2PCNA標(biāo)記開發(fā)的過程．………．……．…………．………………．29 3．2．2SSR標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用………………………………．．．…………34 3．2．2．1序列的獲取與預(yù)處理……………………………………………34

13、 3．2．2．2不同軟件效率的比較……………………………………………35 3．2．2．3 SSR的出現(xiàn)頻率…………．，………………………．…………．35 3．2．2．4各類SSR的分布規(guī)律……………………………………………36 3．3討論……………………………………………………………．．37 Il 參考文獻……………………………………………………………．39 致謝………………………………………………………………．47 附

14、錄………………………………………………………………．．柏 III 第一章 前言 赤潮 RedTide ，從廣義上講，指的是在某種海域環(huán)境條件下，一些單細 胞浮游生物爆發(fā)性繁殖，引起水色異常的生態(tài)現(xiàn)象。它不一定有毒或有害。日常 生活中，狹義上的赤潮主要指的是對環(huán)境有毒或有害的一種浮游生物爆發(fā)性繁殖

15、 Bloom， 的生態(tài)現(xiàn)象。這種赤潮有一個準(zhǔn)確的名稱叫做有害藻水華 Harmful Algal HAB 。在特定的條件下，幾乎所有藻都能發(fā)生藻華，大多數(shù)藻華都是無毒或無 害的。但有些種類藻華能產(chǎn)生毒素，危害附近生活的其他生物，甚至通過食物鏈 威脅到人類和更多的其他生物。還有一些雖然不產(chǎn)生毒素，但是其生物量累積到 一定程度時，能對環(huán)境起到極大的危害作用。例如太湖近年頻頻發(fā)生的藍藻藻華， 藍藻無毒，藍藻藻華能污染水源，降低水中

16、含氧量，是魚類死亡。這兩種藻華統(tǒng) 稱為有害藻水華 赤潮 。 有很多種因素能導(dǎo)致赤潮的發(fā)生，具體的機制尚未研究清楚。近年來隨著環(huán) 境污染日益加重，大量營養(yǎng)鹽流入大海，導(dǎo)致近海富營養(yǎng)化同益明顯，赤潮的爆 發(fā)的頻率的規(guī)模呈現(xiàn)急劇擴大的趨勢。同時人類對環(huán)境監(jiān)測重視程度的提高，有 關(guān)赤潮爆發(fā)的報道越來越頻繁，赤潮這種海洋生念現(xiàn)象越來越為公眾所熟知。我 國近海是赤潮的高發(fā)地，近年來赤潮發(fā)生的次數(shù)和規(guī)模也呈現(xiàn)增長趨勢，給海水 養(yǎng)殖業(yè)、海洋環(huán)境乃至人們的健康與安全帶來了極大的威脅 易曉蕾，2003，周 名江等，2001，2003 。

17、 為了減少赤潮帶來的危害，人們開發(fā)了許多技術(shù)來監(jiān)測赤潮，希望能盡快的 了解發(fā)生藻華的藻的種類，以判明該藻華是否有害。赤潮生物檢測技術(shù)的研究也 etaL，1998；Mudie 就成為赤潮監(jiān)測的重要內(nèi)容 Kim etaL，2002 。早期的檢測 技術(shù)主要是基于形態(tài)和結(jié)構(gòu)分類學(xué)開發(fā)的技術(shù)，如顯微鏡和電子顯微鏡檢測等。 由于赤潮生物形態(tài)的相似性和復(fù)雜性，這些技術(shù)在實際應(yīng)用中存在困難，無法準(zhǔn) 確的檢測。例如一些形態(tài)學(xué)上非常相近的種類

18、和變種或形態(tài)學(xué)相似的但生理功能 不同的種類，這些利用光學(xué)顯微鏡就很難分辨出來。隨著科技的快速發(fā)展，赤潮 生物檢測技術(shù)也出現(xiàn)了巨大的進步，例如隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開發(fā)了分 子檢測技術(shù)。分子檢測技術(shù)和自動化技術(shù)的結(jié)合，又出現(xiàn)了自動化檢測技術(shù)。 1．1常規(guī)的赤潮生物檢測技術(shù) 目標(biāo)藻種類的鑒定和生物量的確定赤潮藻檢測的兩大基本任務(wù)。種類的鑒定 是定性檢測，能提供赤潮藻危害的性質(zhì)。而生物密度和生物量是赤潮發(fā)生和生長 的重要指標(biāo)，它是赤潮發(fā)生、發(fā)展、消亡以及赤潮規(guī)模最直接的證據(jù)，同時也是 衡量細胞生長和生理活性的重要指標(biāo)。相關(guān)

19、的目前，我國基本上是采用顯微鏡檢 測的方法來檢測藻，輔以細胞計數(shù)方法來監(jiān)測赤潮生物密度和生物量，從而對目 標(biāo)藻進行定性和定量的分析。近年來開發(fā)的一些分子檢測技術(shù)中，分子技術(shù)也只 能進行定性檢測，定量通常還是采用細胞計數(shù)的方法。經(jīng)典的細胞計數(shù)方法如顯 微鏡計數(shù)比較耗時費力，于是開發(fā)了基于分光光度法的技術(shù)方法，例如胡先文 2001 曾將這種方法用于魚腥藻水華的細胞密度檢測。其他類似的細胞計數(shù)方 et

20、 a1．，1998 法也有一些，如庫爾特計數(shù)、FlowCAM計數(shù)和流式細胞計數(shù) Sieracki 等方法，這些技術(shù)中，流式細胞計數(shù)相對常見。 色素技術(shù)也常在赤潮監(jiān)測中。例如選用簡單、快速的葉綠素a來表征浮游植 et a1．，1978 ，同時借助吸收光譜的差異還可以區(qū)分不 物的碳生物量 Sieburth

21、 et 同的浮游植物類群 KoehneaL，1999 ?，F(xiàn)場熒光檢測可以用于現(xiàn)場的連續(xù)快 速測定。然而，此方法受赤潮藻類光合色素組成變化的影響，只能把浮游植物分 為幾個大類群，進行初步定性，藻的準(zhǔn)確檢測還需其他的技術(shù)。 1．1．1光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡檢測技術(shù) 光學(xué)顯微鏡檢測是最傳統(tǒng)的赤潮生物樣品檢測分析方法。這種檢測技術(shù)是一 種基于藻的形態(tài)學(xué)特征，鑒定藻的種類的一種方法。它輔以細胞計數(shù)板進行密度 eta

22、L，1 計數(shù)，它在藻的鑒定及定量方面一直發(fā)揮著重要的作用 Hallegraeff995 ， 直到現(xiàn)在它還在廣泛應(yīng)用，通常人們把它當(dāng)作驗證其他新型赤潮生物檢測手段準(zhǔn) 確性的基本方法和技術(shù)保證。然而，顯微鏡檢測技術(shù)要求檢測人員有豐富的藻類 分類學(xué)知識，要求很高，同時費時費力，速度緩慢。而且顯微鏡觀察不能區(qū)分赤 潮生物中形態(tài)相似的種類以及有毒和無毒的種類，也難以辨別不同生理狀態(tài)的赤 潮細胞如死細胞和活細胞等。因此慢慢的被新技術(shù)所替代。 2

23、 etal，1 etal，1 潮藻的研究和鑒定方面 Berdach977；Pichett-Heaps980 。電 鏡的分辨率藻遠大于光學(xué)顯微鏡，在一些藻的鑒定方面有著不可替代的作用，然 而電鏡樣品需要復(fù)雜的預(yù)處理過程，比較耗時。而且處理過程中樣品大量損失， 很難定量。這些缺點限制了其在現(xiàn)場赤潮生物樣品檢測中的實際應(yīng)用。 1．1．2流式細胞技檢測技術(shù) FCM 流式細胞術(shù)是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，海洋浮游植物的檢測方面也有廣泛的應(yīng)

24、 etaL，1991 o其工作原理是：將待測樣品的 用 JonkeretaL，1995；Chisholm 細胞制備成單細胞懸液，利用細胞的自發(fā)熒光，或?qū)毎捎锰禺愋詿晒馓结槝?biāo) 記后，在一定的流速和鞘液的約束下，使細胞液柱以單個排列的方式通過激光檢 測器。細胞液柱與檢測器中入射的激發(fā)光垂直相交，通過測量其散射光 含前相散 射光和側(cè)相散射光 、細胞自發(fā)熒光、染料染色的熒光及探針標(biāo)記的熒光 包括免 疫熒光探針、核酸和肽核酸探針等 ，從

25、而將特征目標(biāo)生物、和背景顆粒及噪音區(qū) 分開。流式細胞儀可測量待測目標(biāo)的粒徑、光學(xué)性質(zhì)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、 蛋白質(zhì)和抗原等，也能對其進行準(zhǔn)確的分類和收集，以達到分選的目的 侯建軍， 998 總結(jié)認為，藻細胞形態(tài)、大小以 2006 。流式細胞技術(shù)也有缺點。Fuchs 1 及生理生化特性會隨環(huán)境條件改變而發(fā)生改變，這將影響流式細胞儀的檢測基 礎(chǔ)，并進而影響流式細胞術(shù)對靶生物細胞的正確區(qū)分和識別。流式細胞儀不能有 效地識別熒光標(biāo)記信號過弱的目標(biāo)細胞，存在漏計的可能。

26、此外過高儀器成本和 et 工作成本工作條也是個大缺點 ChenaL，2003 。這些情況限制了流式細胞技 術(shù)在赤潮監(jiān)測中的廣泛應(yīng)用。 1．1．3基于色素的檢測技術(shù) 浮游生物種類繁多，生化和代謝途徑差異很大，其中一些產(chǎn)物可用來作為生 化標(biāo)記物，用于分類學(xué)。其中光合色素因其特異性和檢測的便利性而最為理想 etaL，1 Jeffrey 997 。光合色素根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為三大類：葉綠素類、類胡

27、 3 蘿卜素類、藻膽蛋白類。每類中又有諸多分類，例如參與光合反應(yīng)過程的葉綠素 et 有三十種；而浮游生物中各種類胡蘿卜素超過600種 Liaaen．Jensena，， 1985 。不同浮游植物含有光合色素種類有巨大差別，不同光合色素含量也不盡 相同。這樣浮游植物的光合色素組成和某些光合色素比值都可以作為很好的化學(xué) 分類學(xué)指標(biāo)，用來表征具有海洋學(xué)和分類學(xué)意義的浮游藻類群落組成和生物量。 這些數(shù)據(jù)可以

28、用HPLC技術(shù)快速方便的檢測?，F(xiàn)在，HPLC進行一次運行便可以 eta1．，1 分離出50余種光合色素及其衍生物 Hodgson997 。這種技術(shù)在赤潮的 etaL，1991；ChoetaL，1999，2001； 檢測方面也有諸多應(yīng)用實例 Hallegraeff Latasaet et aL，2004；Takishita

29、 aL，2004 。 基于HPLC的光合色素分析技術(shù)，能夠有效地進行大量的現(xiàn)場樣品分析，即 使在樣品處理中存在著過濾產(chǎn)生的損失或處理過程中導(dǎo)致的樣品破壞等問題，從 HPLC光合色素產(chǎn)生信號峰的差異仍然能辨析出其種類組成。這種分類手段能在 藻綱一級的分類水平進行較好的分類。某些形態(tài)上相似的種類，可能在光合色素 et 等生物標(biāo)志物上存在差異，從而可以進行有效地鑒定 Wrightal。，1996 。

30、 應(yīng)用光合色素作檢測赤潮，最大的缺點是分辨率較低，它能在藻綱一級的分 類水平進行較好的分類，尚不能完全實現(xiàn)屬和種之間的準(zhǔn)確分類。此外，環(huán)境及 細胞生長狀態(tài)，對結(jié)果也有影響。這需要進行較多的校J下工作才能確保分類結(jié)果 的準(zhǔn)確性和可靠性。 1．2分子水平的檢測技術(shù) 分子檢測技術(shù)指的是基于DNA、蛋白質(zhì)的一種檢測技術(shù)。它的原理是不同物 種，甚至不同個體在基因組大小、DNA的堿基組成、蛋白質(zhì)種類方面都存在差 別。而這些能較容易的被識別出來，而且較形念學(xué)特征提供的信息更多，能解決

31、 et et af．，2005；Gontcharova／．，2005；Kawai 很多傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)的難題 Chan ef aL，2005 。DNA的堿基組成，也就是基因組的一級結(jié)構(gòu)是最基本的分類基礎(chǔ)。 基因組的一級結(jié)構(gòu)上的相似性也就成了分類學(xué)最常用的指標(biāo)了。一般認為當(dāng) on Reconcili

32、ationof toBacterial Approach Systematics 就可認為屬于同一種基因 4 型。但是，這樣全面的DNA組成信息很難獲得和闡釋，通常是不切實際的。近 年來，分子技術(shù)一般是通過比較分析基因組中單個基因的序列來推斷微型生物之 間的進化關(guān)系。對海洋微型浮游生物群落進行分子進化研究常用的基因序列包括 核糖體rRNA基因序列和一些功能基因序列，也有使用一些不依賴rDNA的分子 標(biāo)記技術(shù)。 1．2．1基于

33、rDNA的分子檢測技術(shù) 核糖體rDNA基因序列按其分子量來分，分為三個亞基：真核生物有 在基因組中基因成簇排列在一起組成一個轉(zhuǎn)錄單位。其中18S／16S稱為小亞基 small subunit，LSU 。這兩 subunit，SSU ，23S／28S稱為大亞基 1arge 個亞基在分子鑒定中使用最廣。其他如5S和轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū) ITS區(qū)．Internal Transcribed rRNA基因和5．8SrRNA基因之間的區(qū)域I

34、TS2和 Spacer，即SSU 5．8S rRNA基因和LSUrRNA基因之間的區(qū)域ITS2 也有人使用 OIsenetaL。 1986，VolkeretaL，1983 。 rRNA作為分子鑒定基礎(chǔ)，是因為它有以下特點 1 rRNA作為蛋白合成機 器的關(guān)鍵元件，在所有生物中存在，具有功能和進化上的同源性，它的分子極端 保守，核苷酸序列也相對保守。例如，SSUrRNA基因中存在保守區(qū)和高變區(qū)， 這兩個區(qū)域進化速率不同，使得他們在不同物種中，有的表現(xiàn)保守，有的表現(xiàn)不 保守。保守區(qū)是指在親緣關(guān)

35、系較遠的生物類群 如動植物 之間比較，其大分子 rRNA基因某一段序列中發(fā)生的核苷酸變異較少 例如序列相似性在90％以 上 。此區(qū)域反映了生物在進化上的同源性，主要用于親緣關(guān)系較遠的物種問系 et 統(tǒng)進化關(guān)系分析的依據(jù) Lenaersa1．，1 989 。這個特點非常實用。人們利用SSU rRNA兩端的較為保守的核苷酸序列，設(shè)計和應(yīng)用通用的引物來擴增微型生物群 落中生物的SSU

36、et rRNA分子 Stocka1．，1992 。而高變區(qū)恰恰相反，即使在 親緣關(guān)系十分接近的物種間比較，這些區(qū)域也存在核苷酸差異，而且，這些差異 會隨著比較物種的親緣關(guān)系的疏遠而迅速擴大，并伴隨著核苷酸的插入或缺失。 這個特點可以用來鑒定或區(qū)分不同種屬，甚至不同株系的生物。LSUrRNA也有 類似特點，它有12個高變區(qū)和相應(yīng)的保守區(qū)，使得通過保守引物來擴增LSU 5 et rRNA成為可能 Mic

37、hot 從各種生物中獲得，這樣使用保守的引物，就能分離微型生物群落中幾乎所有的 微型生物。 3 rRNA基因不能在同代生物之間的轉(zhuǎn)移，因此rRNA之間的關(guān)系 反映了生物之間的進化關(guān)系，rRNA可以提供充分的序列信息來進行統(tǒng)計分析。 現(xiàn)在，人們已經(jīng)建立了多個rRNA序列數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)進化樹，使得快速鑒定成為 et et 986 。 可能 Ludwiga1．，2004；Olsena1．，1 由于如前所述的rRNA特質(zhì)，人們通常分離出與之互補的基因組序7UrDNA， 設(shè)計特異

38、的寡核苷酸探針，就可以用于赤潮藻的分子鑒定。國際上通常采用ITS 區(qū)作為各種生物類群屬種間分類和系統(tǒng)研究的區(qū)域，也是設(shè)計探針的首選區(qū)域 etaL，1994；Andersoneta1．，1 8S、28S Adachi 999 。1 rDNA，其結(jié)構(gòu)具有 保守區(qū)與高變區(qū)鑲嵌的特點，在研究生物不同類群時，也可采用不同的區(qū)域來作 et

39、 為分析比較的區(qū)域，是分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生方面廣泛使用的分子依據(jù) Friedrich a『．，1997；Adachi etaL，1997；AndersonetaL，1999； etaL，1994；Cangelosi RubleeetaL，1999 。 寡核苷酸探針通常長約16．24bp，由于每個堿基對有四種可能 A、T、G、 C ，所以一段16至24個堿基的寡核苷酸有4294967296．1XXXXXXXXXX76種 般的浮游生物基因組都大。也就是說，是特異性的序列。找

40、到這么一段序列，合 成互補的寡核苷酸探針，通過分子雜交就能特異性識別目的生物。 寡核苷酸探針根據(jù)其分子主鏈骨架的成分可以分為兩種，一種是有核苷酸或 脫氧核苷酸構(gòu)成的DNA或RNA寡核苷酸探針。還有一類是基于肽核酸 peptide nucleic efa，．，1993；Nielsen 性結(jié)合形成雜交分子PNNDNA或PNA／RNA，這種雜交結(jié)合力及特異性比相應(yīng)的 et DNA與DNA結(jié)合要高 KimaL，1993 ，不易被酶降解，表現(xiàn)較DNA探針穩(wěn)定 Francois

41、 性更高，是非常有前景的探針工具 KimetaL，1993；WagneretaL，2003 。 6 1．2．1．1寡核苷酸探針雜交技術(shù) 寡核苷酸探針在藻類檢測上應(yīng)用很廣，發(fā)展出了多種檢測體系。除了最新的 全自動檢測儀一ESP 環(huán)境樣品處理器 常用的有以下兩種： 熒光原位雜交技術(shù) insitu 熒光原位雜交 fluorescence 交方法，它采用熒光標(biāo)記的探針在細胞內(nèi)與特異性互補的核酸序列雜交，在

42、保持 細胞形態(tài)完整的狀態(tài)下，通過光學(xué)顯微鏡檢測細胞內(nèi)的目的位點。它具有以下優(yōu) 點：熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全，實驗周期短、特異性好、定位準(zhǔn)確；能方便的 進行光學(xué)和熒光檢測；多色FISH通過在同一個細胞中顯示不同的顏色，可同時檢 et 測多個目標(biāo)。因此它在赤潮檢測和赤潮生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 Groben et aL，2005；Kim a1．，20

43、05；王愛杰等，2004 。 FISH在藻類檢測上有大量的成功實例。例如，美國Scholin應(yīng)用這項技術(shù)取 得了一系列的成功。1996，Scholin等以大片段rRNA LSUrRNA 作為目標(biāo)序列設(shè) 計寡核苷酸探針對硅藻類的擬菱形藻 Pseudo-nitzschia 進行了鑒定。之后， 應(yīng)用該技術(shù)在Louisiana沿岸，AtlanticCanadian沿岸，NewZealand海域， Dutch Parsonset et a1．，1999；1999；Rho

44、desa1．，1998 。在廈門海域，鏈狀 和A um如海洋原甲藻 P．micans ， pseudo-gonyaulax以及其他三種非Alexandri Amphidiniumcarterae和Heterocapsa分離開來 侯建軍等，2006 。 7 三明治雜交技術(shù) 三明治雜交 Sandwich hybridisatinassay 技術(shù)是一

45、種基于DNA雜交的一 種技術(shù)。它需要將細胞裂解，釋放出細胞內(nèi)容物，先后與兩種探針雜交來完成 雜交過程。其中一個探針叫捕獲探針“captureprobe”，它帶有一個生物素基團， 通過鏈霉和素固定在玻片等固相支持物上，從而結(jié)合并固定細胞裂解物中的目 的rRNA分子。然后加入含有含有熒光標(biāo)記的信號探針，從而形成三明治式雜交 復(fù)合物。這種復(fù)合物在通過辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，形成藍色的有色的產(chǎn)物， 有色的產(chǎn)物的濃度與目的分子數(shù)有一定的相關(guān)性，通過分光光度計可以檢測出目 的分子數(shù)目。 Scholin

46、 etal．，2001 ． etaL，1996，1997，1999；Tyrrell 以三明治雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，人們開發(fā)了以96孔平板或寡核苷酸基因玻璃芯 片 Chips 為特征的自動化檢測技術(shù)。并成功的用于Pseudo．Nitzschia、 et Heterosigma等赤潮藻的檢測工作中Scholinetal．，1996，1997，1999：Tyrrell

47、 a1．，2001，2002 。這種方法快速、簡便，并能實現(xiàn)高通量和自動化，不受檢 測環(huán)境的影響，對不同細胞周期的藻類甚至藻類的孢子也能直接進行檢鋇lJ Bolch， 2001 ，是最具有發(fā)展前景的技術(shù)之一。但是這種方法在檢測時，無法同時提供 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征，可靠性較FISH低。 8 of in Detection Sample

48、 TargetSpecies Homogenates 三明治雜交檢測技術(shù)的原理圖 Aderson’presentation，2006 The ofsandwich principle hybridizationassay 1．2．1．2其他的DNA標(biāo)記技術(shù) RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphism 限制性片段長度多態(tài) ified 性，AFL

49、P AmplFragmentLengthPolymorphism 擴增的限制性片長度多 ite 態(tài)性段、微衛(wèi)星DNA MicmsatellDNA ，等分子標(biāo)記技術(shù)在藻類的鑒定上也 有廣泛的應(yīng)用。Kamikawa等 2008 用線粒體分子標(biāo)記能夠有效區(qū)分A． pseudogonyaulax等6種亞歷山大藻。 SSR是近年來發(fā)展較快、應(yīng)用較廣的一項分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。SSR，又可叫 對長的單元組成 Vogt，1990 。在原核生物和真核生物，甚至在最小的細菌基 因組中都曾發(fā)現(xiàn)過。在真

50、核生物基因組中，它的含量非常豐富，是基因組的主要 組分之一。 et SSRs在遺傳上不太穩(wěn)定 Totha1．。2000 。人們建立了兩種模型被用來解釋 SSRs的產(chǎn)生及其不穩(wěn)定性。第一種被稱作DNA聚合酶滑動理論。這種理論認為 O 解離會導(dǎo)致堿基錯配，從而產(chǎn)生重復(fù)，人們形象的稱之 andSutherland1994 。在DNA的“滑動"之后，

51、如果 為“滑動" Richards and 有“發(fā)卡"，三鏈等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，或發(fā)生了DNA重排就會固定下來 Peamon Sinden，1998；Sinden，1999 。目前有部分試驗結(jié)果支持這一模型，然而也有結(jié) andWells 1

52、999 。另 果顯示同源重組會使SSRs遺傳穩(wěn)定性變差 Jakupciak 一種理論則認為DNA復(fù)制時，微衛(wèi)星位點易于發(fā)生錯配，使同源的位點問發(fā)生 Gutman1 and 不對稱交換，而發(fā)生變異 Levinson 987 。 SSRs在基因組上分布非常廣泛。依目前的試驗結(jié)果來看，無論是蛋白質(zhì)編 碼區(qū)還是非編碼區(qū)都有相當(dāng)數(shù)目的SSRs，但在真核生物中外顯子中的SSRs數(shù)

53、 et 目卻少于非編碼區(qū)域的SSRs Totha1．，2000 。如線蟲基因組中外顯子中的 SSRs數(shù)目只占所有SSRs的25％。在雙殼類生物的基因組中，外顯子每Mb堿 基對中有85個微衛(wèi)星位點，而內(nèi)含子每Mb堿基對中有245個 Cruzeta1．。2005 。 et 不同物種也表現(xiàn)出對SSRs種類的偏好 TautZa1．。1994 。有人曾做過比較，在 人，果蠅，擬南芥，線蟲和酵母五種生物中，單核苷酸重復(fù)分別為每

54、Mb堿基對 et 55，35，40個位點。微衛(wèi)星的總體含量和物種基因組的大小也密切相關(guān) Katti o a1．，2001 十多年前人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于真核基因組的SSRs有著高度的多態(tài) et 性 Fischera1．，2000 ，SSR標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用基因定位，遺傳圖譜，遺傳 鑒定，物種進化／演化分析等諸多領(lǐng)域。在柑橘中，SSR標(biāo)記已用于構(gòu)建遺傳連 鎖

55、圖譜，有性繁殖種苗或體細胞雜種鑒定，資源評價，遺傳變異分析，物種進化 et et et a1．，：Corazza．Nunes a1．，2003 。 ／演化分析 2003；Ruiz a1．，2002；Pang et eta1．，2005 。 各物種開發(fā)

56、的SSR標(biāo)記更是以萬計 Matsuokaa1．，2002；Cheng et 盡管目前己開發(fā)了大量的SSR，但仍未完全滿足需求 Hea1．。2003 。 長期以來，SSR在高等生物中應(yīng)用非常廣泛，在藻類中的應(yīng)用相對遲緩。由 于微衛(wèi)星的多態(tài)性以及靈敏度大大超過了rDNA序列或RFLP等以DNA為基礎(chǔ)的分 子標(biāo)記。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已引起赤潮界的高度關(guān)注。Rynearson等 2000 對同一海域不同地點采集的4組硅藻樣品進行了區(qū)域群體的微衛(wèi)星分析

57、。Evan等 10 2004 對尖刺擬菱形藻 Pseuddonitzschia laantique的研究。王東東等 2007 將微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于針胞藻綱Chattonel 2008 用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，對3種7株亞歷山大藻進行遺傳分析．。 此外AP-PCR arbitraryprimed amplified PCR 、DNA DNA

58、 amplifying ribosomalDNArestriction amplified analysis，ARDRA 、變性梯度凝膠電泳 denatunnggradientgel Bruinet et 物進行生態(tài)學(xué)及分類學(xué)等研究 de aL，2003；QinaL，2004； Grobenet et aL，2005；N

59、ot aL，2007 。Judge等 1993 用RFLP分析了全球 大藻開發(fā)了分子標(biāo)記。Penna等 2000 采用PCR和固相免疫測定法，通過對 ITS和5．8SrDNA區(qū)的序列分析，鑒定了人工培養(yǎng)和海水樣品中不同種類的亞歷 toxicus的18SrDNA與其它 山大藻。Sako等 1996 對，將甲藻Gambierdiscus 細胞雜交技術(shù)和三明治雜交對Pseudo-nitzschiaaustralis進行

60、了鑒定。Bornet 等 2005 采用特異性的分子標(biāo)記技術(shù)ISSR intersimplesequencerepeat 擴增和 基于RAPD技術(shù)的SCAR標(biāo)記區(qū)域分析，分類、鑒定了兩種來自法國海域的有 毒赤潮種類，包括硅藻中擬菱形藻 Pseudo-nitzschia 狀亞歷山大藻 A 綠藻類的小球藻 Chlorella vulgaris 藻株之間的分類差異進行了比較。 等 2000 采用ARDRA結(jié)合傳統(tǒng)方法研究了海洋藍細菌的多樣性及其類群組成， 菌和浮游植物的群落動態(tài)。 1

61、．2．2基于蛋白質(zhì)的免疫熒光檢測技術(shù) 蛋白質(zhì)電泳也是進行分子檢測的一項基礎(chǔ)工具。不同物種，株系蛋白質(zhì)表達 存在差別，通過雙向電泳，比較蛋白種類或表達的差異，就能鑒定不同的赤潮藻。 ll 這種技術(shù)在對于形態(tài)學(xué)上非常相近的種類或者變種，如塔瑪亞歷山大藻 Alexandrium 但生理功能不同的種類，如尖刺擬菱形藻 Pseudo-nitzschia pungens 存在

62、的 產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒的兩個變種，的檢測方面有獨特的優(yōu)勢。Chan等 2004 采用雙向 電泳圖譜分析技術(shù)對本地和國外的赤潮原因種海洋原甲藻 P．micans ，微小原甲 藻 P．minimum ， 斯氏藻 Scrippsiellatrochoidea ，KareniaIongicanalis，Kdig『fata，米氏凱倫藻 Kmikimotol『 以及短凱倫藻 K 者應(yīng)歸為同種藻。 抗原、抗體之間的高度特異性反應(yīng)也能用于赤潮藻的分子檢測。將抗體進行 直接或間接熒光標(biāo)記就成為免疫熒光探針檢測技術(shù)，由于特異性高廣泛應(yīng)用于赤

63、 潮生物進行分類、識別等諸多領(lǐng)域 Vrieling etaL，1989， anophagefferens，凱倫藻和一些裸甲藻也有成功的報道 Anderson etaL，19961 et aL，1994，1995，1996； 1993；Vrielinge Vrielinge 1．2．3I ecti n探針 Lec

64、tin 細胞凝集素 是一類非酶泌性和非免疫源性的糖結(jié)合蛋白或糖蛋白， 有聚集細胞的活性，能非共價特異性地結(jié)合到細胞表面的單糖或寡糖等糖基上 et et et et aL，19801 aL，1983 WaiteaL，1995；Hori Goldstein Sengbusch a／．，1 996 。lectin具有結(jié)合糖基的特異性，因此也可作為細胞和細胞間或

65、機體 etaL，1991o lectin普遍存在，藻類中也廣泛地分布 間的識別分子 Chnspeels Hori et etaL，19881et 于，并有些已經(jīng)分離出來了 Sharona1．，1989；Hod et

66、 etaL，1993；Kima1．，2006 。Lectin能特異性結(jié)合并 a『．，1990；Rogem 區(qū)分藻細胞表面存在的特征性糖基，因此也可以用于赤潮的分子鑒定。熒光標(biāo)記 etaL，1993，1994， 如FITC lectin探針可區(qū)分海洋中不同的甲藻 Coatas 1995；Rhodes etaL，1995；Rodas 胞凝集素來區(qū)分形態(tài)學(xué)相似的米氏凱倫藻同本株、新西蘭株和韓國株。細胞凝集 12 這些 分在 1．3自動化