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1、 臨床檢測樣本 RNA 提取方法的比較研究 摘要：選擇市售的三種細(xì)胞裂解液（Liaison Plus、Troll Plus 和RNAOUT）和兩種 DNA\RNA共提試劑盒（柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒），分別對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和乙型腦炎病毒（JEV）三種病毒 RNA 進行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和 Real-time PCR 間接評價所提取的 RNA 質(zhì)量。結(jié)果表明：對于瓊脂糖凝膠電泳，上述三種細(xì)胞裂解液和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組均可見清晰且高亮的條帶，

2、可用于臨床 RNA 病毒檢測以及定性分析。對于Real-time PCR，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒 CT 值最低，Liaison Plus、Troll Plus 兩種細(xì)胞裂解液其次，以上三種試劑可用于臨床 RNA 病毒檢測以及定量分析。 關(guān)鍵詞：RNA；提取方法；比較；臨床 Comparison of Methods of clinical test samples RNA extraction Abstract：Three commercially available cell sates (Liaison Plus, Troll Plus and RNAOU

3、T) and two DNA / RNA co-kits (ALCMENA double-kit, Queasy rapid DNA / RNA co-kit) were selected to extract three animal RNA viruses（PRRSV, CSFV and JEV）. The RNA quality was evaluated indirectly by agaric gel electroplate and Real-time PCR. The result shows, for agaric gel electroplate, the clearly

4、 and highlight bands can be seen above the groups of the three cell sates and Queasy rapid DNA / RNA co-kit, which can be used for clinical RNA virus detection and qualitative analysis. For Real-time PCR, the CT value of the Queasy rapid DNA / RNA co-kit group is the lowest, and the two cell sates g

5、roups(Liaison Plus, Troll Plus) followed. The above three reagents can be used for clinical RNA virus detection and quantitative analysis. Key words: RNA；Extraction Method；Comparison；Clinical RNA 是生物體重要的遺傳物質(zhì)[1]。近年來，越來越多的科研結(jié)果表明，RNA 在生命進程中的作用遠(yuǎn)不止于此，在 2002 年度 Science 評選的 10 大科學(xué)成就中 RNA 名列榜首。 RNA 分子

6、提取是生物學(xué)研究中的一項基本內(nèi)容，是進行基因表達分析的基礎(chǔ)[2]。對于 DNA 文庫構(gòu)建、熒光定量 PCR、CRT、Northern 雜交等下游分子生物學(xué)實驗來說，都需要質(zhì)量好的，完整性高的 RNA[3]。 在所有 RNA 試驗中最關(guān)鍵的因素是分離得到全長 RNA。分離出純度高且完整的 RNA 是進行基因表達分析及 RNA 結(jié)構(gòu)功能研究的基礎(chǔ)。在所有 RNA 實驗中，最關(guān)鍵的步驟是分離得到純度高且完整的 RNA。，從組織細(xì)胞中分離純粹完整的 RNA 對于分子克隆和基因表達分析等試驗是至關(guān)重要的[4,5] Chomsky 和 Sac chi 第一次提出了用異硫氰酸胍法提取細(xì)胞內(nèi)的 RNA

7、[6]， 使得 RNA 的提取過程變得簡便快捷。常見的 RNA 提取方法有強變性劑法[7]、CTAB 法[8]、ADS-Phenol 法[9]以及熱硼酸法[10]等。在商品化的今天，國內(nèi)外生物試劑公司研發(fā)出了許多 RNA 提取試劑盒。比如 Tamara 公司的 Liaison Plus； Inviting 公司的 Tripoli 總 RNA 提取試劑盒以及 Pure Link? RNA Mini Kit；上海生工的 UNlQ-10 柱式 Tripoli 總 RNA 抽提試劑盒；Omega 公司的 RNA 小量提取試劑盒（Bacteria RNA kit）以及高純 RNA 抽提試劑盒（HP

8、 total RNA kit）； Engage 公司的 RN easy Protect Bacteria Mini and Midi Kits 等。都可以從病料組織或者培養(yǎng)細(xì)胞中快速有效地提取出高質(zhì)量高純度的 RNA。 實時熒光定量 PCR 的原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)[11,12]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當(dāng)一個熒光分子（供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時，供體熒光分 子自身的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。Ct 值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct 值是實時熒光 PCR 中一個很關(guān)鍵的因素，C 代表循環(huán)（Cycl

9、e）， t 代表閾值（Threshold）。每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-15]。因此，根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度與 PCR 產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系，只要對熒光信號進行“實時”檢測并獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通 PCR 相比，實時熒光定量 PCR 可以利用熒光信號實時監(jiān)測 PCR 反應(yīng)過程中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物的變化， 可以對初始模板量進行定量分析。簡單地說，實時熒光定量 PCR 的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系

10、和條件完全一致的情況下，樣本 DNA 含量與擴增產(chǎn)物的對數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物（熒光探針）與擴增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量[16-18]。 大量的研究實驗證明：雖然提取 RNA 的方法很多，但是其基本都是把細(xì)胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白質(zhì)、DNA 等雜質(zhì)為目標(biāo)。而且材料自身物理化學(xué)性質(zhì)的不同，不同的材料需要不同的提取方法［19 ,20］。因此，需要通過對比試驗，針對不同細(xì)胞組織，選擇更加合適的 RNA 提取方法。 1 材料與方法 1.1 試劑 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株，中

11、牧實業(yè)股份有限公司），豬瘟耐熱保護劑活疫苗（成都天邦生物制品有限公司，），日本乙型腦炎弱毒活疫苗 （SA14-14-2 株），Troll Plus 總 RNA 提取試劑（南京天為生物科技有限公司），動物 RNAOUT（北京天恩澤基因科技有限公司），Liaison Plus（寶生物工程有限公司），柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒（上海快靈生物科技有限公司），氯仿（），乙醇（），異丙醇（上海申博化工有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（），Mixture（） 1.2 總 RNA 提取 1.2.1 細(xì)胞裂解液法提取

12、RNA (1) Liaison Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μL，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入

13、 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 （2） RNAOUT 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μ

14、L，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 （3） Troll Plus 法 取疫苗稀釋液 100μL，加 dH2O 稀釋到 500uL，加 700μL 細(xì)胞裂解液；劇烈振蕩，靜置 5—15min，充分反應(yīng)，期間振蕩搖勻；加氯仿 200μL，劇烈振蕩，靜置 5min； 12000rpm/min，4℃離心 5min；吸取 600μL

15、 上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-20℃保存 30min 以上；12000rpm/min 離心 15min，棄上清； 加入 400μL，75%的乙醇，顛倒 4 次；12000rpm/min 離心 5min，棄上清； 12000rpm/min，瞬離，吸干；吹干；每空加入 30—40μL Release free dH2O，-80℃ 保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV）。每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 1.2.2 柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 離心管中加入 100μL 疫苗稀釋液，加入 600μL 溶液 A

16、，振蕩 30s 混勻后室溫放置 10min（溶液 A 在 4℃放置后可能產(chǎn)生沉淀，使用前必須放入 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用）；短暫離心后，將 500μL 溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置 2min；12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的的穿透液，把離心柱放回到收集管中；將剩余的溶液短暫離心后全部轉(zhuǎn)移到上一步的離心柱中，室溫放置 2min；12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的的穿透液，把離心 柱放回到收集管中；加入 700μL 的通用洗柱液到離心吸附柱中，12000rpm 室溫離心 1min，棄收集管中的穿透液，把離心柱放回到收集管中；12000

17、rpm 室溫離心 1min（干甩），棄含穿透液的離心管；將干甩后的離心吸附柱套入到一個自備的 Freebase 的 1.5mL 離心管中，在離心吸附柱的中心加入 30—40μL 的洗脫液，然后室溫放置 2min；12000rpm 離心 1min，離心管中為 RNA 溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩? 其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 1.2.3 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒法提取 RNA 在 1.5mL 了離心管中加入 100μL 處理好的樣本液，然后加入 300μL 核酸提取液，振蕩混勻，室溫靜置 2—3min；加入 400μL

18、 異丙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 5min，棄凈溶液；加入 600μL 50%異丙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 1min，棄凈溶液； 加入 600μL 75%乙醇，振蕩混勻，12000rpm 離心 1min，棄凈溶液；離心管短暫離心 5—10s 后，用 10μL 槍頭棄凈溶液，若管底出現(xiàn)少量沉淀，可開蓋室溫干燥2—3min；加入 10—30uL 洗脫液，振蕩混勻后短暫離心，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 1.3 RNA 質(zhì)量檢測 1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 分別取 RNA 樣品 6μL，加入

19、Ac Curt Reaction Mix（4X）2μL，混勻后室溫放置 2min；加入 Ac Curt Reaction Shoppe（r 5X）2μL，5X All-in-One RT Choirmaster 4μL， Antinuclear H2O 6μL，總體系為 20μL 進行 CRT（25℃ 10min，42℃ 50min， 85℃ 5min）。將反應(yīng)生成的 DNA 分別用于普通 PCR，分別取 RNA 4—5 μL，在 1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，85 V 恒壓 25 min。紫外燈下照射觀察條帶，并拍照記錄結(jié)果。 其中，RNA 樣品有三種（PRRSV、CSFV

20、 和 JEV），每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 1.3.2 Real-time PCR 分別取 RNA 樣品 6μL，加入 Ac Curt Reaction Mix（4X）2μL，混勻后室溫放置 2min；加入 Ac Curt Reaction Shoppe（r 5X）2μL，5X All-in-One RT Choirmaster 4μL， Antinuclear H2O 6μL，總體系為 20μL 進行 CRT（25℃ 10min，42℃ 15min， 85℃ 5min）。 其中，RNA 樣品有三種（PRRSV、CSFV 和 JEV），每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。而后配置 Real-time

21、 PCR 體系，如下： 體系： SYBR Premix EX Ta Ⅱ（2x）： 10 AL PCR Forward Primer： 0.6 AL PCR Reverse Primer： 0.6 AL DNA 模板 2 AL 三蒸水 6.8 AL 總 20 AL 兩步法 PCR 擴增標(biāo)準(zhǔn)程序： Stage1：預(yù)變性Reps：1 95℃ 30 秒 Stage2：PCR 反應(yīng) Reps：40 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-time PCR 的擴增曲線和融解曲線，按照內(nèi)參基因和目的基因的擴增結(jié)果，應(yīng)用 2ΔΔCT 的方法技術(shù)最終的 CT 值；

22、評價擴增的效果，間接評價核酸的提取效果。 上述反應(yīng)應(yīng)用 ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（美國 Applied Bio systems 公司）進行。其中，每組試驗設(shè)立三個重復(fù)。 2.結(jié)果 2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果 2.1.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株）檢測結(jié)果 從圖 1 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組，電泳條帶亮度和清晰度很高，彼此之間無肉眼可見差距；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 1 PRRS

23、V DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組，依次對應(yīng)Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.1.2 豬瘟耐熱保護劑活疫苗檢測結(jié)果 從圖 2 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組，電泳條帶亮度和清晰度很高。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組條帶最清晰、亮度

24、最高；Liaison Plus 和 RNAOUT 對應(yīng)的組條帶中度清晰、亮度中等，但兩組之間無肉眼可見差距； Troll Plus 對應(yīng)的組清晰度較低，亮度低；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 2 CSFV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組，依次對應(yīng)Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.1.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測

25、結(jié)果 從圖 3 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組之間，電泳條帶亮度和清晰度很高。其中， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高；Liaison Plus 和 RNAOUT 對應(yīng)的組條帶中度清晰、亮度中等，但兩組之間無肉眼可見差距；Troll Plus 對應(yīng)的組清晰度較低，亮度低；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。 圖 3 JEV DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 （M 為 Marker，0 為空白對照，1-3、4-6

26、、7-9、10-12、13-15 分別為 3 個平行組，依次對應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2 Real-time PCR 檢測結(jié)果 2.2.1 高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R 株）檢測結(jié)果 從圖 4 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組

27、CT 值最低；Liaison Plus 和RNAOUT 對應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 對應(yīng)的組 CT 值稍高；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最高。 圖 4 PRRSV Real-time PCR 檢測結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2.2 豬瘟耐熱保護劑活疫苗檢測結(jié)果 從圖 5 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Pl

28、us、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最低；Liaison Plus 和 RNAOUT 對應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 和柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值稍最高，但兩組間差距不明顯。 圖 5 CSFV Real-time PCR 檢測結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DH

29、ARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 2.2.3 日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測結(jié)果 從圖 6 可以看出，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值均較低。其中，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最低；Liaison Plus 和 RNAOUT 對應(yīng)的組 CT 值其次，但兩組間差距不明顯；Troll Plus 對應(yīng)的組 CT 值稍高；柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最高。 圖 6

30、JEV Real-time PCR 檢測結(jié)果 （Tamara、天恩澤、天為、天恩澤盒、快靈盒依次對應(yīng) Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus、柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒） 3 討論 RNA 的提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)[21]，如何提取從動物細(xì)胞和組織中提取高質(zhì)量的 RNA 更是科研研究和病原診斷的關(guān)鍵。只有獲得高純度、高濃度和完整性好的 RNA 才能更好的進行下游反應(yīng)，如 DNA 文庫構(gòu)建、熒光定量 PCR、CRT、 Northern 雜交等下游分子生物學(xué)實驗。 RNA 的提取關(guān)鍵在于組織細(xì)胞裂解。組織

31、裂解方法有很多，包括胍鹽裂解法、堿裂解法、CTAB 裂解法和酚油抽提法等，這類方法雖然具有提取高純度核酸的優(yōu)點，但是普遍存在實驗步驟多、操作繁瑣、耗時長以及部分存在毒性等缺點[22]。隨著生物產(chǎn)業(yè)的商業(yè)化發(fā)展，很多試劑公司根據(jù)組織裂解的方法設(shè)計出了很多商品化試劑，比如 Tamara 公司的 Liaison Plus、天為生物科技有限公司的 Troll Plus，天恩澤基因科技有限公司的動物 RNAOUT 等。這些試劑可以從動物組織、培養(yǎng)細(xì)胞和微生物中簡單、快速的提取 RNA，且獲得的 RNA 完整性好，純度高操作過程簡單，并且毒性小，實驗危險性小。 通常情況下，分子生物學(xué)試驗只需單獨提取一

32、種類型的核酸（DNA/RNA）或蛋白質(zhì)。如果想要同時獲得 DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)，則需要分別提取。顯然這種方式效率不高，因此，隨著科技的進步，出現(xiàn)了很多商品化試劑盒，如天恩澤基因科技有限公司的柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒法、快靈生物科技有限公司的 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒等。此類方法操作起來簡便，時間短，可以同時提取 DNA 和 RNA，毒性小，且獲得的核酸完整性好，純度高等。 筆者所在實驗室選取了市售的三種細(xì)胞裂解液（Liaison Plus、Troll Plus 和 RNAOUT）和兩種 DNA\RNA 共提試劑盒（柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒、

33、 Queasy 快速DNA/RNA 共提試劑盒）。分別對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和乙型腦炎病毒（JEV）三種疫苗毒的 RNA 進行提取，而后進行 CRT 將所提取的 RNA 轉(zhuǎn)換成 DNA，分別用于普通 PCR 并進行瓊脂糖 凝膠電泳和 Real-time PCR，之后分別通過瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰度、亮度和Real-time PCR CT 值來間接對所提取 RNA 質(zhì)量作評價和比較。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，對于 PRRSV，Liaison Plus、RNAOUT、Troll Plus 和 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應(yīng)的組均可見清

34、晰度高，亮度高的條帶，表明對應(yīng) DNA 質(zhì)量好，間接表明所提取的 RNA 質(zhì)量好。因此，上述試劑可用于臨床 PRRSV 的病毒檢測以及定性分析。對于 CSFV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高，其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，Troll Plus 稍差。因此，對于臨床 CSFV 的病毒檢測以及定性分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對于 JEV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒所對應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高， 其次是 Liaison Plus

35、 和 RNAOUT，Troll Plus 稍差。因此，對于臨床 JEV 的病毒檢測以及定性分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 Real-time PCR 結(jié)果表明，對于 PRRSV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最低，表明對應(yīng)的 DNA 濃度和純度最好，間接說明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此，對于臨床 PRRSV 的病毒檢測以及定量分析， 首選 Queasy 快速

36、DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和RNAOUT。對于 CSFV， Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最低，表明對應(yīng)的 DNA 濃 度和純度最好，間接說明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此， 對于臨床 CSFV 的病毒檢測以及定量分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。對于 JEV，Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒對應(yīng)的組 CT 值最

37、低，表明對應(yīng)的 DNA 濃度和純度最好，間接說明所提取的 RNA 質(zhì)量最好。其次是 Liaison Plus 和 RNAOUT，柱式病毒 DHARNA 雙提試劑盒和 Troll Plus 表現(xiàn)不理想。因此，對于臨床 JEV 的病毒檢測以及定量分析，首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒、Liaison Plus 和 RNAOUT。 本次實驗僅僅對 PRRSV，CSFV 和 JEV 三種 RNA 病毒的疫苗毒 RNA 進行提取比較。以上三種病毒均為臨床常見的 RNA 病毒，具有代表性。通過比較分析實驗結(jié)果，筆者認(rèn)為當(dāng)臨床需要對 PRRSV，CSFV 和 JEV 三種 RNA 病

38、毒進行檢測時，可首選 Queasy 快速 DNA/RNA 共提試劑盒和 Liaison Plus 和 RNAOUT 兩種細(xì)胞裂解液，獲得的 RNA 質(zhì)量好，利于后續(xù)實驗的進行。 隨著科學(xué)技術(shù)的進步，市面上已經(jīng)出現(xiàn)自動核酸提取儀，如 ABI 公司的 ABI PRISMTM 6100 核酸提取儀，半個小時即可完成 96 個樣品的純化工作，并且可純化來自多種生物樣本的總 RNA 和基因組 DNA[23]。隨著科技的發(fā)展，類似的儀器也在不斷出現(xiàn)和升級，但由于成本較高，且有時并不需要同時提取 96 個樣本，因此多數(shù)高校和科研機構(gòu)并未普及。 每種 RNA 提取方法均有其各自的優(yōu)勢，如何選擇合適的 RN

39、A 提取方法應(yīng)根據(jù)提取對象、所需濃度和數(shù)量、時間以及純度等來綜合選擇。隨著科學(xué)技術(shù)的進步， 相信動物組織 RNA 提取的方法會越來越簡便、快速、高效。 致謝 參考文獻： [1] Jun H L, Chan H T. A simple rapid and effective method for total RNA extraction from Tendentiousness [J]. Biotechnology, 2006, 28: 1193-1197 [2] Brooks，Joseph，Edward F Kitsch，Thomas Mannerist．Molec

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