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1、 題 目：基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鑒定研究 摘 要 本實(shí)驗(yàn)是利用采自內(nèi)蒙古賀蘭山的外生菌根真菌子實(shí)體作為研究對象，通過常規(guī)CTAB法對該子實(shí)體進(jìn)行基因組DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4對特異的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中電泳進(jìn)行檢測，并在紫外透射反射分析儀下觀察檢測的結(jié)果，對于較好的擴(kuò)增產(chǎn)物利用回收試劑盒進(jìn)行純化，后將純化產(chǎn)物送由上海生工進(jìn)行DNA測序，將測序所得到的序列輸入GeneBank數(shù)據(jù)庫中的局部相似性查詢（Basic Local Alignment Search Tool,

2、BLAST)程序進(jìn)行比對，列出數(shù)據(jù)庫中與所測得到的序列同源性較高的序列信息并進(jìn)行分類鑒定，然后運(yùn)用軟件raxmlGUI進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。最終的研究結(jié)果顯示該菌種屬于報道的choiromyces helanshanensis。 關(guān)鍵詞：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物學(xué)；鑒定 Abstract In this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongoli

3、a, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were teste

4、d by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of the gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong f

5、or DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequenced sequences and perform the classification and identificat

6、ion. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final results showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia. Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification 目 錄 引

7、 言 1 1 材料與方法 3 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3 1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及藥品 3 1.2.1 試劑配方 3 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 3 1.3.1 基因組DNA的提取 3 1.3.2 rDNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增 4 1.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和純化 5 1.3.4 DNA測序分析 5 2 結(jié)果與分析 6 2.1 PCR產(chǎn)物的檢測 6 2.2 提純效果的檢測 6 2.3 rDNA ITS序列的同源性分析 7 2.4 raxmlGUI系統(tǒng)發(fā)育樹分析 9 3 結(jié)論與討論 10 參考文獻(xiàn) 11 致 謝 12

8、 引 言 賀蘭山坐落于寧夏回族自治區(qū)的西北部，是銀川平原的原始屏障，也是三北防護(hù)林建設(shè)的重點(diǎn)地段[[1]賀永喜.賀蘭山麓野生食(藥)用真菌資源調(diào)查初告[J].中國食用菌,2003(03):7-9. ]。賀蘭山植被類型比較復(fù)雜，既有標(biāo)志山地所在水平地帶屬性的草原和荒漠，也有山地植被垂直系列中出現(xiàn)的針葉林和稀疏草原，還有各種灌叢、草甸和落葉闊葉林[[]李娟.內(nèi)蒙古自治區(qū)賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)森林資源動態(tài)分析[J].內(nèi)蒙古林業(yè)調(diào)查設(shè)計(jì),2013,36(01):42-43. ]。 賀蘭山是我國西北部溫帶草原與荒漠的分界線，同時也是連接蒙古高原、青藏高原及華北植被區(qū)系的重要樞紐。因特殊地理

9、位置及氣候條件越來越受到國內(nèi)學(xué)者的重視。同時獨(dú)一無二的地理位置、地形地勢和天然氣候條件及豐富多樣的生態(tài)系統(tǒng)造就了賀蘭山豐富的真菌資源[[]孫麗華. 賀蘭山（寧夏）大型真菌多樣性及其營養(yǎng)成分的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2012. ]。青海云杉、油松等為組分的森林大約在賀蘭山2000m以上。由于賀蘭山的特殊地勢，對賀蘭山真菌資源進(jìn)行研究調(diào)查和保護(hù)發(fā)展就顯得迫切需要[[]王寬倉,查仙芳.寧夏賀蘭山真菌[J].寧夏農(nóng)林科技,2000(S1):48-51. ]。 菌根（Mycorrhizae）是真菌與植物的根系形成的具有一定的形態(tài)和功能的共生體[[]許美玲,孫軍德,朱教君,康宏樟.樹木外生菌根真

10、菌多樣性研究方法進(jìn)展[J].土壤通報,2005(06):155-160. ]，能夠促進(jìn)林木吸收營養(yǎng)元素。外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi，EMF)是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要成員之一，能與6000多種樹木形成菌根，對維持生態(tài)系統(tǒng)的功能和生物多樣性具有不可代替的作用[[]耿榮,耿增超,黃建,和文祥,侯琳,佘雕,韓其晟,龍東風(fēng).秦嶺辛家山林區(qū)銳齒櫟外生菌根真菌多樣性[J].菌物學(xué)報,2016,35(07):833-847. ]。面臨我國林木連作后生產(chǎn)力明顯下降的近況，研究外生菌根真菌在這個過程中發(fā)揮到底著怎樣的作用，首先要明確外生菌根真菌群落的組成情況和物種多樣性[[]武斌.

11、東北落葉松外生菌根真菌物種多樣性及與土壤因子的關(guān)系[D]. 中國科學(xué)院大學(xué), 2013. ]。正是因?yàn)橥馍婢哂胸S富的物種多樣性，所以宿主植物才能適應(yīng)各種不同的惡劣環(huán)境的影響，并能充分地利用土壤中的各種化學(xué)元素和養(yǎng)分。大量的研究表明，在森林的生態(tài)系統(tǒng)中，如果外生菌根真菌較少，則會影響森林中植被的生長和發(fā)育。外生菌根真菌能促進(jìn)森林生態(tài)系統(tǒng)發(fā)揮其自我調(diào)節(jié)和更新功能，并協(xié)助維持森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。諸多研究表明，植被的生長通常受到重金屬的脅迫，而外生菌根真菌則可產(chǎn)生大量的有機(jī)酸來消除這種重金屬，降低重金屬的有害作用[[]烏仁陶格斯,王娟,昭日格,蘇楞高娃.外生菌根生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)

12、業(yè)科學(xué),2018,46(06):26-28+36. ]。傳統(tǒng)的菌種的分類鑒定通常是采用形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)相結(jié)合的方法，即以觀察子實(shí)體的形態(tài)為基礎(chǔ)，通過形態(tài)學(xué)的特征來對某個菌種進(jìn)行分類鑒定。然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)方法也越來越被廣泛運(yùn)用于菌種的分類鑒定，尤其是基于rDNA ITS序列分析的分子鑒定方法，為屬內(nèi)、種間及種內(nèi)群體菌種的分類鑒定帶來了巨大的便利[[]楊智,王華偉,沙濤.外生菌根真菌的研究進(jìn)展[J].中國食用菌,2016,35(01):1-7. ]。 ITS是rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer)，是真菌核糖體RNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)

13、的一部分。受到的選擇壓力較小，在絕大多數(shù)真核生物中有著極其廣泛的序列多態(tài)性[[]蘇春麗,唐傳紅,張勁松.基于ITS序列的紫芝分子鑒定[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,9(02):121-123. ]。ITS具有兩個顯著的特點(diǎn):(1）進(jìn)化速度較編碼區(qū)進(jìn)化速度快（2）能被獨(dú)立復(fù)制。因此，ITS能在比較廣泛的水平上表現(xiàn)真菌種間變化，通常用于研究低等級，如屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于真菌種類數(shù)目繁多，依靠形態(tài)特征、生化特性等指標(biāo)來鑒定真菌既需要豐富的關(guān)于真菌鑒定的經(jīng)驗(yàn)又需要較長的檢驗(yàn)時間，尤其是對于那些生長條件相同、形態(tài)特征又極其相似的菌種，想要通過傳統(tǒng)的形態(tài)解剖特征來完成真菌的鑒定工作是極為困難

14、的。而基于rDNA ITS的多態(tài)性(包括長度多態(tài)性和序列多態(tài)性)的序列分析，由于可以從不太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息來反映生物的親緣關(guān)系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定研究的主要方向，目前已廣泛應(yīng)用于真菌的屬種間及部分種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學(xué)研究[[]趙育卉,李連強(qiáng),湛東銳,王惠,劉天行,辛志宏.鹽生海蘆筍內(nèi)生真菌S19的分離鑒定與抗氧化發(fā)酵條件優(yōu)化[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,36(02):137-144. ]。 本實(shí)驗(yàn)就是運(yùn)用分子生物學(xué)手段，以外生菌根真菌的子實(shí)體為材料，提取DNA，利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4，利用PCR技術(shù)對外生菌根真菌rDNA的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)

15、增[[] 張文泉. 樟子松外生菌根真菌多樣性及菌根生物技術(shù)研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2013. ]，然后測序并與NCBI（National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中的信息資源進(jìn)行比對以及通過系統(tǒng)發(fā)育樹上所體現(xiàn)的親緣關(guān)系，將外生菌根真菌對應(yīng)到屬或種的水平，對外生菌根真菌進(jìn)行分類研究。從而為豐富賀蘭山真菌的物種多樣性及我國真菌的系統(tǒng)分類研究奠定基礎(chǔ)。 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料是包頭師范學(xué)院植物實(shí)驗(yàn)室提供的采自內(nèi)蒙古賀蘭山的外

16、生菌根真菌的子實(shí)體，編號為HBTTC004。 1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備及藥品 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：電泳儀(DYY-10C/北京六一儀器廠)、PCR自動系列化分析儀(2720/美國ABI公司)、臺式離心機(jī)(CT－14D/上海天美科學(xué)儀器有限公司)、紫外透射反射分析儀（2WF-1/上海金達(dá)生化儀器廠）、電子精密天平（BS223S/賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、高壓蒸氣滅菌鍋、移液槍、微波爐、電熱恒溫水浴箱、超凈工作臺。 實(shí)驗(yàn)藥品：液氮、β—巰基乙醇、2×CTAB提取液、異丙醇、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O（雙蒸水）、氯仿/異戊醇（24:1)、引物ITS1F、引物ITS4、Biospin膠回

17、收試劑盒、Agarose-Molecular Biology Grade(瓊脂糖）、5×TBE緩沖液、Gold ViewⅠ型核酸染色劑、6×DNA Loading Buffer、DL 2000 Plus DNA Marker、1mol/L Tris-HCL(PH=8.0)、0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸鈉)(PH=8.0)、無水乙醇、70%乙醇。 1.2.1試劑配方 1mol/L Tris-HCL(pH=8.0)：取濃鹽酸42mL和Tris 121.1g，加去離子水定容至1升。 5×TBE緩沖液：取Tris 54g和硼酸27.5g及0.5mol/L EDTA（pH=8.0）20

18、mL，加去離子水定容至1升。 2×CTAB：取CTAB 2g、1mol/L Tris-HCL（pH=8.0) 10mL、0.5mol/L EDTA 4mL及5mol/L Nacl 28mL，加去離子水定容至100mL。 0.5 mol/L EDTA（pH=8.0)：取二水乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）186.1g和NaOH 20g，加去離子水定容至1升。 1.3實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法提取外生菌根真菌基因組DNA。 (1)準(zhǔn)備工作：打開水浴鍋，65℃溫浴2×CTAB提取液。 (2)取-20℃下保存的真菌子實(shí)體放入研缽中，加入適量滅菌的

19、石英砂至研缽中，迅速研磨至粉末，取適量倒入1.5mL離心管中，之后向1.5mL離心管中加入65℃已預(yù)熱的2×CTAB提取液600μl，同時加入20μl β—巰基乙醇。 (3)將離心管置于65℃下水浴1h，水浴過程中溫和搖勻數(shù)次，使樣品充分裂解。 (4)取出離心管，加入等體積（約600μl）的24:1的氯仿：異戊醇溶液，混合均勻，25℃，12000rmp離心15min。（同時做好準(zhǔn)備工作：打開4℃離心機(jī)備用） (5)提取上清液（約500μl），加入等體積的24:1的氯仿：異戊醇溶液，4℃，12000rmp離心15min。 (6)提取上清液（約300μl），加入5mol/L KAC約30μ

20、l，然后加入異丙醇約200μl，混勻。 (7)-20℃下過夜。 (8)準(zhǔn)備工作：打開真空干燥機(jī)，預(yù)熱30min。 (9)將過夜樣品置于4℃，9200rmp離心2min。 (10)棄掉液相，加入400μl 70%乙醇，震蕩洗滌3min，再次4℃，9200rmp離心2min。 (11)重復(fù)步驟10一次。 (12)將樣品置于干燥機(jī)中，室溫下抽真空干燥DNA，約15min。 (13)加入65μl去離子無菌水，室溫下溶解DNA樣品后于-20℃下保存。 1.3.2 rDNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增 用ddH2O將提取的基因組DNA稀釋10倍，并以ITS4（5'-TCCTCCGCTTAT

21、TGATATGC-3'）和ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）為引物，以稀釋DNA作為模板，對rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μl（如表1）。 表1 PCR反應(yīng)體系（25μl） 成分組成 成分含量 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl ddH2O 10.5μl 引物ITS1F 0.5μl 引物ITS4 0.5μl 模板DNA 1μl PCR反應(yīng)條件： Stage1：預(yù)變性:94℃ 3min Stage2：step1:變性94℃

22、 30s step2:退火57℃ 1min 30個循環(huán) step3:延伸72℃ 1min Stage3：補(bǔ)平72℃ 5min Stage4：保存4℃ ∞ PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取8μl擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中電泳，電泳的電壓為80V，電泳的時間為1小時，并在紫外透射反射分析儀下觀察拍照，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。 1.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)

23、物的回收和純化 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和紫外透射反射分析儀檢測后，對于較理想PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用Biospin膠回收試劑盒從含有目的產(chǎn)物條帶的瓊脂糖凝膠上回收、純化。具體步驟如下： (1)用鋒利、滅菌的刀片，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，并放入1.5mL的離心管中。 (2)按1：3的比例（凝膠質(zhì)量毫克數(shù)：融膠液體微升數(shù)）加入Extraction Buffer。 (3)于恒溫水浴箱中50℃溫育，直到凝膠融化為止。 (4)將混合液全部轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，于6000rmp離心1min，并棄去接液管內(nèi)的液體。 (5)向Spin column內(nèi)加500μl Extractio

24、n Buffer，于12000rmp離心1min，并棄去接液管內(nèi)液體。 (6)向Spin column內(nèi)加750μl Wash Buffer，于12000rmp離心1min，并棄去接液管內(nèi)液體。 (7)再次于12000rmp離心1min，然后將Spin column轉(zhuǎn)移到無菌的1.5mL離心管中。 (8)向1.5mL離心管內(nèi)加50μl Elution Buffer，并于室溫靜置1min。 (9)于12000rmp離心1min，微量離心管內(nèi)溶液中含有目的DNA片段[[]卞喜座. 玉米輻照誘變及遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012. ]。 1.3.4 DNA測序分析 按照試劑盒

25、步驟要求純化擴(kuò)增后的DNA。并將純化后的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，符合要求后將純化產(chǎn)物送交上海生工生物工程公司完成測序工作。將測序得到的序列輸入GeneBank的局部相似性查詢程序（Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行比對，列出數(shù)據(jù)庫中與被測序列同源性較高的序列信息，從而進(jìn)行分類鑒定研究。然后通過軟件raxmlGUI構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 2結(jié)果與分析 2.1 PCR產(chǎn)物的檢測 本試驗(yàn)采用常規(guī)CTAB法提取外生菌根真菌的基因組DNA，通過PCR技術(shù)將目的rDNA ITS序列片段進(jìn)行擴(kuò)增，以DL 2000 Plus DNA Marker作為參考，在

26、紫外透射反射分析儀下觀察拍照，結(jié)果如下。 圖1 PCR擴(kuò)增后得到的ITS片段的電泳檢測圖 如圖1所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小大概在650bp左右，條帶較為清晰，整齊。由此可見，PCR擴(kuò)增得到的DNA完整性比較好，純度比較高，可以割膠回收用于本次試驗(yàn)的研究。 在PCR過程中，引物的濃度會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，引物濃度較大，將會出現(xiàn)較多的引物二聚體，所以本次試驗(yàn)的引物稀釋了10倍，使得電泳后的的DNA條帶無引物二聚體出現(xiàn)。此外，退火溫度的設(shè)定也將影響PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)過多次探索后，最終是在適宜的退火溫度57℃條件下進(jìn)行的。 2.2 提純效果的檢測 采用Biospin膠回收試劑

27、盒回收純化，將經(jīng)純化后的DNA進(jìn)行檢測。取DNA樣品6μl，加入1μl 6×DNA Loading Buffer，二者充分混合后吸取6μl點(diǎn)樣，電泳的電壓為80V，電泳的時間為1小時，在紫外透射反射分析儀下觀察拍照，結(jié)果如下。 圖2回收試劑盒割膠回收純化產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果 如圖2所示，割膠回收純化得到的DNA經(jīng)電泳檢測后，可以看出是一條清晰的條帶。由此可見，經(jīng)回收試劑盒回收純化的DNA完整性較好、純度較高。樣品片段大小在650bp左右，與預(yù)期的條帶大小相符。已達(dá)到檢測水平，可以送去測序。 2.3 rDNA ITS序列的同源性分析 經(jīng)上海生工測序后，HBTTC004樣DNA序列長度為

28、680bp，運(yùn)用NCBI的序列局部相似性查詢系統(tǒng)（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)，在NCBI序列數(shù)據(jù)庫中檢索與上述 DNA 序列同源性比較高的序列，并進(jìn)行分析比較[[]樊永軍. 內(nèi)蒙古地區(qū)四種樹木外生菌根形態(tài)多樣性及分子鑒定[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2009. ]。選擇同源性較高的18個序列進(jìn)行同源性分析，如表2。由表2得知，所研究的真菌HBTTC004與這18個屬種的同源性較高。這表明研究的真菌HBTTC004與這些屬種親緣關(guān)系較近。 表2 與試驗(yàn)菌株ITS序列同源性高的18個序列 Accession Description Ma

29、x score Total score Query cover(%) E value Identities (%) KU531609.1 Choiromyces helanshanensis voucher HMAS83766 1096 1096 91 0.0 99 KP019344.1 Choiromyces helanshanensis strain 80638 1096 1096 87 0.0 99 KP019343.1 Choiromyces helanshanensis strain 80636 1096 1096 87 0.0

30、 99 KP019345.1 Choiromyces helanshanensis strain 80645 1079 1079 87 0.0 99 KU531606.1 Choiromyces helanshanensis voucher HKAS80641 1077 1077 92 0.0 98 KU531602.1 Choiromyces helanshanensis voucher HKAS80632 1070 1070 95 0.0 96 KU531604.1 Choiromyces helanshanensis voucher HKAS

31、80633 1061 1061 89 0.0 98 KU531603.1 Choiromyces helanshanensis voucher HKAS80630 1048 1048 93 0.0 96 KP019347.1 Choiromyces helanshanensis strain 80644 1038 1038 87 0.0 98 KU531607.1 Choiromyces helanshanensis voucher HKAS80646 977 977 82 0.0 98 NR153899.1 Choiromyces he

32、lanshanensis HKAS 80634 909 909 75 0.0 99 KP019346.1 Choiromyces helanshanensis strain 80634 909 909 75 0.0 99 KP019351.1 Choiromyces helanshanensis strain 80639 944 944 78 0 99 KX510042.1 Uncultured fungus clone NXHLS310 1099 1099 91 0.0 99 LC204921.1 Uncultured fungus

33、 genes for 18S rRNA 442 442 40 0.0 96 KJ769323.1 Uncultured Tuber clone 315 315 29 0.0 95 KY574434.1 Uncultured Tuber clone 309 380 34 0.0 96 KX816330.1 Uncultured fungus clone 309 309 28 0.0 96 Royse等在對土層中分布的外生菌根菌群落進(jìn)行分子鑒定時提出，供試的 rDNA ITS序列與NCBI的GeneBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索比對，序列同

34、源性≥99%，可鑒別為相同種；序列同源性為95%～99%，可鑒別為相同屬；序列同源性≤95%，可鑒別為相同科[[]樊永軍,趙艷玲,閆偉.賀蘭山兩株大型真菌物種分子鑒定與系統(tǒng)地位分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,41(02):153-156. ]。 DNA序列數(shù)據(jù)庫中，在可比較的堿基范圍內(nèi)進(jìn)行DNA序列同源性比較時，BLAST查詢的結(jié)果表明，在數(shù)據(jù)庫中，登錄的一個編號為KU531609.1的ITS區(qū)段DNA序列與本研究的序列最相似，這一個DNA序列共有650個堿基，在BLAST查詢結(jié)果中表明的兩者同源性（Identities）為99%。兩者相比較的score值為1096，E值為0.0，分子

35、鑒定結(jié)果相似率非常的高，且相似率比對得分最高。此外BLAST查詢結(jié)果中列出的34個E值為0的主要同源序列中有20個都屬于Choiromyces helanshanensis。 2.4 raxmlGUI系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將提取的DNA經(jīng)擴(kuò)增，純化后測序，將測序得到的DNA序列運(yùn)用GeneBank的序列相似性查詢系統(tǒng)（BLAST)進(jìn)行比對，選擇數(shù)據(jù)庫中的序列，將其導(dǎo)出。然后運(yùn)用軟件raxmlGUI構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，并以Tuber sp.作為外類群，KF742773.1是在該外類群在NCBI數(shù)據(jù)庫里的登錄名。 圖3基于ITS序列的raxmlGUI軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 raxm

36、lGUI系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌種HBTTC004與KP019344.1聚集在一個分支上，因此可表明二者的相似性最高，KP019344.1屬于Choiromyces helanshanensis，因此結(jié)合BLAST和系統(tǒng)發(fā)育樹的共同結(jié)果，可以將HBTTC004鑒定為Choiromyces helanshanensis。 3結(jié)論與討論 通過CTAB法提取真菌基因組DNA并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4，對特異的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用回收試劑盒進(jìn)行提純，將純化產(chǎn)物送由上海生工進(jìn)行DNA測序，將檢測所得到的序列輸入GeneBank數(shù)據(jù)庫中與已知的相關(guān)序列進(jìn)行局部相似性查詢，最終的研究

37、結(jié)果顯示該外生菌根真菌為報道的Choiromyces helanshanensis。 本試驗(yàn)充分利用了真菌rDNA ITS區(qū)段的保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯的特點(diǎn)，同時借助GeneBank生物數(shù)據(jù)庫的大量信息，從分子水平上對真菌進(jìn)行鑒定。 本試驗(yàn)中的PCR擴(kuò)增過程極其重要。PCR中引物自身以及引物之間很容易形成引物二聚體，應(yīng)防止引物二聚體的生成。引物鏈內(nèi)也應(yīng)防止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，這些因素都將直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗[[]李愛麗,姜濤,馬峙英,賈繼增.提高PCR產(chǎn)物的幾種有效方法[J].生物技術(shù)通報,2003(02):33-35. ]。 真菌的傳統(tǒng)形態(tài)解剖學(xué)鑒定方法受主觀人為因

38、素與實(shí)驗(yàn)條件影響而使分類鑒定工作較困難。分子生物學(xué)的方法較傳統(tǒng)的真菌鑒定方法相比較具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。目前，分子生物學(xué)的鑒定方法成為研究真菌多樣性及真菌群落結(jié)構(gòu)組成的主要技術(shù)手段，使獲得真菌多樣性的數(shù)據(jù)成為可能。本研究的結(jié)果表明，通過對rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行分子測序，進(jìn)而進(jìn)行外生菌根真菌分類鑒定是切實(shí)可行的[[]張靠穩(wěn),楊振華,劉建利,馬愛瑛.四種賀蘭山紫蘑菇rDNA ITS序列分析[J].生物技術(shù)通報,2011(12):88-91. ]。 rDNA ITS序列的分子鑒定方法的廣泛應(yīng)用，不僅可以使外生菌根真菌的物種鑒定更加準(zhǔn)確、快捷，同時也使DNA序列數(shù)據(jù)庫中的信息資源更為豐富。在外生

39、菌根真菌研究中常引用的數(shù)據(jù)庫有NCBI(National Center for Biotechnology Information) 、UNITE(Unified System for the DNA Based Fungal Species)、DDBJ(DNA Date Bank of Japan）和EBI(European Bioinformatics Institute)，在這些數(shù)據(jù)庫中可以進(jìn)行序列比較。這些序列數(shù)據(jù)庫的建立，不僅使得人們可以快速、方便地查詢DNA序列，同時也使得生物信息資源發(fā)揮出其最大的作用，減少了人們工作的負(fù)擔(dān)，推動了生命科學(xué)進(jìn)程的發(fā)展。 無論真菌的屬或種的名稱隨著

40、研究進(jìn)展怎樣變化，在保證菌種信息和實(shí)物可靠以及菌種純度的條件下，對于我國的大量真菌資源進(jìn)行真菌rDNA ITS序列測定，在屬的水平上初步確定真菌資源的分類地位，有利于真菌資源今后的準(zhǔn)確鑒定和其他研究，是對我國大量真菌資源快速鑒定的相對簡便的途徑[[]姜雨萌,牛永春,鄧暉.rDNA ITS序列在ACCC真菌鑒定中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報,2016,43(05):942-947. 致 謝 首先要感謝我的論文指導(dǎo)老師趙艷玲老師。趙艷玲老師對我論文的研究方向做出了指導(dǎo)性的意見，在論文撰寫過程中及時對我遇到的困難和疑惑給予悉心指點(diǎn)，提出了許多有益的改善性意見，投入了超多的心血和精力。同時還要感謝楊立國老師和王靜老師提供實(shí)驗(yàn)室及試驗(yàn)儀器以及同學(xué)們的幫助。最后，感謝我的家人對我大學(xué)四年的默默支持。 ]。 隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，相信rDNA ITS序列分析在外生菌根真菌分類鑒定中的應(yīng)用將會有更大的發(fā)展空間。 參考文獻(xiàn) 12