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1、 代謝工程中一個乳酸菌雙乳酸脫氫酶敲除以提高乙醇的產(chǎn)量 摘要 乳酸菌通過Embden-邁耶霍夫-帕納斯（EMP途徑發(fā)酵葡萄糖：中間代謝 物丙酮酸通過乳酸脫氫酶（LDH的作用轉(zhuǎn)化為乳酸。用丙酮酸脫羧酶（PDC）取代 乳酸脫氫酶（LDH）對丙酮酸進(jìn)行催化作用,可以使丙酮酸生成乙醇從而代替乳酸 的產(chǎn)生。將一個革蘭氏陽性菌一一胃八疊球菌（Spdc）的丙酮酸脫羧酶（PDC）基 因引入到一個植物乳桿菌TF103乳酸脫氫酶缺陷型菌株中，使其中l(wèi)dhL和ldhD 基因失活。在胃八疊球菌和S. ven triculi （—種菌株）啟動子或三個乳酸乳球 菌啟動子中的四個不同的融合基因中的 pTRKH2（厭

2、氧靶向自殺基因）被引入到 TF103中。檢測所有四個重組株的丙酮酸脫羧酶 （PDC）的活性。通過對工程菌生 產(chǎn)乙醇和其他代謝產(chǎn)物在燒瓶中的發(fā)酵來檢驗(yàn)工程菌。重組菌株的生長略快于親 代TF103并且生產(chǎn)90——130毫米的乙醇。雖然產(chǎn)生的略多的乙醇是明顯的， 但 是碳元素向乙醇代謝的途徑并沒有得到顯著改善，因此建議進(jìn)一步了解了這個有 機(jī)體的新陳代謝是必要的。 關(guān)鍵字：乙醇發(fā)酵；代謝工程；乳酸菌；丙酮酸脫羧酶； 胃八疊球菌（SPDC 正文 介紹 乳酸菌是一類兼性厭氧的革蘭氏陽性菌。乳酸菌通常缺乏呼吸鏈，它們利用 發(fā)酵產(chǎn)生的一系列糖類來提供能量用于細(xì)胞的維護(hù)和生長。 在乳酸菌的 發(fā)酵中，

3、乳酸是發(fā)酵的終產(chǎn)物，而在異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌 的發(fā)酵中，通常戊糖通過磷酸乙酮 醇酶途徑 （PPT途徑）產(chǎn)生的是乙醇、二氧化碳、醋酸和乳酸的混合物。 乳酸菌一般被認(rèn)為是安全的，天然的乳酸菌已經(jīng)被應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。 近年 來，人們研究基因改造乳酸菌用于生產(chǎn)乳酸、 B族維生素、低熱量糖醇如山梨醇 和甘露醇。乳酸菌可以在較低的 pH值條件下生長，并且很多菌株是耐乙醇的。 這些特點(diǎn)都有助于開發(fā)新的微生物用于發(fā)酵木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇。 將纖維 素轉(zhuǎn)化為乙醇，要求微生物能夠，發(fā)酵從水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中釋放出來的葡 萄糖和木糖糖類。許多乳酸菌可以代謝多糖，包括戊糖。因此，對于代謝工程中 的生物質(zhì)生產(chǎn)乙

4、醇來說，它們似乎是理想的宿主。但是，乳酸菌不會生產(chǎn)大量的乙醇，因?yàn)樗鼈儠⑻前l(fā)酵成乳酸。 本實(shí)驗(yàn)研究的目的在于， 利用植物乳桿菌作 為模式菌株，用于探索使其從產(chǎn)生乳酸轉(zhuǎn)而產(chǎn)生乙醇的能力的可能性。 負(fù)責(zé)使丙酮酸產(chǎn)生乙醇的酶有丙酮酸脫羧酶（ PDC;EC4.1.1.1 ）和乙醇脫氫 酶（ADH; EC 1.1.1.1）。丙酮酸脫羧酶（PDC ）催化丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙醛和二氧 化碳，然后乙醛通過乙醇脫氫酶催化變?yōu)橐掖肌?Mobilis 的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中生 產(chǎn)乙醇的基因 pdc 和 adh 被整合在一個 便攜式的 pet 操縱子 中。理論上，將 pet 操縱子引入到大腸桿菌中，乙醇的收益率可能在

5、86——92%。 pet 操縱子也被引入到革蘭氏陽性菌和乳酸菌菌株中。這些重組的菌株很少 或者不能產(chǎn)乙醇，這表明源于革蘭氏陰性菌的 pdc 基因不能在革蘭氏陽性菌中 發(fā)揮適當(dāng)?shù)墓δ堋?這可能是由于革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌種類之間對于密碼子 的偏好性和 /或基因表達(dá)的顯著差異所造成的。 與普遍存在于許多生物包括細(xì)菌中的乙醇脫氫酶 （ADH）不同，雖然丙酮酸脫 羧酶（PDC）廣泛的分布在植物中，但是它們只能在少數(shù)種類的細(xì)菌中才能被 找到。最近才得到描述的在革蘭氏陽性菌中僅有的 pdc 基因來自于 胃八疊球菌 （SPDC） 。在酸性條件下 （pH 3.0）, S.ventriculi 利用丙酮酸

6、脫羧酶（ PDC） 使碳元素和電子的流向從流向醋酸、甲酸、和乙醇改變?yōu)橹饕飨蛞掖肌? S.ventriculi 的丙酮酸脫羧酶（PDC）是被丙酮酸激活的并且符合 S形動力學(xué)， 類似真菌和高等植物的酶符合米氏動力學(xué)。 這種革蘭氏陽性菌 Spdc 基因中 G+C 密碼子的低頻率使用，為革蘭氏陽性菌工程宿主對于丙酮酸脫羧酶（ PDC ）高 水平的表達(dá)和開發(fā)第二代可以使用生物質(zhì)糖產(chǎn)乙醇的微生物提供了可能。 本文的 目的是確定革蘭氏陽性菌 胃八疊球菌（Spdc）可以在植物乳桿菌中功能性表 達(dá)，并且測試是否有一種乳酸缺陷型的植物乳桿菌菌株能夠被采用主要用來發(fā)酵 生產(chǎn)乙醇。 材料與方法 菌株與生

7、長條件 Goodwin和Zeikus如上述在厭氧條件下培養(yǎng) S. ventriculi JK 。Ferain博 士提供了植物乳桿菌NCIMB8826廳生株TF1O3 TF103菌株是D型和L型乳酸脫 氫酶活性的缺陷型菌株，培養(yǎng)在 37C、100rpm（轉(zhuǎn)/每分鐘）添加了氯霉素（10 卩g/ml）或紅霉素（5卩g/ml）MRS液體培養(yǎng)基中。大腸桿菌DH5x，BL21（ DE3 pLysS （Invitrogen 公司，卡爾斯巴德，CA）,和 BL21- CodonPlus- RIL （Stratagene 公司，拉霍亞，CA）生長在37C,BHI或Luria - Bertani中，需要時(shí)可

8、向培養(yǎng)基 中加紅霉素（150卩g/ml），或氨芐青霉素（50卩g/ml）或氯霉素（35卩g/ml）。 Table 1 Oligonucleotides used in this study M13 Reverse CAGGAAACAGCTATGAC T7 Promoter Spdc5CXbal Spdc3CXhol Spdc5CATG BamHI Spdc 3 0

9、GTTATTTTG GCCGGATCCATGAAAATAACAATTGCAG GCCGGTACCATTAGTAGTTATTTTG TCTGCTGCATATCCTGCA ACCGATATCATTTTTGGTTGCCATTTGTT CCTCTAGACTAGACAACAAAATAG 將胃八疊球菌（Spdc）克隆到pBluescript （原核表達(dá)載體）和pTRKH2大 腸桿菌穿梭質(zhì)粒 ） 使用 Bactozol 試劑盒（分子研究中心，俄亥俄州辛辛那提）從 S. ventriculi 中分離染色體DNA按照制造商所描述的擬定方法，額外用氯仿抽提。 PCR以 S. ventriculi

10、基因組 DNA為模板，Spdc50XbaI 和 Spdc30XhoI 為引物（表 1）， 從Gen ba nk中獲得其儲存的序列 AF354297并且這一序列引物的末端具有 XbaI and XhoI位點(diǎn)。從基因組DNA中擴(kuò)增出1.7kb的全長Spdc基因，然后進(jìn)行純化、 消化，并且克隆到pBluescript SK 載體以及穿梭載體pTRKH2勺XbaI and XhoI 位點(diǎn)以獲得pTRKH2 Spdc重組子。Sambrook等將用到的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù) 進(jìn)行了描述。用Qiaprep自旋試劑盒（Qiagen公司，瓦倫西亞，CA進(jìn)行大腸 桿菌的質(zhì)粒DNA的純化制備。根據(jù) O Sulliva

11、n 和Klaenhammer，從植物乳桿 菌菌株中分離質(zhì)粒。如上所訴，完成 DNA的測序和數(shù)據(jù)分析。 在大腸桿菌中表達(dá) Spdc PCF引物Spdc5z端的ATGBamHI酶切位點(diǎn)和Spdc3z端的Kpnl酶切位點(diǎn)用 于擴(kuò)增Spdc基因并且將其克隆到 pRSETa（BamHI/Kpnl）載體中。由此產(chǎn)生的 pRSET-Spd（用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 （DE3，pLysS,和 BL21 - CodonPlus-RIL。 在體內(nèi)，根據(jù)供應(yīng)商指示進(jìn)行了 IPTG （異丙基-BD-半乳糖苷）誘導(dǎo)和表達(dá)。細(xì) 胞顆粒的裂解使用CelLytic B+試劑盒（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州）。約

12、 10卩g可溶及不可溶的蛋白提取物（重懸于 50卩g磷酸鹽緩沖液），進(jìn)行12.5 % 的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。為了提高過量表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度，在 10ml稀 釋的TB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有不同濃度 （0, 200, and 500 mM）的甘 氨酸（Sigma公司），培養(yǎng)在37C、OD=1的條件下。在 0.5 mM IPTG、27C的 條件下進(jìn)行 14-16 小時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。 在植物乳桿菌TF103中表達(dá)Spdc 革蘭氏陽性啟動子--SPDC的融合構(gòu)造如下。在pAK80中，以克隆質(zhì)粒AMJ772 AMJ769和AMJ692所含有三個乳酸啟動子作為模板擴(kuò)增 118 bp

13、的啟動子序列， 引物為Amj5z EcoRV和Amj3z Xbal位。這些啟動子序列被克隆到 pTR KH2 Spdc 的 EcoRI/XbaI 位點(diǎn)，分別生成 pTRKH2 772Spdc, pTRKH2 769Spdc, 和 pTRKH2 692Spda上述的這些結(jié)構(gòu)通過電轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)入到植入乳桿菌 TF103,重組子通過 紅霉素篩選獲得。 丙酮酸脫羧酶檢測 如前所述，需進(jìn)行丙酮酸脫羧酶（PDC ）活性的檢測。簡言之，培養(yǎng)的含 有SPDC融合基因的重組大腸桿菌和植物乳桿菌 TF103細(xì)胞在含有2 mM（毫摩） TPP和 20m（毫摩）硫酸鎂的50 mM磷酸鈉緩沖液（pH值6.5 ）使用b

14、eadbeater 研磨珠均質(zhì)器（Biospec產(chǎn)品，巴特爾斯維爾，OK進(jìn)行溶解。使用BIO RAD蛋 白測定試劑盒（BIO-RAD實(shí)驗(yàn)室，大力士，CA對蛋白濃度進(jìn)行測定。將 蛋白提 取物（150 - 250卩g/ml）加入到含有30 mM （毫摩）乙醛，40 mM （毫摩）甲醛，2 mM（毫摩）TPP和 20 mM （毫摩）硫酸鎂的50 mM （毫摩）磷酸鈉緩沖液（pH值 6.5 ）中，定容至500卩l(xiāng)，并在25E下培養(yǎng)30分鐘。向反應(yīng)混合物的上清中加 入含0.2 %的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（甲醇溶解）和10卩l(xiāng) 3M的氫氧化鈉（最 終130 mM（毫摩））的四氮唑紅20卩l(xiāng)，然后進(jìn)行

15、（R） - PAC的檢測。形成甲臜 （大腸菌群在發(fā)育時(shí)伴隨產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶將紙片上的 TTC（紅四碳唑）還原成 不可逆的甲臜（Formazan產(chǎn)生紅色色素）的數(shù)量分光光度計(jì)在510 nm處進(jìn)行測 定。1分鐘1毫克蛋白質(zhì)形成I卩mol的甲臜即為具體的一個單位 PDC舌性。 工程菌株TF103的發(fā)酵 利用搖瓶發(fā)酵對產(chǎn)乙醇的重組植物乳桿菌 TF103菌株進(jìn)行評估。如上所訴， 用加紅霉素的4%葡萄糖MRS培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間在 72小時(shí)至240 小時(shí)之間時(shí)，每隔一段時(shí)間取出一些樣品。 殘余的葡萄糖和發(fā)酵產(chǎn)物， 包括乳酸， 醋酸和乙醇的濃度， 利用高效液相色譜進(jìn)行測定。 通過兩個實(shí)驗(yàn)獲得

16、的數(shù)據(jù)計(jì)算 代謝產(chǎn)量（g乙醇/g葡萄糖），并且通過反復(fù)發(fā)酵分析其它發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。 結(jié)果 SPD（基因在大腸桿菌中的過量表達(dá) 為了評估是否可以生產(chǎn)具有功能的 PDC將克隆出SPDC勺ORF開放可讀框） 亞克隆到具有組氨酸標(biāo)記序列的大腸桿菌表達(dá)載體 pRSETa中。通過SDS-PAGE 分析用IPTG誘導(dǎo)的帶有pRSETa（表達(dá)載體）的大腸桿菌 BL21-CodonPlus- RIPL 的細(xì)胞提取物（BL21-Codon Plus 系列：包括 BL21-CodonPlus* （ DE3-RIPL ,BL21-CodonPI 卩 s-RIL , BL21-CodonPI 卩 s （ DE3

17、） -RIL, BL21-CodonPI 卩 s-RP, BL21CodonPlus* （DE3） -RP等。這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸 （R）,亮氨酸（L）,異亮氨酸（I ）和脯 氨酸（P）稀有密碼子的tRNA基因， 更多用于表達(dá)一些真核生物的基因。 其中RIL系列 常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene 公司資料），存在于不可溶組分的Spdc顯示出明顯的條帶，與61 kDa的多肽相對 應(yīng)。這一過量表達(dá)的SPDC勺大小，符合所報(bào)道的在自然載體中 58 kDa加大約3 kDa。SDS-PAGE吉果表明，SPD（表達(dá)為不溶性聚

18、合折疊中間物，也就是包涵體。 為了誘導(dǎo)過量表達(dá)SPDC蛋白正確折疊，在帶或不帶IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中加入甘 氨酰和二肽。用分光光度計(jì)檢測PDC酶的活性。如圖3所示，經(jīng)200毫摩甘氨酰、 無IPTG誘導(dǎo)處理后細(xì)胞裂解液中可溶部分， PDC的活性最高。由此可見，對使 用載體pRSETa表達(dá)的SPDC來說IPTG的處理是沒有必要的。不溶性組分的酶活 性尚未確定。 將革蘭氏陽性啟動子-SPDC融合體引入TF103 三個革蘭氏陽性啟動子，包括酸誘導(dǎo)的啟動子p692、高表達(dá)的啟動子p769, 和相對中等強(qiáng)度啟動子p772以及天然的Spdc5,端側(cè)翼序列，與SPDCS因融合 在宿主范圍廣泛的載體pTR

19、KH沖。將這些ldhL和ldhD基因失活的結(jié)構(gòu)中引入 到植物乳桿菌 TF103 中。在通過分析從重組菌株分離出質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶發(fā) 現(xiàn)，在TF103中有沒有觀察DNA重組的融合基因或pTRKH（數(shù)據(jù)未顯示）。之后， 在測定TF103重組株P(guān)DC酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有四個菌株都高于本底水平。在菌株 中，PDC舌性差異可能是由于在啟動子序列的差異，由于菌株包含 SPDC與酸誘 導(dǎo)的啟動子融合，pTRKH2-692-Spdc呈現(xiàn)出最高的PDC舌性。正如之前報(bào)道，酸 誘導(dǎo)啟動子在pH值5.5比在pH 7.0更活躍，在培養(yǎng)這些菌株pH值應(yīng)介于4.20 至 5.80，在收獲得時(shí)進(jìn)行酶舌性分析。 重組株的

20、發(fā)酵分析 燒瓶發(fā)酵以研究工程菌產(chǎn)乙醇的能力。 高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)品表明， 攜 帶Spdc基因所有四株生產(chǎn)的乙醇的量比僅被 pTRKH2載體轉(zhuǎn)化的對照菌株更大。 菌株692 -SPDC和769 -SPDC顯示出比其他測試菌株稍高的乙醇產(chǎn)量。然而，重 組菌株也產(chǎn)生大量的乳酸。攜帶 PTRK H2載體的對照菌生長速度非常緩慢，生產(chǎn) 的主要醋酸（ 76 毫摩），一些乳酸（ 60 毫摩）和乙醇（ 17毫摩）。通過高效液相 色譜法分析兩個獨(dú)立發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明， 乙醇代謝產(chǎn)量（克每克消耗糖生產(chǎn)乙 醇）為消耗每克用葡萄糖產(chǎn)生 0.15-0.28 克乙醇。 討論 代謝工程的一個主要目標(biāo)是操縱生物系統(tǒng)使

21、用適當(dāng)?shù)乃拗鲗?shí)現(xiàn)所需工藝流 程。在本研究中，革蘭氏陽性的植物乳桿菌菌株作為宿主被引入革蘭氏陽性 PDC 基因來增加乙醇的產(chǎn)量。以往的研究表明， PDC是以丙酮酸生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵酶， S. ventriculi 的PDC因中低含量的G + C做為一個合理的候選通過基因工程 被引入到乳酸菌中。 對于大多數(shù)乳酸菌，糖類（己糖和戊糖在某些情況下）是發(fā)酵的主要原料， 丙酮酸是糖原料通過不同的途徑形成的中央代謝產(chǎn)物。 丙酮酸主要是通過乳酸脫 氫酶的催化行動轉(zhuǎn)化為乳酸。植物乳桿菌菌株在TF103包含需基因敲除的LDH乳 酸脫氫酶）基因。植物乳桿菌TF103的代謝分析表明，在丙酮酸的積累過程的同 時(shí)，乳酸

22、的量是否很低或檢測不到，這取決于生長和發(fā)酵條件的好壞。因此，植 物乳桿菌TF103被選定作為基因操縱的宿主菌，通過引入革蘭氏陽性SPDCS因， 努力引導(dǎo)丙酮酸進(jìn)入乙醇發(fā)酵的途徑。據(jù)預(yù)期估計(jì)，過量表達(dá)的 S.ventriculi 的PDC基因，在TF103中將中央代謝產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛， 乙醛隨后被一些內(nèi) 源性的乙醇脫氫酶催化成乙醇。在重組菌株中觀察到不同的 PDC酶活性的表明， 每個啟動子驅(qū)動TF103SPDC表達(dá)的強(qiáng)度是不同的?；赟PDC#法的檢測，看來， 酸誘導(dǎo)啟動子p692使得SPDC表達(dá)在TF103中最有效。進(jìn)一步發(fā)酵分析結(jié)果表明， 與轉(zhuǎn)化了 pTRKH2勺對照菌株TF103（

23、17毫米乙醇和乳酸60毫米）相比，重組菌 株表現(xiàn)出較高的產(chǎn)乙醇量 （90-130 毫米）并提高乳酸（120-170 毫米）的產(chǎn)量（圖 5）。菌株692-Spdc和769-Spdc的乙醇產(chǎn)量略高于其他測試菌株（圖 5）。 PTRKH2?；膶φ站辏▓D5）TF103產(chǎn)生約60毫摩的乳酸，盡管據(jù)報(bào)道 TF103 的親本菌株只產(chǎn)生 12-14 毫摩的乳酸。之前的植物乳桿菌 NCIMB8826 （PTRKH21組TF103菌株的親本菌株）的發(fā)酵分析表明，產(chǎn)生乳酸約 498毫摩 和4毫摩的乙醇。因此，缺乏IdhD- IdhL的TF103攜帶pTRKH2（源于TF103但 不同于TF103）產(chǎn)乳酸

24、（60毫米）的可能性不大，應(yīng)為該菌株的回復(fù)突變所造成 的。未預(yù)料到的乳酸產(chǎn)量的提高，可能是由于添加了紅霉素，在TF103中造成了 pTRKH2的選擇壓力，這還有待了解?？股貕毫赡軙粲谢钚缘娜旧w基 因，通常使其他脫氫酶沒有活性， 當(dāng) IdhL-IdhD 基因具有功能則乳酸的親和力較 低。為了證明提出的機(jī)制，進(jìn)一步研究是必要的。有趣的是，在另一項(xiàng)發(fā)酵乳桿 菌雙ldhD-ldhL突變株GRL1032勺研究中觀察到，乳酸產(chǎn)量減少到親本菌株產(chǎn)量 的十分之一。 總之，當(dāng)TF103缺失ldhL和ldhD基因，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化還原電位不平衡， 這也導(dǎo)致了比親本植物乳桿菌 NCIMB882砂長緩慢。攜帶Spdc基因的SPDC工程 菌生長速度比攜帶pTRKH2勺對照菌TF103快，但增長仍比野生型 NCIMB8826菌 株的慢。工程菌株產(chǎn)生的乙醇比TF103的本底產(chǎn)量稍多；然而，它們也產(chǎn)生更多 的乳酸。雖然SPDC在工程TF103中表達(dá)，但碳的流向沒有明顯的改向產(chǎn)乙醇的 方向，建議有必要進(jìn)一步了解這個有機(jī)體的新陳代謝。