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1、 一、微生物的培養(yǎng)與應用 1.微生物的實驗室培養(yǎng) (1)培養(yǎng)基 概念:人們按照微生物對營養(yǎng)物質的不同需求,配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。 分類和應用 培養(yǎng)基配方及營養(yǎng)要素 基本營養(yǎng)要素：各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽。此外還要滿足不同微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的需求。 【友情提醒】微生物最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。 對異養(yǎng)微生物來說，含C、H、O、N的有機化合物既是碳源，又是氮源、能源。 有些培養(yǎng)基不需要添加特殊營養(yǎng)物質，生物自己能合成，如大腸桿菌能合成某些維生素，作為特殊營養(yǎng)物質。 制備：計算稱量溶化滅菌倒平板。 無菌技術主要操作要

2、求 a實驗前應對操作空間、操作人員消毒，對所用器具和培養(yǎng)基滅菌。 b實驗進行時需在酒精燈火焰周圍無菌區(qū)操作，另外要避免已滅菌處理材料再次污染。 (2)無菌技術 2純化大腸桿菌以及菌種的保藏 (1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。 (2)純化大腸桿菌 原理：在培養(yǎng)基上將細菌稀釋或分散成單個細胞，使其長成單個的菌落，這個菌落就是一個純化的細菌菌落。 方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法。 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面；稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)

3、基的表面，進行培養(yǎng)。 (3)菌種的保藏 短期保存：固體斜面培養(yǎng)基上4 保存，菌種易被污染或產生變異。 長期保存：20 甘油管在冷凍箱中保藏。 【友情提醒】平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的溫度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 【例1】分析下面培養(yǎng)基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂。請回答： (1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是_和_。 (2)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？_。 (3)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、

4、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌及消毒方法依次是() 化學消毒灼燒滅菌干熱滅菌紫外線滅菌高壓蒸汽滅菌巴氏消毒法 A B C D 【解析】碳源是提供碳元素的物質，氮源是提供氮元素的物質。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。絕大多數生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養(yǎng)基對微生物有選擇作用。選擇的原則是只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿能耐高溫，可用干熱滅菌；接種環(huán)可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養(yǎng)成分可采用巴氏消毒法。 【答案

5、】 (1)葡萄糖尿素 (2)有選擇作用。因為此配方中尿素是惟一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長 (3)A 二、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數 1分離的原理 (1)土壤中的細菌之所以能夠分解尿素，是因為它們體內能合成脲酶。這種物質在把尿素分解成無機物的過程中起催化作用。 (2)實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。 2分離分解尿素的細菌所使用的特定培養(yǎng)基 分離分解尿素的細菌的培養(yǎng)基應為選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的氮源只有尿素，理論上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生長。其配方如下： KH2PO4 1.4 g

6、Na2HPO4 2.1 g MgSO47H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素(惟一氮源) 1.0 g 瓊脂 15.0 g 將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到1000 mL。 3統(tǒng)計菌落數目的方法 (1)顯微鏡直接計數法 原理：利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量。 方法：用計數板計數。 缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。 (2)間接計數法(活菌計數法) 原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 操作 a設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。 b為了保證

7、結果準確，一般選擇菌落數在30300的平板進行計數。 計算公式：每克樣品中的菌株數 M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數。VC 4細菌分離與計數的實驗流程 土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物培養(yǎng)觀察并記錄結果細菌計數。 【例2】可以鑒定出分解尿素的細菌的方法是() A以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑 B以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑 C以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入蘇丹試劑 D以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入雙縮脲試劑 【解析】在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中，不能分解尿素獲得氮源的細菌不能生長，而分解尿素的細菌能

8、利用尿素作氮源，將尿素分解為氨，使pH升高。若培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑將變紅。此培養(yǎng)基既屬于選擇培養(yǎng)基，又屬于鑒別培養(yǎng)基。 A 三、分解纖維素的微生物的分離 1分解纖維素的微生物的分離 (1)實驗原理即：可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。 (2)實驗流程 土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境。 選擇培養(yǎng)：用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的數量。 梯度稀釋 涂布平板：將樣品涂布于鑒別含CR的纖維素分解菌的培養(yǎng)基(固體)。 挑選產生透明圈的菌落：產生纖維素酶的菌落周圍出現透明圈。 2兩種剛果紅染色法的比較方法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，過程如下：培養(yǎng)基經涂布培養(yǎng)長出菌落覆

9、蓋質量濃度為1 mg/mL的CR溶液 倒去CR溶液加入物質的量濃度為1 mol/L的NaCl溶液 倒掉NaCl溶液出現透明圈方法二：倒平板時就加入剛果紅，過程如下：配制質量濃度為10 mg/mL的CR溶液滅菌按照每200 mL培養(yǎng)基加入1 mL的比例加入CR溶液混勻倒平板接種后培養(yǎng)出現透明圈優(yōu)點顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用操作簡便，不存在菌落的混雜問題方法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，過程如下：培養(yǎng)基經涂布培養(yǎng)長出菌 落 覆 蓋 質 量 濃 度 為 1 mg/mL的CR溶液 倒去CR溶液加入物質的量濃度為1 mol/L的NaCl溶液 倒掉NaCl溶液出現透明圈方

10、法二：倒平板時就加入剛果紅，過程如下：配制質量濃度為10 mg/mL的CR溶液滅菌按照每200 mL培養(yǎng)基加入1 mL的比例加入CR溶液混勻倒平板接種后培養(yǎng)出現透明圈缺點操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜(1)由于纖維素、瓊脂和土豆汁中都含有淀粉類物質，可以使能夠產生淀粉酶的微生物出現假陽性反應；(2)有些微生物具有降解色素的能力，長時間培養(yǎng)會降解剛果紅，從而形成明顯的透明圈，這些微生物與纖維素分解菌不易區(qū)分 【友情提醒】選擇培養(yǎng)的目的是增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。 涉及的微生物技術主要有：培養(yǎng)基的配制、無菌操作技術、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用

11、、土壤取樣等。 【例3】下圖為分離并統(tǒng)計分解纖維素的微生物的實驗流程，據此回答有關問題： (1)要從富含纖維素的環(huán)境中分離纖維素分解菌，從高溫熱泉中尋找耐熱菌，這說明_。 (2)某同學根據需要，配制了纖維素分解菌的培養(yǎng)基如下，整個實驗過程嚴格執(zhí)行無菌操作。 如果將其中的纖維素粉換成_，菌落數_，即可說明選擇培養(yǎng)基的作用。纖維素粉NaNO3Na2HPO4KH2PO45 g1 g1.2 g0.9 gMgSO47H2OKCl酵母膏0.5 g0.5 g適量 【解析】(1)因為纖維素分解菌與耐熱菌有不同的生活習性，生活在不同的環(huán)境中，故要根據目的菌株對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。 (2)因為葡

12、萄糖是纖維素水解產生的、能被微生物直接利用的有機小分子，所以如果將其中的纖維素粉換成葡萄糖，纖維素分解菌及其他細菌會生長繁殖得更快，故菌落數明顯多于選擇培養(yǎng)基。 (3)因為稀釋涂布平板法要將菌液進行一系列的梯度稀釋，故該法可根據稀釋體積計算每克樣品中的細菌數，而平板劃線法則不能這樣，所以本實驗宜采用稀釋涂布平板法。 【答案】(1)不同的菌株生活在不同的環(huán)境中，根據目的菌株對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找 (2)葡萄糖明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數 (3)稀釋涂布平板平板劃線法難以根據稀釋體積計算每克樣品中的細菌數1消毒和滅菌的區(qū)別用酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好，原因是：濃度過高，使

13、菌體表面蛋白質凝固成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。2培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12天后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。3平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，

14、接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。1.(2009安徽)下列是關于“檢測土壤中細菌總數”實驗操作的敘述，其中錯誤的是( ) A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經高溫、高壓滅菌后倒平板 B取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0.1 mL，分別涂布于各組平板上 C將實驗組和對照組平板倒置，37 恒溫培養(yǎng)2448小時 D確定對照組無菌后，選擇菌落數在300以上的實驗組平板進行計數D【解析】本題考查的

15、是選修1專題2“微生物的培養(yǎng)與應用”的有關知識。確定對照組無菌后，選擇菌落數在30300的平板進行計數，求其平均值，再通過計算得出土壤中細菌總數 2.(2011新課標)有些細菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株?；卮饐栴}：(1)在篩選過程中，應將土壤樣品稀釋液接種于以 為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上。從功能上講，該培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。(2)純化菌種時，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即 和 。原油選擇平板劃線法稀釋涂布平板法(3)為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍分解圈的大小，分解圈大說明該菌株的降解能力 。(4)通常情況下

16、，在微生物培養(yǎng)過程中，實驗室常用的滅菌方法有灼燒滅菌、 和 。無菌技術要求實驗操作應在酒精燈 附近進行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。強干熱滅菌高壓蒸汽滅菌火焰【解析】(1)題中想篩選分解原油的菌株，應該以原油為唯一的碳源。培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基，本題是篩選菌株，屬于選擇培養(yǎng)基。(2)接種方法分為平板劃線法和稀釋涂布平板法。(3)菌株的分解能力越強，分解的原油越多，則分解圈越大。(4)微生物實驗要求在無菌環(huán)境中操作，滅菌方法包括灼燒滅菌、干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌。 3.(2011山東)研究發(fā)現柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白質)均有抑菌作用，兩者的提取及應用如圖所示。(1)柚皮易焦糊，宜

17、采用 法提取柚皮精油，該過程得到的糊狀液體可通過 除去其中的固體雜質。(2)篩選乳酸菌A時可選用平板劃線法或 接種。對新配制的培養(yǎng)基滅菌時所用的設備是 。實驗前需對超凈工作臺進行 處理。壓榨過濾稀釋涂布平板法(或稀釋混合平板法)高壓蒸汽滅菌鍋消毒(3)培養(yǎng)基中的尿素可為乳酸菌A生長提供 。電泳法純化乳酸菌素時，若分離帶電荷相同的蛋白質，則其分子量越大，電泳速度 。(4)抑菌實驗時，在長滿致病菌的平板上，會出現以抑菌物質為中心的透明圈?？赏ㄟ^測定透明圈的 來比較柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。氮源越慢直徑(或大小)4.下列是與微生物培養(yǎng)有關的問題，請回答：某細菌固體培養(yǎng)基的組成成分是KH2PO4、

18、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、瓊脂和蒸餾水，其中凝固劑是 ，碳源是 ，氮源是 。已知只有能合成脲酶的細菌才能在該培養(yǎng)基上生長，故該培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。按照化學成分分類，該培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。從同化作用類型上看，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌屬于 。瓊脂葡萄糖尿素選擇合成異養(yǎng)型【解析】本題主要考查學生的理解能力及微生物的營養(yǎng)。該培養(yǎng)基中，瓊脂為凝固劑，葡萄糖為碳源，尿素為氮源；由于只有能合成脲酶的細菌才能在該培養(yǎng)基上生長，可以用來選擇出能夠合成脲酶的細菌，在功能上稱為選擇培養(yǎng)基；由于其化學成分明確，故又稱為合成培養(yǎng)基；由于該培養(yǎng)基中存在著有機碳源即葡萄糖，故從同化作用類型上推測，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)

19、的細菌屬于異養(yǎng)型。5.(2011上海模擬)為了檢測飲用水中是否會有某種細菌，配制如下培養(yǎng)基進行培養(yǎng)：(1)表中培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物同化作用類型是 。(2)若將青霉素加入培養(yǎng)基中，則該培養(yǎng)基從功能上區(qū)分，應屬于培養(yǎng)基，可用于培養(yǎng) 等微生物。自養(yǎng)型微生物選擇酵母菌(真菌、具有抗青霉素基因的細菌)(3)表中營養(yǎng)成分共有 類。(4)不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后滅菌前，要進行的是 。3調整pH值(5)表中各成分質量確定的原則是 。(6)若表中培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應該增加的成分是 。瓊脂(或凝固劑)依微生物的生長需要確定6.(2011銀川一中二模)請分析回答下列問題：(1)無菌技術主要通過消毒和滅菌

20、來避免雜菌的污染。常用的滅菌方法有 滅菌、干熱滅菌和 滅菌。灼燒高壓蒸汽(2)稀釋涂布平板法分離純化土壤中微生物的正確操作步驟是( )土壤取樣稱取10 g土壤加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，制備土壤提取液吸取0.1 mL溶液進行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107的稀釋度CA BC D(3)利用酵母菌將葡萄汁發(fā)酵后是否有酒精產生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應呈現 色。在發(fā)酵過程中，隨著酒精度的提高，發(fā)酵液逐漸呈現深紅色，原因是 ?；揖G紅葡萄皮的色素進入發(fā)酵液(4)從野生酵母菌群中分離純化酵母菌，最常使用的接種方法是 和 兩種。酵

21、母菌適合生活在偏酸性環(huán)境 平板劃線法稀釋涂布平板法而放線菌則適合生活在偏堿性環(huán)境中，分離二者所用的培養(yǎng)基稱為 。(5)在腐乳制作的過程中，起主要作用的微生物是 ，腐乳的制作是多種微生物的 作用，微生物的作用是 。選擇培養(yǎng)基毛霉協(xié)同微生物產生的蛋白酶將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶將脂肪水解成甘油和脂肪酸(6)腐乳制作過程中影響其風味和品質的因素有哪些？( )鹽的用量酒的種類和用量發(fā)酵溫度 發(fā)酵時間辛香料的用量 A B C DA7.(改編)微生物在人們的生活生產中無處不在，為人們的生活增添了諸多樂趣。為獲得一種能高效降解農藥的細菌(目的菌)，往培養(yǎng)基中加入某種化合物，將初步篩選得到的目的菌轉至固體培養(yǎng)基上，常采用的接種方法是 ；獲得菌落后繼續(xù)篩選，接種過程中接種環(huán)常采用 滅菌；實驗結束后，使用過的培養(yǎng)基應該進行 處理后才能倒掉，這樣做是為了 ，常用滅菌方法是 。平板劃線法灼燒滅菌防止造成環(huán)境污染高壓蒸汽滅菌