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1、肌酸激幅同工幅 MB評估 上海仁濟(jì)醫(yī)院檢驗科 肌酸激酶MB同工酶(CK-MB )是由M和B亞基構(gòu)成的雜化型二聚體，主要存在 于心肌細(xì)胞的外漿層，是心肌酶譜中最有特異性的酶，從 80年代起公認(rèn)為心肌酶學(xué)診 斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，應(yīng)用于急性心肌梗塞(AMI)的早期診斷[1'2]1979年Gerhardt[3]等人首 次報道用免疫抑制原理測定 CK同工酶，免疫抑制法以其快速、靈敏、定量且可進(jìn)行自 動分析等優(yōu)點(diǎn)適合常規(guī)檢測， 隨著方法與試劑不斷改進(jìn)與完善，1986年國外已有試劑盒 供應(yīng)，但價格昂貴；最近國內(nèi)研制成功免疫抑制法測 CK-MB的試劑盒，本文旨在對該 試劑盒的特性作

2、一評估。 材料和方法 一、標(biāo)本來源 分正常組，AMI組和非AMI組，非常人血清來自體檢健康人員，計 30例，AMI 組53例，系仁濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科病房已確診為 AMI者，非AMI組系心內(nèi)科及其它科門診 病人，因胸痛、心率失常等初診疑擬 AMI ,后經(jīng)系列觀察和酶學(xué)檢查證實(shí)不是 AMI患 者，共20例。 血標(biāo)本留取后及時分離血清檢測或?qū)z測血清置于 -20度冰箱保存至測定。 二、試劑 1 .免疫抑制法檢測 CK-MB試劑盒：上海北加生化試劑有限公司產(chǎn)品 (1) R1:含CK-MB抗體的咪嚏緩沖液 (羊抗人CK-M多克隆抗體抑制劑>2000U/L , 100mmol/L的咪嚏緩沖液

3、成 pH6.7 內(nèi)含葡萄糖 20mmol/L ,醋酸鎂 10mmol/L , EDTA 2mmol/L ) (2) R2(A):酶干粉。 (AMP 5mmol/L ,磷酸肌酸 30mmol/L ,五磷酸二腺背 10mmol/L , NADP 2mmol/L, V-乙腺半胱氨酸 20mmol/L ,已糖激酶 A 2500U/L , G6PDH> 500U/L, ADP 2mmol/L）。 2.寶靈曼CK-MB試劑盒：對照用 三、儀器 HITACHI 7150型自動生化分析儀 波長=340nm 四、方法 本試驗在日立7150生化自動分析儀器上測定，參數(shù)表如下: TEST ASS

4、AY CODE SAMPLE VOLUME R1 VOLUME R2 VOLUME WAVELENGTH CALIB METHOD STD. (1) CONC. "POSZ. STD. (2) CONC. "POSZ. STD. (3) CONC. "POSZ. STD. (4) CONC. POSZ. STD. (5) CONC. POSZ. STD. (6) CONC. "POSZ. SD LIMIT DUPLICATE LIMIT SENSITIVITY LIMIT SENSITIVITY LIMIT ABS. LIMIT (INC/DEC) PROZO

5、NE LIMIT EXPECTED VALUE TECH LIMIT INSTRUMENT FACTOR [CK-MB ] [RATE - A ]:[ 45 ]-[ 50 ] [ 5 ][ 3 ] [240 ][ 100 ][ NO ] [60 ][ 20 ][ NO ] [ ][ 340 ] [ LINEAR ][ 0 ][ 0 ] [0.0 ]-[ 1 ] [65 ]-[ 28 ] [0 卜’0 ] [0 卜’0 ] [0 卜’0 ] [0 卜’0 ] [ 0.1 ] [ 100 ] [ 100 ] [ 0 ] [9000 ][ INCREASE

6、] [ 0 ][ LOWER ] [ 0 ]-[ 25 ] [ 100]-[ 1000] [ 1.0 ]  、線性范圍 取一高活性 CK-MB標(biāo)本：152.0U/L用生理鹽水按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5比例稀 釋，測得其相應(yīng)活性分別為 38.0、81.0、111.0、131.0、152.0,作圖（見圖1）。呈典型 的拋物線曲線，符合免疫比濁法反應(yīng)原理。 穩(wěn)算倍數(shù) 圖1 試劑盒測定CK-MB線性 同樣操作方法，將CK-MB為79.0U/L的病人血清標(biāo)本用生理鹽水按 1巧、2/5、3/5、 4/5、5/5比例稀釋,測得相應(yīng)活性為 18.7、32.5

7、、48.9、65.5、79.0以稀釋倍數(shù)為 X軸, 酶活性Y為軸，其線性見圖2,可見CK-MB活性在80U/L以下線性良好。 CK-MB活性 (L7L) 圖2試劑盒測定CK-MB線性 5  二、精密度試驗 分別取低、中、高活性的血清標(biāo)本(簡稱低值、中值、高值) 。按本法操作，批內(nèi) 重復(fù)200次，批間是每天測定一次共 10天，表1為本試劑盒對五份血清標(biāo)本所做的重 復(fù)性試驗，批內(nèi)：n=60, CV=1.66~13.66% ,平均 6.78%。批間：n=20, CV=6.59~11.73%, 平均9.16%,基本符合質(zhì)控要求，顯示該試劑盒有效較高的精密度。 表1精密度試驗

8、 n man min X SD CV(%) 批低值 20 13.0 8.0 10.15 1.39 13.66 中值 20 61.4 51.7 55.99 2.81 5.02 內(nèi)高值 20 168.0 158.0 163.1 2.7 1.66 批低值 10 15.0 10.4 12.45 1.46 11.73 批高值 10 108.8 90.1 98.73 6.51 6.59 三、干擾試驗 1 .甘油三酯(TG)干擾試驗：采用高脂標(biāo)本經(jīng)測定分析物濃度后加入試驗樣品中。 選取兩標(biāo)本，一為高甘油三酯標(biāo)本( TG

9、: 14.8mmol/L , CK-MB : 30U/L),另一為 甘油三酯正常標(biāo)本(TG: 1.09mmol/L, CK-MB : 32U/L )。將高甘油三酯作為干擾物， 按不同比例1巧、2/5、3/5、4巧、5巧加入甘油三酯正常的標(biāo)本中，隨后測 CK-MB活性 分別為30、31、33、31、30。干擾物加入前后的反應(yīng)曲線圖見圖 3、4。由于兩標(biāo)本CK-MB 圖3 TG加入前反應(yīng)曲線圖 接近，僅考慮TG帶來的影響，根據(jù)圖及測得值顯示 TG在14.8mmol/L以下對CK-MB 圖4 TG加入后反應(yīng)曲線圖  2 .膽紅素（BIL ）干擾試驗： 選取高膽紅素標(biāo)本（BIL:

10、394.72 mol/L, CK-MB : 4.1U/L ）作為干擾物，按不同 比例 1/4、1/3、1/2 加入膽紅素正常（BIL : 4.02 mol/L CK-MB : 11.0U/L）的標(biāo)本中， 然后分別測膽紅素，CK-MB值（見表2）,干擾物加入前后的反應(yīng)曲線見圖 5、6。由于 兩標(biāo)本中CK-MB略有差異，隨著干擾物高膽紅素加入的同時，低活性的 CK-MB亦被 帶入，須計算理論值，根據(jù)測定值與理論值比較及圖顯示 BIL,在209.33 mol/L以下對 CK-MB活性無明顯影響。 表2 膽紅素對CK-MB的影響 圖5 BIL加入前反應(yīng)曲線圖 1/4 1/3

11、1/2 BIL 104.20 136.76 209.33 CK-MB（測定值） 9.7 8.4 7.4 CK-MB（理論值） 9.28 8.7 7.55 3 .溶血干擾試驗 將8例CK-MB活性增高的標(biāo)本，先測定 CK-MB活性，然后進(jìn)行人為溶血，得到 溶血樣品，再進(jìn)行測定 CK-MB活性及血紅蛋白濃度，結(jié)果見表 3。進(jìn)一步試驗，將標(biāo) 本1、4溶血前重復(fù)測 5次，得136.58立.51、27.74 =2.21;溶血后重復(fù)測 2次，均在X±2SD 范圍內(nèi)，說明當(dāng)輕度溶血（Hb<200mg/dl）時本試劑盒對 CK-MB測定無明顯影響；反 之嚴(yán)重溶血可致CK-MB活性

12、升高。 表3 試劑測定 CK-MB 活性溶血前后結(jié)果比較 1 2 3 4 5 6 7 8 溶血前 135.1 201.5 27.3 27.3 65.2 69.5 181.9 201.5 溶血后 135.8 202.6 27.4 26.1 64.6 70.4 189.5 214.9 Hb(mg/dl) 100 100 100 200 200 200 300 500 四、與德國寶靈曼同類試劑盒的相關(guān)性 60份臨床病人血清標(biāo)本用本試劑和寶靈曼試劑進(jìn)行 CK-MB平行測定，以寶靈曼試 劑測得結(jié)果為X軸，本試劑測

13、得結(jié)果為 Y軸，求得線性方程為 Y=0.565X-0.5999 ,線性 相關(guān)系數(shù)為r=0.983 （圖7）。顯出高相關(guān)性，上述結(jié)果表明二種試劑盒對 AMI的臨床意 義均滿意。 圖7 本試劑（Y）與寶靈曼試劑（ X）的相關(guān)性 五、正常值 本試劑盒測定體檢健康人員 30名，結(jié)果CK-MB 為 4.96 ±.95U/L(X 6D),取 95% 的范圍，單測 u= 1.645得4.96 B37（X H645SD）,正常上限定在 <10U/L 肌酸激酶（CK, EC2,7,3,2,）,又稱肌酸磷酸激酶（CK）,是Kuby等于1953年首 先從兔骨骼肌中提取的

14、。 CK是不穩(wěn)定的酶，對光、熱及高 pH敏感，故測定時必須十 分注意測定條件，［4］標(biāo)本最好用血清，除肝素外采血管中不應(yīng)加其它抗凝劑，因為它們 對CK活性有抑制作用。由于標(biāo)本在保存中活性緩緩下降 （4度，24小時活性丟失10%; 25度，1小時丟失10.）,最好采用血后能迅速進(jìn)行測定。如標(biāo)本需儲存，由于 CK在室 溫不穩(wěn)定，所有標(biāo)本都因盡快與細(xì)胞分離保存在 4度，保存時間不應(yīng)超過 24小時；若 24小時內(nèi)不測定需放在-20度冰箱中。 本試劑應(yīng)用美國進(jìn)口的羊抗人 CK-M多克隆抗體，建立并產(chǎn)生了免疫抑制測定 CK-MB方法的試劑盒，采用 N-乙酰半胱氨酸（NAC）代替谷胱昔肽作為激活物質(zhì)

15、，其 穩(wěn)定性和溶解性好，而且測定時不會引起蛋白沉淀；并增加 DETA作為酶激活劑，避免 了使用還原胱甘肽作酶激活劑使 CK-MB結(jié)果偏低的情況。其原因為還原谷胱甘肽 （GSH）中除常混有氧化谷胱甘肽（GSSG）外，本身在保存過程中會部分地被氧化， 而血清中存在的谷胱甘肽還原酶（ GR）則會催化氧化谷胱甘肽生成還原谷胱甘肽，并 同時競爭性地消耗在催化 CK-MB 過程中 產(chǎn)生的 NADPH ,反應(yīng)如下： GSSG+NADPH+H+ _ 2GSH+NADP+ ,致使CK-MB結(jié)果偏低，可造成假陰性結(jié)果， 另外，單磷酸腺甘（AMP）和二腺昔-5-磷酸（Ap5A）亦是試劑盒不可缺少的成分，血 清

16、中腺甘酸激酶（AK）主要來自RBC、PLT、肝和肌肉組織，可催化 ADP產(chǎn)生ATP, 參與反應(yīng)，導(dǎo)致 CK值假性升高，因此分離血清時要保證離去 PLT、RBC等等。雖然 RBC中不存在CK,溶血不直接影響 CK活性；但是RBC中含有豐富的AK ,是測定的 主要干擾物質(zhì)，這種干擾可以通過向底物反應(yīng)混合液中入 AK的抑制劑而減少，最有效 的便是將 AMP和二腺昔-5-磷酸結(jié)合起來使用。因而本試劑對輕度溶血標(biāo)本（如 Hb＜200mg/dl） , CK-MB活性無明顯改變。 本試劑盒測定CK-MB活性顯示精確性和線性良好，對輕度溶血，黃疸及脂血不受 干擾。對AMI血清標(biāo)本和進(jìn)口寶靈曼試劑盒和相關(guān)

17、性良好（ r=0.983）,表明該試劑符合 測定要求。關(guān)于正常值，通過測定30名健康人平均CK-MB為4.96 205U/L ,將其正常 值為＜10U/L ,比寶靈曼試劑正常值（＜25U/L）低。在標(biāo)準(zhǔn)品方面，由于生產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品 提取純化較困難且代價高昂，目前還沒有 CK-MB的國際二級標(biāo)準(zhǔn)品以提高可比性。日 常工作中如使用的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)化不準(zhǔn)或日久失活，將影響工作質(zhì)量，故標(biāo)準(zhǔn)品問題有待進(jìn) 一步研究。值得一提的是，日常工作中應(yīng)注意試劑盒的保存期及保存條件，因生物制品 性質(zhì)不十分穩(wěn)定，要低溫保存和運(yùn)輸，若過了保質(zhì)期有時雖仍一定活性，但相對定量關(guān) 系發(fā)生了改變，對測定結(jié)果有影響，給質(zhì)量控制帶來一定

18、困難。 采用免疫抑制原理測 CK-MB活性，其操作簡單、快速、靈敏度高而具有一定精確 性的方法，適合心肌梗塞患者的急診檢查，也能用于自動分析作批量測定。 ［5］缺點(diǎn)是不 能排除巨CK及CK-MB干擾，在診斷急性心肌梗塞和解釋結(jié)果時應(yīng)謹(jǐn)慎， 由于CK-MB 主要存在于腦組織中，并由于血腦“屏障”作用，血液CK-MB含量甚微而可忽略不計。 因此臨床應(yīng)用時，在排除急性器質(zhì)性腦損害（腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障均受損） 的前提下， 本法測定值大于正常值，特別是 CK-MB>10U/L時，擬可提示急性器質(zhì)性心肌損害，如 AMI。值得一提的是在臨床實(shí)際工作中，急性器質(zhì)性腦損害和心肌梗常不難鑒別。如患 者

19、血中還存在異常 CK時（巨CK1型或線粒體CK）,不能被M抗體所抑制，都將出現(xiàn) 假陽性結(jié)果，［6,7,8］但在多數(shù)情況下其含量很低的， Gerhardt報道這種干擾的頻率大概小 于0.5%,如有疑問時可用電泳法核實(shí)，根據(jù)電泳凝膠止的遷移位置，能把它們與 MB 區(qū)別開來。雖然血清中CK-MB升高是國內(nèi)外公認(rèn)診斷 AMI和確定有無心肌壞死的重要 指標(biāo)，但CK-MB亦有其局限性，在于骨骼肌損傷時也可能釋放出一定量的 CK-MB。 雖一般認(rèn)為骨骼肌含有的 CK-MB在總CK中不超過5%,但也例外。［9］因此當(dāng)CK-MB 增高時，臨床也應(yīng)考慮有無非心肌來源的可能性。 本試驗應(yīng)用的試劑盒用免疫抑制法測定肌酸激酶 -MB同工酶活性，測定省時，能用 于急診，且敏感性高，不失為估計有無心肌梗塞的一種理想方法，隨著試劑盒的供應(yīng)， 自動分析儀的普及，其使用將越來越廣泛。