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RHD1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率研究

上傳人:陽(yáng)*** 文檔編號(hào):48159465 上傳時(shí)間:2022-01-01 格式:DOC 頁(yè)數(shù):12 大?。?7.50KB
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1、RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率研究 作者:吳俊杰 洪小珍 許先國(guó) 馬開(kāi)榮 朱發(fā)明 嚴(yán)力行 【摘要】   本研究調(diào)查RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率。采用等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)檢測(cè)RHD 1227A等位基因, RHD基因拷貝數(shù)采用D雜合性試驗(yàn)和RHD外顯子9的核苷酸序列分析方法進(jìn)行確定。結(jié)果表明: 在143例Rh陰性獻(xiàn)血員中,共檢測(cè)到41例RHD 1227A等位基因攜帶者,其中8 例(19.51%)為 RhCCd

2、ee,32例 (78.05%) 為RhCcdee,1例 (2.44%) 為 RhCcdEe。在這41例RHD 1227A等位基因攜帶者中,35例有RHD基因的缺失,另外的6例是RHD 1227A等位基因的純合子。在489例隨機(jī)獻(xiàn)血員中檢測(cè)到7例RHD 1227A等位基因先證者,都是RHD 1227G/A雜合子,且是正常Rh陽(yáng)性血型。結(jié)論: RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群中的頻率為16.43%,在隨機(jī)人群中的頻率為0.72%。 【關(guān)鍵詞】 RHD基因; RHD 1227A等位基因; 基因頻率; Rh陰性人群    RHD 1227A Allele Frequency am

3、ong Rh Negative Population and Random Population    AbstractTo investigate the frequency of RHD 1227A allele in Rh negative population and random population, an AS - PCR (allele specific - polymerase chain reaction) method was emloyed to detect RHD 1227A allele. RHD gene copy was determined by D

4、zygosity test and RHD exon 9 nucleotide sequence analysis. The results showed that among 143 Rh negative donors, forty-one RHD 1227A allele carriers were detected, and 8 (19.51%) out of which were RhCCdee, 32 (78.05%) were RhCcdee, and 1 (2.44%) was RhCcdEe. Thirty-five Rh negative RHD 1227A carrier

5、s had RHD gene deletion, and the remaining carriers were RHD 1227A homozygous. Seven (1.43%) individuals were detected with RHD 1227A allele among 489 random donors. They were all G/A heterozygous at RHD 1227 site. Serological test indicated that they were normal Rh positive phenotype. It is conclud

6、ed that the frequency of RHD 1227A allele is 16.43% among Rh negative population and 0.72% among the random population.   Key wordsRHD gene; RHD 1227A allele; gene frequency; Rh negative population   在過(guò)去的10多年里,RH血型的分子生物學(xué)研究有了很大的進(jìn)展,對(duì)D抗原的免疫原性也有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)[1-3]。因?yàn)镈EL抗原(只有通過(guò)吸收釋放才能檢測(cè)到的弱表達(dá)D抗原)有可能快速誘發(fā)抗D免

7、疫事件[4-6],如何通過(guò)準(zhǔn)確的基因分型建立一個(gè)真正的RH陰性供者庫(kù)(目前的RH陰性血型包括DEL表型)和分子鑒定各種D突變體成為輸血醫(yī)學(xué)的一個(gè)新熱點(diǎn)[1,2]。充分了解RHD等位基因的多態(tài)性和人群中的頻率是RHD基因分型的必要條件[2]。Gassner等[7]和Doescher等[8]研究發(fā)現(xiàn),RHD等位基因即使在相鄰地區(qū)也可能有很大的差異; Chen等[9]發(fā)現(xiàn),從弱D表型推算得到的基因人群頻率和隨機(jī)人群調(diào)查得到的基因人群頻率也不盡一致。我們率先用等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)方法調(diào)查DE

8、L表型的主要等位基因RHD 1227A在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率,并對(duì)結(jié)果的臨床意義作了討論。   材料和方法   對(duì)象   在2003年10月—2004年10月期間在浙江省血液中心獻(xiàn)血的無(wú)親緣關(guān)系Rh陰性獻(xiàn)血員143名作為Rh陰性人群,隨機(jī)選取在浙江省居住或者工作的無(wú)親緣關(guān)系獻(xiàn)血員489名作為隨機(jī)人群。   Rh表型血清學(xué)鑒定   RHD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法,使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D試劑(人單克隆IgM抗D,D175-2細(xì)胞株; 人單克隆IgG抗D, D415 1E4細(xì)胞株)。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水

9、試管法,試劑為Dominion公司的相應(yīng)單克隆抗體。   AS-PCR   參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。用特異擴(kuò)增RHD 1227A等位基因的引物: RHDEL-s(上游引物): GACCAAGTTTTCTGGAAA(位置對(duì)應(yīng)于AJ299028的68-85)、 RHDEL-a(下游引物): CGAGAGAATTTTGAGCAC (位置對(duì)應(yīng)于AB035185的849-832)。一對(duì)特異擴(kuò)增人生長(zhǎng)激素(HGH)基因429 bp的引物作為內(nèi)對(duì)照,HGH-s(上游引物): GCCTTCCCAACCATTCCCTTA; HGH-a(下游引物): TCACGGATTTCTGTTGTGTTT。反應(yīng)總體

10、積10 μl,含模板DNA 0.2 μl(約含DNA 20-50 ng),特異性引物終濃度250 nmol/L,內(nèi)對(duì)照引物終濃度50 nmol/L,MgCl2 終濃度1.5 mmol/L,dNTP終濃度 200 mmol/L,Taq酶0.2 U(TaKaRa公司產(chǎn)品)。PCR擴(kuò)增條件: 95℃ 預(yù)變性5分鐘,然后94℃ 變性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒,循環(huán)30次,最后72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖電泳,用凝膠成像儀(Syngene公司產(chǎn)品)觀察結(jié)果。   RHD基因外顯子9序列分析   參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。用RHD基因外顯子9的特異引物, WD9 s(上

11、游引物): GGTCCAGGAATGACAGGGCT(位置:對(duì)應(yīng)于AB035196的4682-4701); WD9 a(下游引物): CGCTGAGGACTGCAGATAGG (位置:對(duì)應(yīng)于AB035185的294-275),擴(kuò)增覆蓋外顯子9及側(cè)翼序列的532 bp片段。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的膠純化回收試劑盒純化,采用BigDye Sequencing kit(ABI公司產(chǎn)品)試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),用ABI PRISM 377測(cè)序儀進(jìn)行PAGE電泳,Sequence Analysis進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。   RHD基因缺失檢測(cè)   根據(jù)Perco等[12]的方法,用特異性引物μ1-

12、s(上游引物)和rnb31(下游引物) PCR檢測(cè)Rhesus hybrid box(AJ252313, 4988-7710區(qū)域)。如果可以擴(kuò)增得到2 778 bp的特異性片段,則表明存在Rhesus hybrid box,有RHD基因的缺失; 反之,則不存在Rhesus hybrid box,沒(méi)有RHD基因的缺失。   結(jié)果   Rh陰性隨機(jī)人群中RHD 1227A的人群頻率   對(duì)143例Rh陰性人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn),RHD 1227A陽(yáng)性的個(gè)體有41例,占Rh陰性人群的28.67%。其中RhCCdee表型8例(19.51%),RhCcdee表型32例(78.05%),RhCc

13、dEe表型1例(2.44%)(附表)。在RhCCdEe、Rhccdee、RhccdEe和RhCcdEE表型的Rh陰性隨機(jī)人群中未檢測(cè)到RHD 1227A等位基因。采用Perco等的Rhesus hybrid box檢測(cè)方法[12],RHD 1227A陽(yáng)性的41例Rh陰性人群中有35例可以擴(kuò)增得到2 778 bp的特異性片段,表明存在Rhesus hybrid box,有RHD基因的缺失;有6例不能擴(kuò)增到2 778 bp的片段,表明不存在RHD基因的缺失,RHD 外顯子9序列分析結(jié)果表明,6例都為RHD 1227A等位基因的純合子,即在我們檢測(cè)的Rh陰性隨機(jī)人群中,RHD 1227A等位基因的拷

14、貝數(shù)為47,基因頻率為16.43%。Table . Frequency of RHD 1227A allele among random Rh negative popoulation(略)   隨機(jī)人群中RHD 1227A的人群頻率   在489例隨機(jī)人群中,檢測(cè)到7例RHD 1227A陽(yáng)性個(gè)體,占隨機(jī)人群的1.43%。血清學(xué)檢測(cè)表明,這7例個(gè)體都是Rh陽(yáng)性。外顯子9的序列分析表明,這7例個(gè)體在1227位都是G和A的雜合子(附圖)。用Perco等的方法[12],該7例RHD 1227A陽(yáng)性個(gè)體均未擴(kuò)增到2 778 bp的片段,結(jié)果也表明不存在RHD基因的缺失。因此,在我們檢測(cè)的4

15、89例隨機(jī)人群中RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)為7,基因頻率為0.72%?! ∮懻?   和歐洲不同,亞洲Rh陰性人群有很高比例的DEL表型。在Gassner等[7]和Wagner等[13]的研究中,發(fā)現(xiàn) DEL個(gè)體由RHD 885T(M295I)、RHD 1227A(K409K)、RHD IVS5-38del4、RHD 1252T(Tins)1253A (X418L)和RHDIVS3+1A等位基因引起。在亞洲人群中, DEL表型主要是外顯子9缺失和RHD 1227A[14-19]2種。我們前期的研究結(jié)果表明,浙江漢族DEL表型是由RHD 1227A等位基因引起[10],并根據(jù)RHD

16、1227A等位基因的序列設(shè)計(jì)了DEL表型的AS-PCR基因分型方法[11]。采用該AS-PCR方法,我們?cè)?43例Rh陰性人群中檢測(cè)到41例(28.67%)攜帶RHD 1227A,其中RHCCdee占19.51%,RHCcdee占78.05%, Rh-CcdEe占2.44%。這些結(jié)果和Chen等[14]和Shao等[17]的研究結(jié)果基本一致。在489例隨機(jī)人群中我們發(fā)現(xiàn)7例RHD 1227A陽(yáng)性個(gè)體。序列分析發(fā)現(xiàn),這些先證者在RHD基因的1227位都是G和A的雜合子;血清學(xué)檢測(cè)表明,是Rh陽(yáng)性血型。Rhesus hybrid box檢測(cè)表明,這7例個(gè)體都不存在RHD基因的缺失。結(jié)合Rhesus

17、 hybrid box檢測(cè)和RHD基因外顯子9的序列分析結(jié)果推斷的RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)和RHD 1227A等位基因攜帶者在人群中陽(yáng)性的個(gè)體比例,我們推算出RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的基因頻率分別為16.43%和0.72%,和Shao等[14]、Chen等[17]通過(guò)Del表型推算的RHD 1227A等位基因在深圳和臺(tái)灣隨機(jī)人群中的頻率基本一致。 Ishikawa等[20]發(fā)現(xiàn),日本人群中90%的Rh陰性、C陽(yáng)性和RHD基因陽(yáng)性的獻(xiàn)血員攜帶RHD 1227A等位基因,而在歐洲人群中,RHD 1227A的基因頻率只有1/9 091[13]。由上述分析可見(jiàn),R

18、HD 1227A等位基因主要在亞洲人群中有意義。另外,我們首次在Rh陽(yáng)性血型個(gè)體中檢測(cè)到RHD 1227A。這一方面表明RHD 1227A表達(dá)的抗原很弱,相對(duì)于正常RHD等位基因,DEL抗原不被表現(xiàn);另一方面,RHD 1227A隱性攜帶者的子代表現(xiàn)為DEL 表型的要比正常對(duì)照高1倍。如果在隨機(jī)人群中開(kāi)展RhD血型的基因分型,RHD 1227A等位基因的檢測(cè)必須和RHD 1227G(正常RHD對(duì)照)相結(jié)合,即當(dāng)RHD 1227A陽(yáng)性、RHD 1227G陰性時(shí),有比較大的可能是DEL,而當(dāng)RHD 1227A和RHD 1227G都為陽(yáng)性時(shí)很可能是RHD 1227A的隱性攜帶者、正常D表型。基因分型方

19、法具體實(shí)施時(shí)還需考慮其它不表達(dá)等位基因的突變位點(diǎn)的檢測(cè)。 【參考文獻(xiàn)】   1 Flegel WA. Homing in on D antigen immunogenicity. Transfusion, 2005; 45: 466-468   2 Avent ND. High variability of the RH locus in different ethnic backgrounds. Transfusion, 2005; 45: 293-294   3 Garratty G. Do we need to be more concerned about wea

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