《江蘇省宿遷市馬陵中學(xué)高考生物專題復(fù)習(xí) 血紅蛋白的提取和分離課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《江蘇省宿遷市馬陵中學(xué)高考生物專題復(fù)習(xí) 血紅蛋白的提取和分離課件（36頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、1 DNA1 DNA、蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？、蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？ 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異如：分子的形狀和如：分子的形狀和大小大小、所帶、所帶電荷的性質(zhì)電荷的性質(zhì)和和多少多少、溶解度溶解度、吸附的性質(zhì)和對其他分子的、吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)思考思考: :2 2人們用來提取人們用來提取DNADNA和蛋白質(zhì)的材料是什么？和蛋白質(zhì)的材料是什么？ 為什么選擇這樣的材料？為什么選擇這樣的材料？ 雞的紅細(xì)胞雞的紅細(xì)胞有細(xì)胞核，含有有細(xì)胞核，含有DNA高高，便，便于進(jìn)行于進(jìn)行DNA的提取。的提

2、取。 人人的的紅細(xì)胞紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，含無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，含血紅血紅蛋白豐富蛋白豐富，便于提取血紅蛋白。有，便于提取血紅蛋白。有顏色顏色（紅（紅色）便于實驗的色）便于實驗的觀察觀察。3 3、如何保證分離得到的血紅蛋白具有正常、如何保證分離得到的血紅蛋白具有正常的結(jié)構(gòu)和功能，以便于研究？的結(jié)構(gòu)和功能，以便于研究？ 利用利用緩沖液緩沖液準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的PHPH環(huán)境環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于科學(xué)保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于科學(xué)研究研究（活性活性）4 4、說出人體血液中的緩沖對？、說出人體血液中的緩沖對？ 他們的作用是？他們的作用是？ NaH2PO4

3、/ Na2HPO4H2CO3 / NaHCO35、分離蛋白質(zhì)的方法：、分離蛋白質(zhì)的方法： 凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）：2 2、凝膠：、凝膠：由多糖類化合物構(gòu)成的，由多糖類化合物構(gòu)成的， 如：如：葡聚糖或瓊脂糖葡聚糖或瓊脂糖內(nèi)含許多貫穿的通道。內(nèi)含許多貫穿的通道。 是根據(jù)是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)的有效方法的有效方法 1 1、概念：、概念：一些微小多孔的球體一些微小多孔的球體3 3、具具體體過過程：程：4 4、原理：、原理： 相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入容易進(jìn)入凝膠凝膠內(nèi)部通道，路程內(nèi)部通道，路程較長較長，移

4、動，移動速度較慢速度較慢 相對分子質(zhì)量較大相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入無法進(jìn)入凝膠凝膠內(nèi)部通道，只能在凝膠外部移動，路程內(nèi)部通道，只能在凝膠外部移動，路程較短較短，移動移動較快較快相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離（二）電泳：（二）電泳： 指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程1 1、概念：、概念：2 2、原理：、原理： 利用待分離樣品中各種分子利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差帶電性質(zhì)的差異異、分子本身的大小分子本身的大小、形狀的不同形狀的不同，使帶電，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度分子產(chǎn)生不同的遷移速度從而

5、實現(xiàn)樣品中各種分子的分離從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離 許多重要的生物大分子，許多重要的生物大分子，如多肽、如多肽、核酸等核酸等都具有都具有可解離的基團(tuán)可解離的基團(tuán)，在一定的在一定的PH下下，這些基團(tuán)會帶上，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電正電或負(fù)電。在電場。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷電荷相反的方向相反的方向移動移動3 3、舉例：、舉例：4 4、常用電泳方法：、常用電泳方法：瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 測定蛋白質(zhì)相對分子量測定蛋白質(zhì)相對分子量常用常用:SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳的遷移率完全取

6、決于電泳的遷移率完全取決于 分子量的大小分子量的大小6、 實驗操作：實驗操作：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1 1）樣品處理：）樣品處理：（2 2）粗分離：）粗分離：（3 3）純化：）純化：（4 4）純度鑒定：）純度鑒定：樣品處理包含的步驟樣品處理包含的步驟1、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白用生理鹽水洗滌用生理鹽水洗滌,低速（低速（500r/min)短時間短時間(2min)離心離心,用膠頭吸管吸出黃色血漿。用膠頭吸管吸出黃色血漿。2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放：3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液：高速（高速（200

7、0r/min)長時間長時間(10min)離心分離心分層層,濾紙過濾去除脂溶性沉淀層濾紙過濾去除脂溶性沉淀層,分液漏斗分出紅色透明液體。分液漏斗分出紅色透明液體。重復(fù)重復(fù)3次次思考：思考：1、能用蒸餾水洗滌嗎？為什么？、能用蒸餾水洗滌嗎？為什么？2、假如洗滌次數(shù)少、離心速度高、假如洗滌次數(shù)少、離心速度高、 時間過長會有什么影響？時間過長會有什么影響？3、離心后的上清液是什么？含有蛋白質(zhì)嗎？、離心后的上清液是什么？含有蛋白質(zhì)嗎？無法除去血漿蛋白、無法除去血漿蛋白、白細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離效果白細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離效果(2)血紅蛋白的釋放：血紅蛋白的釋放：40%40%體積的甲苯：體積的甲苯：置

8、于磁力攪拌器充分?jǐn)嚢柚糜诖帕嚢杵鞒浞謹(jǐn)嚢枵麴s水：蒸餾水：向向紅細(xì)胞紅細(xì)胞中中溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜吸水脹破吸水脹破加速細(xì)胞破裂加速細(xì)胞破裂加入加入分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 無色透明的甲苯層無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀白色脂溶性物質(zhì)沉淀層層血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀暗紅色沉淀物物2粗分離采用的方法？目的？原理是？粗分離采用的方法？目的？原理是？ 透析：透析： 裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中 （PH為為7.0）透析。）透析。 目的：目的：除去小分子雜質(zhì)除去小

9、分子雜質(zhì) 透析原理：透析原理： 小分子雜蛋白可以通過透析袋小分子雜蛋白可以通過透析袋 大分子蛋白質(zhì)留在透析袋內(nèi)大分子蛋白質(zhì)留在透析袋內(nèi)3.3.純化：純化： 是利用是利用凝膠色譜法凝膠色譜法將將相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量大量大的雜質(zhì)蛋白除去的雜質(zhì)蛋白除去1 1）凝膠色譜柱的制作）凝膠色譜柱的制作凝膠色譜法的實驗操作凝膠色譜法的實驗操作: :2 2）凝膠色譜柱的裝填）凝膠色譜柱的裝填注：注： 裝填時不能裝填時不能有氣泡存在：有氣泡存在： 會攪亂洗脫液會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低脫次序，降低分離效果分離效果3 3）樣品的加入和洗脫）樣品的加入和洗脫: :調(diào)整緩沖液面：調(diào)整緩沖液面：與

10、凝膠面平齊與凝膠面平齊 操作操作: : 打開下端出口，使柱內(nèi)打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上凝膠面上的緩沖液的緩沖液緩慢下緩慢下降降到與到與凝膠面平齊凝膠面平齊，關(guān)閉，關(guān)閉出口出口滴加透析后的樣品：滴加透析后的樣品：貼壁環(huán)繞加樣，加到色譜柱的頂端貼壁環(huán)繞加樣，加到色譜柱的頂端同時不要破壞凝膠面同時不要破壞凝膠面洗脫：磷酸緩沖液洗脫：磷酸緩沖液樣品滲入凝膠床：樣品滲入凝膠床：如果紅色帶均勻一致地移動，如果紅色帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。說明色譜柱制作成功。4 4、純度鑒定的方法：、純度鑒定的方法：常用常用: 1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 2、醋酸纖維薄膜電泳、醋酸纖維薄膜

11、電泳凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是A. 對其他分子的親和力對其他分子的親和力 B. 溶解度溶解度 C. 所帶電荷多少所帶電荷多少 D. 相對分子質(zhì)量的大小相對分子質(zhì)量的大小 凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是 A. 糖類化合物糖類化合物 B. 脂質(zhì)脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) D. 核酸核酸DA將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時，第二層是液時，第二層是 A. 甲苯甲苯 B. 血紅蛋白水溶液血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀其他雜質(zhì)的沉淀C下列操作正

12、確的是下列操作正確的是A. 分離紅細(xì)胞時采用低速長時間離心分離紅細(xì)胞時采用低速長時間離心 B. 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可水就可C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心 D. 透析時要用透析時要用20mmol/l的磷酸緩沖液，的磷酸緩沖液，透析透析12hD下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序敘述下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序敘述錯誤的是錯誤的是A. 樣品的處理就是通過一系列操作收集到樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液B. 通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)

13、，此為樣品的粗提取的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C. 可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D. 可通過可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度血紅蛋白的純度B下列說法不正確的是下列說法不正確的是A. 血紅蛋白在釋放時，加蒸餾水到原血血紅蛋白在釋放時，加蒸餾水到原血液的體積，再加液的體積，再加40體積的甲苯，充分?jǐn)圀w積的甲苯，充分?jǐn)嚢璋鐱. 血紅蛋白溶液離心后分為血紅蛋白溶液離心后分為4層，第層，第1層為層為白色薄層固體白色薄層固體C. 血紅蛋白溶液離心后分為血紅蛋白溶液離心后分為4層，第

14、層，第4層層為暗紅色沉淀物為暗紅色沉淀物D. 血紅蛋白溶液離心后分為血紅蛋白溶液離心后分為4層，第層，第3層層為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液B樣品的加入和洗脫的敘述正確的是樣品的加入和洗脫的敘述正確的是A. 先加入先加入1ml透析后的樣品透析后的樣品 B. 加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出C. 如果紅色帶均勻一致的移動，說明色如果紅色帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功譜柱制作成功 D. 洗脫時可以用緩沖液也可以用清水洗脫時可以用緩沖液也可以用清水C樣品的加入和洗脫的操作不正確的是樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A. 加

15、樣前，打開色譜柱下端的流出口，加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上緩沖液緩慢下降到凝使柱內(nèi)凝膠面上緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面膠面的下面B. 加樣后，打開下端出口，使樣品滲加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)入凝膠床內(nèi)C. 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口下端出口D. 用吸管小心的將用吸管小心的將1ml透析后的樣品透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程中，分析無誤的是理過程中，分析無誤的是A洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡洗滌紅細(xì)胞

16、的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機(jī)鹽萄糖、無機(jī)鹽B洗滌時離心速度過低，時間過短，白洗滌時離心速度過低，時間過短，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果C洗滌過程選用洗滌過程選用0.1的生理鹽水的生理鹽水D透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)量較小的雜質(zhì)D紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實驗，來提取和羊或

17、其他脊椎動物的血液進(jìn)行實驗，來提取和分離血紅蛋白，回答下列有關(guān)問題：分離血紅蛋白，回答下列有關(guān)問題： （1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：（2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的是加入檸檬酸鈉的目的是_。以上所述的過程即是樣品處理，它包括以上所述的過程即是樣品處理，它包括_ _、_、分離血紅蛋白溶液。、分離血紅蛋白溶液。（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過）收集的血

18、紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。透析，這就是樣品的粗分離。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。（4）然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，）然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)最后經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。樣品純化的目的是？定。樣品純化的目的是？血紅蛋白有什么特點？這一特點對進(jìn)行蛋白血紅蛋白有什么特點？這一特點對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？質(zhì)的分離有什么意義？血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液；這過觀察顏色來判斷什么時候

19、應(yīng)該收集洗脫液；這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作驗操作 1 1、在上個世紀(jì)、在上個世紀(jì)5050年代，酶已經(jīng)大規(guī)模地應(yīng)年代，酶已經(jīng)大規(guī)模地應(yīng)用于各個生產(chǎn)領(lǐng)域，到了用于各個生產(chǎn)領(lǐng)域，到了7070年代又發(fā)明了年代又發(fā)明了固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)。在實際生產(chǎn)固定化酶與固定化細(xì)胞技術(shù)。在實際生產(chǎn)中，固定化酶技術(shù)的優(yōu)點是中，固定化酶技術(shù)的優(yōu)點是 與固定化酶與固定化酶技術(shù)相比，固定化細(xì)胞固定的是技術(shù)相比，固定化細(xì)胞固定的是 酶。酶。在制備固定化酵母細(xì)胞的實驗中，常用的在制備固定化酵母細(xì)胞的實驗中，常用的包埋材料是包埋材料是 。 另一同學(xué)運用另一同學(xué)

20、運用PCRPCR技術(shù)，準(zhǔn)備對分離得到的大腸桿菌一個技術(shù)，準(zhǔn)備對分離得到的大腸桿菌一個DNADNA分子進(jìn)行體外擴(kuò)增。他往擴(kuò)增儀中加分子進(jìn)行體外擴(kuò)增。他往擴(kuò)增儀中加入模板入模板DNADNA、四種脫氧核苷酸，此外還應(yīng)、四種脫氧核苷酸，此外還應(yīng)加入加入 和和 。DNADNA體外擴(kuò)增過程包括了體外擴(kuò)增過程包括了三個連續(xù)的步驟分別是變性、三個連續(xù)的步驟分別是變性、 和和 。 還有同學(xué)將大腸桿菌破碎并提取得到大腸桿菌蛋白質(zhì)，還有同學(xué)將大腸桿菌破碎并提取得到大腸桿菌蛋白質(zhì)，一同學(xué)利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分一同學(xué)利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，在電泳過程中，影響蛋白質(zhì)遷移速度的因素包括蛋離，在電泳過程中，影響蛋白質(zhì)遷移速度的因素包括蛋白質(zhì)分子的白質(zhì)分子的 、 以及分子的形狀等。而另一位以及分子的形狀等。而另一位同學(xué)則利用凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)（下圖），他在操作同學(xué)則利用凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)（下圖），他在操作中加樣的正確順序是中加樣的正確順序是 。待蛋白質(zhì)接近色柱底端時，。待蛋白質(zhì)接近色柱底端時，用試管連續(xù)收集流出液。先收集到的蛋白質(zhì)與后收集到用試管連續(xù)收集流出液。先收集到的蛋白質(zhì)與后收集到的蛋白質(zhì)的區(qū)別是的蛋白質(zhì)的區(qū)別是 。緩緩沖沖液液樣樣品品樣樣品品樣樣品品