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1、a-L-巖藻糖昔底物測定AFU的活的評估 元升生物科技技術(shù)研發(fā)部 1概述 a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase, AFU)的分類名為a-L-巖藻糖甘酶水解酶 (EC3. 2. 1. 51),催化巖藻糖甘鍵水解，參與含巖藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋 白和糖脂的分解代謝。AFU合成于細(xì)胞內(nèi)，定位于溶酶體，是一種酸性水解酶， 它的本質(zhì)是糖蛋白。廣泛分布于人體肝、腎、胰、腦和胎盤等組織以及血清、尿 液、唾液和淚液中。AFU在人體內(nèi)呈多形性，在等電聚焦電泳中AFU可分出5? 9條區(qū)帶，血清中AFU除含有PI為4. 68和4. 84兩種主要成分以外，還可見 到5個次要成分。AFU具有3型同

2、工酶，即AFU1、AFU2和AFU3 ,是由1個 位于第一號染色體短臂(1p34)上基因位點的2個等位基因所表達(dá)，由于不同人 所表達(dá)的同工酶類型不同，所以正常人群 AFU活性也有所不同，大約有10%左 右的正常人血漿AFU呈低活性。測定a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase,AFU)對診 斷原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)M有重要臨床意義。它是PHC的特 異性標(biāo)志物，可用于PHC的早期診斷. 2原理 底物CNP-AFU在血清樣本中a-L-巖藻糖甘酶酶作用下，生成產(chǎn)物 CPNP,而產(chǎn)物 CPNP的生成量與樣本中AFU的酶活性成正比，通過測定黃

3、色產(chǎn)物在 405nm波長 的生成速率，即可計算出樣本中AFU的活性。 3實驗方法 3.1 樣本 瑞安市人民醫(yī)院臨床新鮮血清樣品。 3.2 儀器和試劑CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生產(chǎn)，批號 1213M05QH。進(jìn)口底物購自美國sigm心司，批號1013c07QH;儀器為日立7080 全自動生化分析儀、抗壞血酸、膽紅素、人胎盤 a-L-巖藻糖甘酶均購自sigm宓 司，血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自上海血液中心。 3.3 試劑配制方法按常法配制，所用原料均為分析純。 3.4 測定方法 HITACHI 7080自動分析儀參數(shù) 反應(yīng)類型：Rate-A法；反應(yīng)溫 度：37C；波長：（主）3

4、40/（次）405nm；樣本：25口 試齊1」250口 讀點時間6-12點< 4實驗結(jié)果 4.1 精密度評價 按NCCLS評價方案，取低、中、高三個不同濃度的 AFU樣本, 濃度分別為25U/L、68U/L、235U/L,上、下午雙份測定，連續(xù)測定 20d,再每 天測1次，共測20d,結(jié)果見表1 表1批內(nèi)和批問精密度測定結(jié)果（U/L） 樣本 標(biāo)本 次數(shù) 批 內(nèi) 次數(shù) 批 間 x SD CV% x SD CV% 1 低值 20 25 0.55 2.20 20 25 0.60 2.40 2 中值 20 68 0.7

5、8 1.15 20 68 1.02 1.5 3 高值 20 235 2.26 0.96 20 235 2.82 1.2 4.2 線性范圍評價 按NCCLS的評價方案，選用購自sigm/司人胎盤a-L-巖藻糖甘酶 為300U/L和20U/L的高低值酶樣本2份，然后2份樣本等量混合產(chǎn)生中間值160U/L,中 間值再與高低值等量混合，產(chǎn)生230U/L和90U/L的5個不同梯度值樣本，在儀器上以 低值到高值和高值到低值分別測定，求得兩次平均值，以 X作為理論值，Y作為測定 值進(jìn)行回歸分析，其方程Y=0.9986X-0.3714尸0.9994。表明AFU活性在3

6、00U/L范圍內(nèi)， 線性良好。 4.3 比對實驗 取AFU濃度從10?200U/L的不同病人新鮮血清標(biāo)本50份，分別用本公 司合成底物配制的試劑與進(jìn)口底物配制的試劑同時測定 AFU活性，所得數(shù)據(jù)均按 NCCLS文件統(tǒng)計，經(jīng)t檢驗得P>0.05, y=0.9813X-0.3746;r=0.9991表明本試劑與進(jìn)口 試劑高度相關(guān)。 4.4 回收實驗 向250仙血清中加入50仙的生理鹽水作為基礎(chǔ)樣本，測得 AFU濃度為 20U/L ,向同體積的血清標(biāo)本中分別加入 50仙濃度為25U/L和80U/L的AFU酶標(biāo)準(zhǔn)品， 使其終濃度分別為24.2U/L和33.3U/L的樣本，每一濃度作平

7、行管，測得其回收率為 98.5% ?102.4%. 4.5 干擾試驗 在高、低兩個濃度的混合血清樣本中分別加入不同濃度的膽紅素、血 紅蛋白、抗壞血酸（MtC）,然合對AFU進(jìn)行測定，結(jié)果表明三酰甘油0 5.0mmol/L、 Hb<2.5g/L> 膽紅素0 500pmdL、MtC 0 10g/L時經(jīng)配對差異比較，均無顯著干擾 （P<0.05）。而常用抗凝劑中EDTA.K2、草酸鈉對檢測無顯著干擾，但肝素明顯干擾AFU 的檢測，使AFU結(jié)果出現(xiàn)假性偏高，其干擾機理尚不清楚。 5結(jié)論 本公司合成的CNP-AFU底物法用于檢測AFU活性較為理想，該底物在酸性條件 下，樣本中的AFU將含呈色基團的

8、底物CNP-AFU的1, 4位糖昔鍵水解，使反應(yīng) 在405nm處產(chǎn)生最大吸光度，通過測定吸光度的變化，即可計算出樣本中 AFU的 活性。我們對公司合成的該底物用于檢測 AFU酶活進(jìn)行其主要指標(biāo)的評價，具結(jié) 果顯示批內(nèi) CV <2.2% ,批問 CV <2.4%。三酰甘油0 5.0mmol/L、Hb<2.5g/L> 膽紅素W 500pmOL、V讓C010g/L時對結(jié)果無顯著性干擾（P<0.05）;經(jīng)與進(jìn)口底 物配制的試劑比對其結(jié)果高度相關(guān)，完全能滿足臨床檢測要求。 附產(chǎn)品檢測圖（HPLC）:

9、 CHP-AFU 5 1DC- 似34陛常MS 1: Suo ES+ 'If?" MB4 / 274.45 36792 453 多 僅sea 34￡ 46 7?,a< 37^ .01 7M M Q05 Q4 SOO 1CI1&.1C ? l". 1000 ,1567.16 , 11D6-73 1352 73 151Z73 1Q72-7V / ―1怕頭犁〉［二

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