《高考生物總復(fù)習(xí) 第六章第2節(jié) DNA片段的擴(kuò)增 PCR技術(shù)課件 中圖版選修1》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《高考生物總復(fù)習(xí) 第六章第2節(jié) DNA片段的擴(kuò)增 PCR技術(shù)課件 中圖版選修1（36頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第第2節(jié)節(jié)DNA片段的擴(kuò)增片段的擴(kuò)增PCR技術(shù)技術(shù)學(xué)習(xí)導(dǎo)航學(xué)習(xí)導(dǎo)航1.理解理解PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA片段的原理。片段的原理。重點(diǎn)重點(diǎn)2.嘗試嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。 難點(diǎn)難點(diǎn)新知初探思維啟動(dòng)新知初探思維啟動(dòng)一、一、DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制1.所需的酶：所需的酶：_酶、酶、DNA聚合酶和聚合酶和RNA聚合酶等。聚合酶等。2.引物：引物：_。3.原料：原料：_。4.原則：原則：_。DNA解旋解旋一段一段RNA四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則二、二、PCR及其過(guò)程及其過(guò)程1.概念：概念：PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實(shí)際上是即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2、，實(shí)際上是在在_模擬細(xì)胞內(nèi)的模擬細(xì)胞內(nèi)的_，形，形成大量成大量_的的DNA片段。片段。體外體外DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程特異性特異性2.過(guò)程過(guò)程條件條件過(guò)程過(guò)程加加樣樣室溫室溫把把PCR緩沖液緩沖液、_、一對(duì)引物、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、聚合酶、Mg2等成分加等成分加入到微量離心管中入到微量離心管中DNA模板模板氫鍵氫鍵一對(duì)引物一對(duì)引物DNA聚合聚合脫氧核苷酸脫氧核苷酸判一判判一判(1)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和復(fù)制和PCR技術(shù)所需的引物一技術(shù)所需的引物一樣，都是樣，都是RNA。()(2)經(jīng)經(jīng)PCR技術(shù)合成的技術(shù)合成的DNA分子中，每條單鏈分子中，每條單鏈都含有引物。

3、都含有引物。()(3)PCR實(shí)驗(yàn)的原理和操作都十分復(fù)雜，不易實(shí)驗(yàn)的原理和操作都十分復(fù)雜，不易于操作。于操作。()(4)經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三步經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸三步操作，操作，DNA片段可呈指數(shù)增長(zhǎng)。片段可呈指數(shù)增長(zhǎng)。()三、實(shí)驗(yàn)操作三、實(shí)驗(yàn)操作1.準(zhǔn)備準(zhǔn)備(1)為了避免為了避免_等因素的污染，等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、吸頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行_。(2)如果沒(méi)有如果沒(méi)有PCR儀，可以設(shè)置儀，可以設(shè)置3個(gè)恒溫水浴個(gè)恒溫水浴鍋，溫度分別為鍋，溫度分別為_(kāi)、_和和_，然后按要求

4、在然后按要求在3個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR的的微量離心管即可。微量離心管即可。外源外源DNA高壓滅菌高壓滅菌95 55 72 PCR熱循環(huán)熱循環(huán)260 nm想一想想一想決定決定PCR反應(yīng)特異性的原因有哪些？反應(yīng)特異性的原因有哪些？【提示提示】待擴(kuò)增待擴(kuò)增DNA片段的特異性。片段的特異性。要點(diǎn)突破講練互動(dòng)要點(diǎn)突破講練互動(dòng)要點(diǎn)一要點(diǎn)一PCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較細(xì)胞內(nèi)復(fù)制細(xì)胞內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)反應(yīng)解旋解旋在解旋酶作用在解旋酶作用下下,細(xì)細(xì)胞提供能量，胞提供能量，部分解開(kāi)部分解開(kāi)加熱至加熱至90 以以上時(shí)，雙鏈全上時(shí)，雙鏈全部解開(kāi)部解開(kāi)酶酶DNA解旋酶、解旋酶、

5、DNA聚合酶聚合酶耐高溫的耐高溫的DNA聚合酶聚合酶引物引物一小段一小段RNA單鏈單鏈DNA細(xì)胞內(nèi)復(fù)制細(xì)胞內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)反應(yīng)能量能量ATP不加不加循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)生物自身控制生物自身控制30多次多次子鏈合成子鏈合成一條鏈連續(xù)合一條鏈連續(xù)合成成,另另一條鏈不連續(xù)一條鏈不連續(xù)合成合成兩條子鏈為連續(xù)兩條子鏈為連續(xù)合合成成,溫溫度為度為72 產(chǎn)物產(chǎn)物完整完整DNADNA片段片段相同點(diǎn)相同點(diǎn)需提供需提供DNA復(fù)制的模板復(fù)制的模板四種脫氧核苷酸為原料四種脫氧核苷酸為原料堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端特別提醒特別提醒PCR反應(yīng)需要可變的溫度，而反應(yīng)

6、需要可變的溫度，而體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。DNA解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵兩條鏈的氫鍵斷開(kāi)；斷開(kāi)；DNA聚合酶的作用是將單個(gè)脫氧核苷聚合酶的作用是將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的單鏈片段的酸加到已有的單鏈片段的3端上，需要模板端上，需要模板; DNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，片段的缺口，不需要模板。不需要模板。 PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相復(fù)制過(guò)程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是()PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNAPCR過(guò)程不需要過(guò)程不

7、需要DNA聚合酶聚合酶PCR過(guò)程中過(guò)程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的PCR過(guò)程中，過(guò)程中，DNA不需要解旋，直接以雙不需要解旋，直接以雙鏈鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制為模板進(jìn)行復(fù)制例例1A BC D【解析解析】PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)復(fù)制過(guò)程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：PCR過(guò)程需過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈要的引物是人工合成的單鏈DNA，長(zhǎng)度通常，長(zhǎng)度通常為為1540個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。PCR過(guò)程中，過(guò)程中，DNA解解旋不依賴解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控旋不依賴解旋酶，

8、而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。制來(lái)實(shí)現(xiàn)的?！敬鸢复鸢浮緾變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練(2012成都七中高二檢測(cè)成都七中高二檢測(cè))下列關(guān)于下列關(guān)于DNA復(fù)制復(fù)制和和PCR的描述中，正確的是的描述中，正確的是()ADNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只，只能從能從5端延伸端延伸DNA鏈鏈BDNA復(fù)制不需要引物復(fù)制不需要引物C引物與引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合結(jié)合DPCR擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列解析：選解析：選C。由于。由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始聚合酶不能從頭開(kāi)始合成合成DNA，只能從，只能從3端延伸端延伸DNA鏈，故鏈，故DN

9、A復(fù)制需要引物，而且它與復(fù)制需要引物，而且它與DNA母鏈通過(guò)堿基母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合?；パa(bǔ)配對(duì)結(jié)合。PCR擴(kuò)增的對(duì)象是擴(kuò)增的對(duì)象是DNA，而，而不是氨基酸。不是氨基酸。2.PCR擴(kuò)增過(guò)程擴(kuò)增過(guò)程變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸預(yù)變性預(yù)變性95 ，5 min55 ，1 min72 ，1 min重復(fù)重復(fù)30次次95 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次循環(huán)次循環(huán)72 ，1 min圖示：圖示：3.DNA擴(kuò)增數(shù)目的理論計(jì)算擴(kuò)增數(shù)目的理論計(jì)算理論上理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)。若只有一條擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)。若只有一條DNA模板，則復(fù)制模板，則復(fù)制n次后有次后有2n條；若一開(kāi)始條；若一開(kāi)始有有

10、m條條DNA模板，則復(fù)制模板，則復(fù)制n次后有次后有m2n條；條；實(shí)際操作過(guò)程中，由于無(wú)關(guān)變量的影響，一實(shí)際操作過(guò)程中，由于無(wú)關(guān)變量的影響，一般來(lái)說(shuō)實(shí)驗(yàn)值要略小于理論值。般來(lái)說(shuō)實(shí)驗(yàn)值要略小于理論值。 近近20年來(lái)，年來(lái)，PCR技術(shù)技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)蕉嗑勖告準(zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng))成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制的人工復(fù)制(如圖如圖)，在短時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)內(nèi),將將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，從而擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，從而使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的使實(shí)驗(yàn)

11、室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。生物體。例例2(1)加熱使加熱使DNA雙鏈間的雙鏈間的_鍵完全鍵完全打開(kāi)，稱為打開(kāi)，稱為_(kāi)；而在細(xì)胞中是在；而在細(xì)胞中是在_酶的作用下進(jìn)行的。酶的作用下進(jìn)行的。(2)如果只需要大量克隆模板如果只需要大量克隆模板DNA中間的某中間的某個(gè)特定區(qū)段，應(yīng)該加入個(gè)特定區(qū)段，應(yīng)該加入_種特定的種特定的引物。當(dāng)溫度降低至引物。當(dāng)溫度降低至55 C時(shí)，引物與兩條時(shí)，引物與兩條“舒展舒展”的模板的特定位置結(jié)合，在的模板的特定位置結(jié)合，在DNA聚聚合酶的作用下，只能在引物的合酶的作用下，只能在引物的_端連端連接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方向都是接脫氧核苷酸，兩條子鏈的延伸方

12、向都是_。(3)PCR技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、酶之外，至少還有三個(gè)條件，即液體環(huán)境、適宜的適宜的_和和_，前者由，前者由_自動(dòng)調(diào)控，后者則靠自動(dòng)調(diào)控，后者則靠_來(lái)維持。來(lái)維持。(4)通過(guò)通過(guò)PCR技術(shù)使技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，如果分子大量復(fù)制，如果將一個(gè)用將一個(gè)用15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制四次之后，則之后，則15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子占全部分子占全部DNA分分子總數(shù)的比例是子總數(shù)的比例是_?！窘馕鼋馕觥?1

13、)PCR技術(shù)利用熱變性原理使技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在雙鏈之間的氫鍵斷裂，稱為變性，而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。(2)PCR分為三個(gè)基本反應(yīng)步驟分為三個(gè)基本反應(yīng)步驟:變性變性(95 )、復(fù)性復(fù)性(55 )、延伸、延伸(72 )，其特異性依賴于，其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物，引物是兩段與待擴(kuò)增與靶序列互補(bǔ)的引物，引物是兩段與待擴(kuò)增DNA序列互補(bǔ)的片段，兩引物之間的距離決序列互補(bǔ)的片段，兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。由于由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只，只能

14、從引物的能從引物的3端延伸端延伸DNA鏈，則鏈，則DNA的合成的合成方向總是從子鏈的方向總是從子鏈的5端向端向3端延伸。端延伸。(3)PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同，除了復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體需要模板、原料、酶以外，至少還需要液體環(huán)境環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖液穩(wěn)定的緩沖液)，每一個(gè)步驟需要適宜，每一個(gè)步驟需要適宜的溫度和酸堿度等。的溫度和酸堿度等。(4)一個(gè)一個(gè)DNA分子連續(xù)復(fù)分子連續(xù)復(fù)制四次之后，形成制四次之后，形成16個(gè)個(gè)DNA分子，分子，15N標(biāo)記標(biāo)記的的DNA分子有分子有2個(gè)，則個(gè)，則15N標(biāo)記的標(biāo)記的DNA分子占分子占全部全部DNA

15、分子總數(shù)的比例為分子總數(shù)的比例為1/8?！敬鸢复鸢浮?1)氫氫變性變性解旋解旋(2)兩兩3從子鏈的從子鏈的5端向端向3端延伸端延伸(3)溫度溫度酸堿度酸堿度PCR儀儀緩沖液緩沖液(4)1/8互動(dòng)探究互動(dòng)探究(1)PCR中由堿基錯(cuò)配而引起哪種變異？中由堿基錯(cuò)配而引起哪種變異？(2)假設(shè)對(duì)一個(gè)假設(shè)對(duì)一個(gè)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，第一次循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，第一次循環(huán)時(shí)某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯(cuò)配，則擴(kuò)增若時(shí)某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯(cuò)配，則擴(kuò)增若干次后檢測(cè)所用干次后檢測(cè)所用DNA的擴(kuò)增片段，與原的擴(kuò)增片段，與原DNA相應(yīng)片段相同的占多少？相應(yīng)片段相同的占多少？【提示提示】(1)基因突變?；蛲蛔儭?2)50%。【誤區(qū)警示

16、誤區(qū)警示】關(guān)于關(guān)于DNA的擴(kuò)增方向容易發(fā)的擴(kuò)增方向容易發(fā)生混淆，為了明確表示生混淆，為了明確表示DNA的方向，通常將的方向，通常將DNA的羥基的羥基(OH)末端稱為末端稱為3端，磷酸基團(tuán)端，磷酸基團(tuán)的末端稱為的末端稱為5端，子鏈從引物端，子鏈從引物3端開(kāi)始延伸，端開(kāi)始延伸，而子鏈的合成方向是從而子鏈的合成方向是從5端向端向3端延伸。端延伸。要點(diǎn)三要點(diǎn)三實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析1.檢測(cè)檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果的過(guò)程擴(kuò)增效果的過(guò)程2.結(jié)果分析結(jié)果分析DNA片段的擴(kuò)增是否成功的判斷片段的擴(kuò)增是否成功的判斷(1)對(duì)于電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線對(duì)于電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察下

17、直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。擴(kuò)增的效果。(2)擴(kuò)增不成功的可能原因有：擴(kuò)增不成功的可能原因有：漏加了漏加了PCR的反應(yīng)成分；的反應(yīng)成分；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取３绦蛟O(shè)置不當(dāng)?shù)取?在在PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)一的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)一分子分子DNA經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)30次循環(huán)后，應(yīng)該得到次循環(huán)后，應(yīng)該得到230個(gè)個(gè)DNA分子，但是結(jié)果只有約分子，但是結(jié)果只有約210個(gè)個(gè)DNA分子，分子，那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是那么不是出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是()ATaq DNA聚合酶的活力不夠，或活性受聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制到

18、抑制B系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥C循環(huán)次數(shù)不夠循環(huán)次數(shù)不夠D復(fù)性時(shí)，部分親鏈與親鏈結(jié)合復(fù)性時(shí)，部分親鏈與親鏈結(jié)合例例3【解析解析】如果如果Taq DNA聚合酶活力不夠，聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少。如果到的產(chǎn)物比預(yù)期的少。如果PCR系統(tǒng)設(shè)置不系統(tǒng)設(shè)置不妥，達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。復(fù)性時(shí)，模板鏈既妥，達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。復(fù)性時(shí)，模板鏈既可以和引物結(jié)合，互補(bǔ)的模板鏈也可相互結(jié)可以和引物結(jié)合，互補(bǔ)的模板鏈也可相互結(jié)合，從而導(dǎo)致產(chǎn)物減少。合，從而導(dǎo)致產(chǎn)物減少。【答案答案】C變式訓(xùn)練變式訓(xùn)練DNA在在_nm的紫外線波段存在一強(qiáng)烈的的紫外線波段存在一強(qiáng)烈的吸收峰，其峰值的大小與吸收峰，其峰值的大小與DNA含量有關(guān)含量有關(guān)()A220 B240C260 D280解析：選解析：選C。DNA在在260 nm的紫外線波段存的紫外線波段存在一強(qiáng)烈的吸收峰，其峰值的大小與在一強(qiáng)烈的吸收峰，其峰值的大小與DNA含含量有關(guān)。據(jù)此，可以進(jìn)行量有關(guān)。據(jù)此，可以進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。含量的測(cè)定。