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1、大鼠急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病模型的建立           趙天智，常耀明，李金聲，謝小萍 【關(guān)鍵詞】  Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦病；大鼠 　　Establishment of delayed neuropsychologic sequelae rat model after acute carbon monoxide poisoning 　　【Abstract】 AIM: To establish the delayed neuropsychol

2、ogic sequelae rat model after acute carbon monoxide (CO) poisoning for further elucidating its pathogenesis. METHODS: Male SD rats (240-280 g BW) were poisoned with CO in the animal experimental hyperbaric oxygen chamber. Cognitive ability was measured by the escape latency of searching the objectiv

3、e in the Morris water maze. The brains of the rats (3, 7, 10, 20 d after poisoning) were taken for paraffin pathological section and HE staining to observe the pathological change in cerebral cortex and hippocampal area. RESULTS: Rats lost consciousness when they were exposed to 2000 ppm (part per m

4、illion) CO for 40 min and then 3000 ppm for up to 20 min. Maze test showed that the escape latency of the CO poisoned rats was significantly longer than the air exposed rats (F=4.74，P=0.047). The pathological examination revealed apparent neuronal degeneration and necrosis in the cerebral cortex and

5、 hippocampal area in CO poisoned rats. CONCLUSION: Besides the evidence of pathologic results, our models basically simulate the praxiologic change induced by central nervous system damage in the patients with delayed neuropsychologic sequelae after CO poisoning. 　　【Keywords】 Morris water maze;&n

6、bsp; carbon monoxide poisoning; delayed neuropsychologic sequelae; rats 　　【摘要】 目的: 建立大鼠急性一氧化碳〔CO〕中毒致遲發(fā)性腦病模型，以探討其發(fā)病機(jī)制. 方法: 質(zhì)量240~280 g雄性SD大鼠，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)行急性CO暴露，以Morris水迷宮中搜索目標(biāo)的逃避潛伏期(escape latency)來評(píng)價(jià)大鼠的認(rèn)知記憶能力，并于染毒后3，7，10，20 d取腦組織，常規(guī)制備石蠟病理切片，行HE染色觀察急性CO中毒后大鼠腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的病理性改變. 結(jié)果:大鼠在2000×10-6體積分?jǐn)?shù)CO濃度和

7、3000×10-6體積分?jǐn)?shù)CO濃度下分別暴露40 min和20 min后全部昏迷，Morris水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)CO暴露組大鼠逃避潛伏期顯著落后于空氣對(duì)照組〔F=4.74，P=0.047〕，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)CO暴露組大鼠的皮質(zhì)及海馬有明顯的神經(jīng)元變性壞死. 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)建立的模型根本模擬了CO中毒后遲發(fā)性腦病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學(xué)特征改變，且有相應(yīng)的病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果作為其佐證. 　　【關(guān)鍵詞】 Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦?。淮笫? 　　【中圖號(hào)】 R595.1 　　0引言 　　一氧化碳〔carbon monoxide, CO〕中毒后3%~30%的患者經(jīng)過一

8、段時(shí)間的“假愈期〞會(huì)出現(xiàn)以癡呆、精神病癥和錐體外系病癥為主遲發(fā)性腦病(delayed neuropsychologic sequelae, DNS)［1］. 目前其發(fā)病機(jī)制仍未完全說明，缺少可靠的動(dòng)物模型是阻礙其深入研究的重要原因之一［2］，主要問題在于中毒濃度的掌握和動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)方法的缺陷上. 因此，我們嘗試采用急性靜態(tài)CO吸入的方法制備大鼠的DNS動(dòng)物模型，并采用Morris水迷宮來評(píng)價(jià)中毒后大鼠認(rèn)知記憶能力的改變，為進(jìn)一步研究DNS的發(fā)病機(jī)制提供客觀有效的手段. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1CO氣體于染毒前新鮮制備. 　　1.1.2染毒裝置D

9、WC4501150型〔上海七零一所〕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙，艙體為直徑0.45 m，長(zhǎng)1 m的圓筒形，有效空間160 L，可同時(shí)對(duì)4只大鼠染毒. 　　1.1.3行為實(shí)驗(yàn)裝置由Morris水迷宮和圖像自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)(Morris Maze Experimental Assistant System, MMEAS)組成〔第四軍醫(yī)大學(xué)防原教研室提供〕. Morris水迷宮為內(nèi)壁黑色的不銹鋼圓柱形儲(chǔ)水池(d=100 cm，h=50 cm)，內(nèi)置一個(gè)高度可調(diào)位置可移動(dòng)的黑色圓臺(tái)，圓臺(tái)頂部直徑為10 cm. 在水池上緣等距離設(shè)置東南西北四個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，以這四個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)，將水面和水池均分為四

10、個(gè)象限，圓臺(tái)設(shè)置于某一象限中間. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，使水深淹沒圓臺(tái)頂部2 cm，調(diào)節(jié)水溫至22～24℃之間. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期之內(nèi)室內(nèi)物品擺設(shè)和實(shí)驗(yàn)人員站立位置相對(duì)固定，并嚴(yán)格控制噪聲干擾. MMEAS系統(tǒng)以圖像采集卡、攝像機(jī)、圖像監(jiān)視器等為主要擴(kuò)展硬件，利用圖像軟件包提供的各層次庫函數(shù)完成數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)處理. 　　1.1. 14實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群健康成年雄性SpragueDawley大鼠〔第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〕，約9～10 wk齡，體質(zhì)量為240～280 g. 飼養(yǎng)于12 h明暗交替，室溫18~23℃環(huán)境，喂飼標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，不限食水. 　　1.2方法 　　1.2.1染毒方法參照Th

11、om等［ 3］報(bào)道的染毒方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將清醒大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)〔每次最多4只〕密封艙門，由進(jìn)氣口參加制備的純潔CO氣體，使艙內(nèi)CO氣體濃度到達(dá)2000×10-6體積分?jǐn)?shù)，維持40 min，后補(bǔ)加氣體達(dá)3000×10-6體積分?jǐn)?shù)，約20 min，至大鼠出現(xiàn)昏迷時(shí)止. 　　1.2.2Morris水迷宮行為測(cè)試16只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 wk后，隨機(jī)分為CO暴露組和空氣對(duì)照組，每組8只. 大鼠于CO暴露后的第二日上午10點(diǎn)開始行水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)從除站臺(tái)外的三個(gè)象限隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，每一次入水位置是假性隨機(jī)的. 觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(

12、逃避潛伏期)，如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，那么人為引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái)且停留30 s，這時(shí)逃避潛伏期為120 s. 實(shí)驗(yàn)每隔一日進(jìn)行一次，持續(xù)到染毒后21 d，每次實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練3次，每個(gè)象限一次，每次間隔20 min，3次成績(jī)的平均值記為當(dāng)天成績(jī). 　　1.2.3病理學(xué)檢查28只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 wk后，隨機(jī)分為A，B，C，D，E 5組，其中A，B，C，D 4組為實(shí)驗(yàn)組，每組5只，E組8只為空氣對(duì)照組. 實(shí)驗(yàn)組按上述染毒方法予以染毒，對(duì)照組按相同步驟注入空氣. A，B，C，D 4組分別于染毒后3，7，10，20 d取腦，實(shí)驗(yàn)組取腦同時(shí)取2只E組大鼠作為對(duì)照. 大鼠用20 g/L戊巴

13、比妥鈉(60 mg/kg) 腹腔麻醉，開胸暴露心臟，插管，由左心室經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水200 mL, 40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PB液400 mL，斷頭取腦，再置于多聚甲醛PB液中浸泡24 h，根據(jù)大鼠腦定位圖譜選取冠狀切面〔Bregma4.16 mm〕海馬與齒狀回互包平面，按常規(guī)脫水、媒染、浸蠟步驟，將組織塊包埋制成蠟塊，石蠟切片機(jī)連續(xù)切取厚5 μm的切片，行HE染色. 　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量資料方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 　　2結(jié)果 　　2.1大鼠染毒表現(xiàn)2000×10-6體積分

14、數(shù)CO氣體濃度下，前15 min大鼠表現(xiàn)活潑，有輕度的興奮和躁動(dòng)，隨后的25~40 min，大鼠呼吸急促，呼吸幅度明顯增大，口鼻粘膜及耳、爪、尾皮膚成櫻桃紅色，補(bǔ)加氣體濃度至3000×10-6體積分?jǐn)?shù)時(shí)，大鼠出現(xiàn)躁狂，隨后四肢癱軟無力，至60 min時(shí)大鼠全部昏迷，出艙后吸入空氣直至意識(shí)恢復(fù). 　　2.2Morris水迷宮測(cè)試兩組大鼠爬上平臺(tái)的逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)組次的增加而縮短. 經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料方差分析，CO暴露組大鼠逃避潛伏期落后于空氣對(duì)照組〔F=4.74，P=0.047, 表1〕. 　　表1兩組大鼠平均逃避潛伏期〔略〕 　　2.3HE染色正常對(duì)照組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元呈圓形或

15、橢圓形，細(xì)胞形態(tài)正常，核膜完整，核仁清晰可見，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色〔圖1A，B〕. CO中毒組大鼠腦內(nèi)有廣泛的病理改變，皮質(zhì)、海馬、以及齒狀回出現(xiàn)大量的神經(jīng)元變性壞死. 皮質(zhì)中以頂葉及顳葉皮質(zhì)損傷最為嚴(yán)重，可見點(diǎn)片狀壞死，壞死神經(jīng)元呈三角形或多角形，細(xì)胞縮小，細(xì)胞核固縮，核仁不明顯，周圍出現(xiàn)空暈，在變性壞死的神經(jīng)元周圍可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)〔圖2A〕；海馬錐體細(xì)胞層變薄，兩側(cè)細(xì)胞稀疏，CA1區(qū)和CA4區(qū)壞死明顯〔圖2B〕. 以上病理改變?cè)?組腦切片中均可觀察到，以B組、C組最為明顯. D組大鼠腦切片中還可以見到壞死神經(jīng)元被吸收后所留下的龕影〔圖2C〕，其周亦可見到膠質(zhì)細(xì)胞的蹤跡. 　　3討論

16、　　日常生活中的CO中毒，主要是經(jīng)由呼吸道吸入引起，因此，CO中毒模型多采用吸入染毒法制備，一般可分為動(dòng)式和靜式兩種. 動(dòng)式吸入染毒有濃度較穩(wěn)定、可防止缺氧及二氧化碳蓄積等優(yōu)點(diǎn)，但該法所需儀器昂貴，CO消耗量巨大，難以普遍應(yīng)用. 我們采用靜式吸入法對(duì)大鼠進(jìn)行染毒來制備DNS模型，CO的使用量不多，實(shí)驗(yàn)室即可自行配置，且染毒艙體的體積較大可有效防止長(zhǎng)時(shí)間染毒過程中氧分壓降低，二氧化碳分壓上升所導(dǎo)致缺氧對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，并可同時(shí)對(duì)多只大鼠染毒. 　　圖1對(duì)照組大鼠組織結(jié)構(gòu)HE ×400〔略〕 　　圖2大鼠組織結(jié)構(gòu)改變HE ×400〔略〕 　　CO中毒后DNS患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)

17、主要表現(xiàn)出癡呆、記憶力受損、定向力障礙等病癥［1］. 而經(jīng)典的Morris水迷宮所檢測(cè)的是大鼠在屢次的訓(xùn)練中，學(xué)會(huì)尋找固定位置的隱蔽平臺(tái)，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知的能力. 從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶應(yīng)該屬于陳述性記憶. 而臨床健忘和癡呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比擬突出. 與過去的跳臺(tái)、避暗等檢測(cè)工具相比，Morris水迷宮主要優(yōu)點(diǎn)在于:能系統(tǒng)全面地考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工的過程，客觀地反映其認(rèn)知水平；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺、運(yùn)動(dòng)缺陷等別離開來，而且對(duì)動(dòng)物的傷害性刺激作用較小，減少了對(duì)學(xué)習(xí)記憶過程檢測(cè)的干擾［4］. 所以，我們選取Morris水迷宮作為CO中毒后

18、DNS大鼠模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法. 在Morris水迷宮測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，CO暴露組大鼠的逃避潛伏期落后于空氣對(duì)照組〔F=4.74，P=0.047〕，提示CO暴露組大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知記憶功能的障礙. 　　海馬區(qū)與大腦學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，其損傷會(huì)對(duì)這一功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，而DNS患者臨床表現(xiàn)正是以癡呆、記憶力受損等神經(jīng)功能紊亂病癥為主，提示海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的遲發(fā)性壞死可能是DNS發(fā)病的病理根底. 我們復(fù)制的大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)檢查顯示:CO暴露后3 d，大鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)變性和壞死，至7~10 d時(shí)最為嚴(yán)重，并至少持續(xù)到20 d，與Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷的結(jié)

19、果相符合. 臨床上DNS患者的影像學(xué)表現(xiàn)亦與本研究結(jié)果相符，如張鐳［5］報(bào)道在CT檢查中，海馬回病變是CO中毒遲發(fā)腦病和急性CO中毒的特異表現(xiàn)；MRI上亦可顯示皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)異常高信號(hào)等［6］. 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的模型根本模擬了CO中毒后DNS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學(xué)特征改變，且有病理學(xué)檢測(cè)的結(jié)果為這種改變提供了佐證. 　　【參考文獻(xiàn)】 　?。?］ Piantadosi CA. Carbon monoxide poisoning ［J］. Undersea Hyperb Med, 2004, 31:167-177. 　?。?］ Raub JA, Mathieu N

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