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1、 第3講　基因工程 [考綱展示]　1.基因工程的誕生(Ⅰ)　2.基因工程的原理及技術(shù)(含PCR技術(shù))(Ⅱ)　3.基因工程的應用(Ⅱ)　4.蛋白質(zhì)工程(Ⅰ) 考點一| 基因工程的基本工具 1．基因工程的概念 (1)概念：按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。 (2)優(yōu)點 ①與雜交育種相比：克服了遠緣雜交不親和的障礙。 ②與誘變育種相比：定向改造生物的遺傳性狀。 2．基因工程的基本工具 (1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。 ①來源：主要來自原核生物。 ②特點：具

2、有專一性，表現(xiàn)在兩個方面： 識別——雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列。 切割——特定核苷酸序列中的特定位點。 ③作用：斷裂特定的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 ④結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端。 (2)DNA連接酶 種類 E·coli DNA連接酶 T4DNA連接酶 來源 大腸桿菌 T4噬菌體 特點 縫合黏性末端 縫合黏性末端和平末端 作用 縫合雙鏈DNA片段，恢復兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 (3)載體 ①種類：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。 ②質(zhì)粒的特點 ③運載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。 1．(1)原核生物中限制酶為什么不切割

3、自身的DNA? 提示：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾等。 (2)圖甲表示EcoR Ⅰ限制酶及DNA連接酶的作用示意圖，圖乙表示Sma Ⅰ限制酶的作用示意圖。請據(jù)圖回答問題： ①請寫出EcoR Ⅰ限制酶和SmaⅠ限制酶識別的堿基序列以及切割位點。 提示：EcoR Ⅰ限制酶識別的堿基序列是GAATTC，切割位點在G和A之間；Sma Ⅰ限制酶識別的堿基序列是CCCGGG，切割位點在G和C之間。 ②限制酶和DNA連接酶的作用部位相同嗎？DNA連接酶起作用時，是否需要模板？ 提示：相同，都是磷酸二酯鍵。不需要模板。 1．基因工程技術(shù)使用限制酶需注意的四個問題 (

4、1)獲取目的基因和切割載體時，經(jīng)常使用同一種限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。 (2)獲取一個目的基因需限制酶切割兩次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端。 (3)限制酶切割位點的選擇，必須保證標記基因的完整性，以便于檢測。 (4)為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒。 2．載體上標記基因的作用 載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培

5、養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，原理如圖所示： 考法1　考查限制酶、DNA連接酶等酶的作用 1．(2016·全國卷Ⅲ)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 圖(a) 圖(b) 根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題： (1)經(jīng)BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_____________________________ __

6、__________________________________________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達的原因是___________________ _____________________________________________________________ ____________________________________________________________。

7、 圖(c) (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有______________和______________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________。 解析：(1)由題圖可知，BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 兩種限制性內(nèi)切酶的共同識別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經(jīng)BamH Ⅰ酶切得到的目的基因可以與圖(b)所示表達載體被Sau3A Ⅰ酶切后的產(chǎn)物連接。(2)在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣基因才能順利地轉(zhuǎn)錄，再完成翻譯過程，即順利表達。圖中甲所示的目的基因插入在啟動子的上游，丙所示目的基因插入

8、在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄，因此目的基因不能表達。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 答案：(1)Sau3A Ⅰ　兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄 (3)E·coliDNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶 考法2　考查載體的作用及特點等 2．(2016·全國卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青

9、霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有________ ________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的

10、和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是______________________；并且________________和_______________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是_______________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于________。 解析：(1)質(zhì)粒作為載體，應具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我

11、復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經(jīng)改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自于受體細胞。 答案：(1)能自我復制

12、、具有標記基因、具有一至多個限制酶切割位點(答出兩點即可) (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質(zhì)粒載體　含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細胞 考點二| 基因工程的基本操作及其應用 1．基因工程的基本程序 (1)目的基因的獲取 ①從基因文庫中獲取 ②人工合成 ③利用PCR技術(shù)擴增 (2)基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心 ①目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 ②基因表達載體的組成 (3

13、)將目的基因?qū)胧荏w細胞 ①轉(zhuǎn)化含義：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)遺傳和表達的過程。 ②轉(zhuǎn)化方法 生物類型 植物 動物 微生物 受體細胞 體細胞 受精卵 大腸桿菌或酵母菌等 常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細胞法 (4)目的基因的檢測與鑒定 方法 檢測或鑒定目的 水平 DNA分子雜交技術(shù) 檢測目的基因的有無 分子水平 分子雜交技術(shù) 目的基因是否轉(zhuǎn)錄 抗原—抗體雜交 目的基因是否翻譯 抗蟲或抗病接種實驗 是否具有抗蟲抗病特性 個體水平 2．PCR技術(shù) (1)原理：DNA雙鏈復制。 (2

14、)條件 (3)過程 (4)結(jié)果：上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。 3．基因工程的應用 (1)植物基因工程 培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物、抗病轉(zhuǎn)基因植物、抗逆轉(zhuǎn)基因植物、利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。 (2)動物基因工程 ①提高動物生長速度、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物、用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體。 ②乳腺生物反應器：藥用蛋白基因和乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起。 (3)基因工程藥品 ①受體細胞：多為原核細胞。原因是其繁殖快，多為單細胞，遺傳

15、物質(zhì)相對較少。 ②成果：生產(chǎn)出細胞因子、抗體、疫苗、激素等。 (4)基因治療 ①方法：基因置換、基因修復、基因增補、基因失活等。 ②類型：體內(nèi)基因治療和體外基因治療。 1．將目的基因?qū)胧荏w細胞整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，能否穩(wěn)定遺傳？說明理由。 提示：一般不能。因為僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，細胞分裂可能導致目的基因丟失，因此無法穩(wěn)定遺傳。 2．用箭頭及必要的文字簡述基因組文庫和部分基因文庫構(gòu)建過程。 提示：①基因組文庫的構(gòu)建過程為：某種生物全部DNA許多DNA片段受體菌群體。 ②部分基因文庫的構(gòu)建過程為：某種生物發(fā)育的某個時期的mRNAcD

16、NA受體菌群 基因工程操作的四個易錯點 (1)目的基因的插入位點不是隨意的，基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應插入啟動子與終止子之間的部位。 (2)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細胞)沒有堿基互補配對現(xiàn)象。 (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染植物細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到受體細胞染色體DNA上。 (4)啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子 啟動子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉(zhuǎn)錄過程的啟動和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。 考法1　基因工程的基本操作程序分析 1．(2

17、018·全國卷Ⅰ)回答下列問題： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外，還證明了_____________________________________________ ______________________________________________________________ ________________________________________________(答出兩點即可)。 (2)體外重組的質(zhì)粒可通過Ca2＋參與的________方法導入

18、大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是________。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應選用____________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應添加________的抑制劑。 解析：(1)兩位科學家將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌細胞中并進行了表達，因此，該研究可以證明：質(zhì)?？梢宰鳛檩d體，真核細胞的基因在原核細胞中也可以表達

19、(不同生物共用一套密碼子)、體外重組的質(zhì)?？梢赃M入受體細胞等。(2)目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒導入大腸桿菌時，常用的轉(zhuǎn)化方法是：首先用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，使其成為感受態(tài)。噬菌體DNA沒有侵染能力，體外重組的噬菌體DNA通常需與外 殼蛋白組裝成完整噬菌體才能完成侵染過程。噬菌體多寄生在細菌中，但不能寄生在心肌細胞和葉肉細胞中。(3)若要使蛋白質(zhì)不被降解，則大腸桿菌體內(nèi)不能存在蛋白酶，因此，實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞。同理，在蛋白質(zhì)純化過程中，也不能使蛋白質(zhì)降解，因此，應添加蛋白酶抑制劑。 答案：(1)體外重組的質(zhì)?？?/p>

20、以進入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達 (2)轉(zhuǎn)化　外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)　細菌 (3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶 考法2　基因工程技術(shù)的應用 2．(2017·全國卷Ⅱ)幾丁質(zhì)是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}： (1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是__________________。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是_____________________________________

21、________________。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_________________ ______________________________________________________________ _____________________________________________________________。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細胞，原因是_____________________________ ________________________________

22、______________(答出兩點即可)。 (4)當幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是________________________________________________________。 (5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是______________________________________________________________ __________________________________________________________

23、__。 解析：(1)與老葉相比，嫩葉組織細胞易破碎，容易提取到幾丁質(zhì)酶的mRNA。提取RNA時，提取液中添加RNA酶抑制劑可防止RNA被RNA酶催化降解。 (2)以mRNA為模板，按照堿基互補配對原則，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，通過逆轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄)可以獲得cDNA。 (3)因該目的基因是通過逆轉(zhuǎn)錄形成的，無表達所需的啟動子，也無在受體細胞內(nèi)進行復制所需的復制原點等，所以在受體細胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在和表達，也不能遺傳下去。 (4)構(gòu)建基因表達載體時，DNA連接酶能催化目的基因和質(zhì)粒載體這兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 (5)轉(zhuǎn)基因植株的基因組中含有幾丁質(zhì)酶基因，但該植株抗真菌的能力并沒有提高

24、，可能是由于轉(zhuǎn)錄或翻譯異常，即幾丁質(zhì)酶基因未能正常表達。 答案：(1)嫩葉組織細胞易破碎　防止RNA降解　(2)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA　(3)目的基因無復制原點；目的基因無表達所需啟動子　(4)磷酸二酯鍵　(5)目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常 3．(2019·福建高三質(zhì)檢)苜蓿是目前我國種植最廣的豆科牧草，但是病菌往往威脅著苜蓿的生長。為提高產(chǎn)量，研究人員將溶菌酶基因(LYZ基因)和綠色熒光蛋白基因(GFP基因)連接為LYZ-GFP基因，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導入苜蓿細胞中，并通過組織培養(yǎng)成功獲得了抗病植株。 圖1表示Ti質(zhì)粒，其中Vir區(qū)的基

25、因產(chǎn)物是T-DNA轉(zhuǎn)移的必備條件；圖2表示含有LYZ-GFP基因的DNA片段。圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點?；卮鹣铝袉栴}： (1)構(gòu)建含有LYZ-GFP基因的重組質(zhì)粒時，應選用限制酶________進行切割，原因是______________________________________________ ____________________________________________________________。 (2)據(jù)圖分析，在培育轉(zhuǎn)基因苜蓿植株過程中，應選擇LYZ-GFP基因中的GFP基因為標記基因，而不選擇質(zhì)粒中原有的卡那霉素抗性基因為標記基因，這種做法的優(yōu)

26、點是________________________。 (3)在組織培養(yǎng)過程中，對愈傷組織進行顯微檢測，若________，則表明細胞中GFP基因存在并表達。 (4)選擇含有GFP基因的愈傷組織為材料，用PCR技術(shù)擴增并檢測LYZ基因，需選用一段____________________合成引物，該過程所用到的酶必須具有________的特性。 (5)對該苜蓿植株進行病菌接種實驗，通過觀察其抗病程度可以進行個體生物學水平的鑒定，原因是__________________________________ ___________________________________________

27、__________________。 解析：(1)據(jù)圖2可知，構(gòu)建含有LYZ-GFP基因的重組質(zhì)粒時，含有LYZ-GFP基因的片段有三個酶切位點，基因兩側(cè)沒有相同限制酶，應該使用雙酶切法，限制酶Ⅲ為必選。根據(jù)圖1結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理，所用限制酶切割位點必須在T-DNA片段上，限制酶Ⅰ會切斷Ti質(zhì)粒本身的四環(huán)素抗性基因，但GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作為標記基因。所以應選擇限制酶Ⅰ和Ⅲ。限制酶Ⅱ會破壞質(zhì)粒中的Vir區(qū)的基因，不可選用。 (2)據(jù)圖1可知，若LYZ-GFP基因在T-DNA片段上，就能整合到苜蓿細胞染色體的DNA上，便于追蹤檢測LYZ基因的表達情況，這是選用GFP基因為

28、標記基因的優(yōu)點。而卡那霉素抗性基因不在T-DNA片段上，不能整合到苜蓿細胞染色體的DNA上，所以相對不宜選用。 (3)GFP基因的表達產(chǎn)物是綠色熒光蛋白，對愈傷組織進行顯微檢測時，若觀察到綠色熒光，則表明細胞中的GFP基因存在并表達。 (4)進行PCR技術(shù)擴增并檢測LYZ基因的前提，要有一段已知的LYZ基因的核苷酸序列以便合成引物。PCR擴增過程使用的DNA聚合酶具有耐高溫或熱穩(wěn)定的特性。 (5)LYZ基因能夠表達出溶菌酶，根據(jù)免疫學知識得知：溶菌酶是免疫活性物質(zhì)，能夠殺滅病菌。因此轉(zhuǎn)基因成功的苜蓿植株會表現(xiàn)出抗病特性。 答案：(1)Ⅰ和Ⅲ(對Ti質(zhì)粒和含有LYZ-GFP基因的片段)　

29、選擇限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ能獲取LYZ-GFP基因，不會破壞質(zhì)粒中的Vir區(qū)的基因，使目的基因的插入位點位于T-DNA片段上　(2)LYZ-GFP基因在T-DNA片段上，能整合到苜蓿細胞染色體的DNA上，便于追蹤檢測LYZ基因的表達情況　(3)觀察到綠色熒光　(4)LYZ基因的核苷酸序列　耐高溫(或“熱穩(wěn)定”) 　(5)LYZ基因能夠表達出溶菌酶，溶菌酶能夠殺滅病菌，表現(xiàn)出抗病特性 考點三| 蛋白質(zhì)工程及應用 1．蛋白質(zhì)工程 (1)概念 以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。

30、(2)流程圖 寫出流程圖中字母代表的含義： A．轉(zhuǎn)錄，B.翻譯，C.分子設計，D.多肽鏈，E.預期功能。 2．蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較 (1)區(qū)別 項目 蛋白質(zhì)工程 基因工程 過程 預期蛋白質(zhì)功能→設計預期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列 獲取目的基因→基因表達載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測與鑒定 實質(zhì) 定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質(zhì) 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型和生物產(chǎn)品 結(jié)果 可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì) 只能生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì) (2)聯(lián)系 ①蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎上，延伸

31、出來的第二代基因工程。 ②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質(zhì)工程進行修飾、改造。 1．對天然蛋白質(zhì)進行改造，應該通過對基因的操作來實現(xiàn)，為什么不能直接對蛋白質(zhì)分子進行操作？ 提示：如果對蛋白質(zhì)直接進行改造，即使改造成功了，被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳。 2．絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，簡要表述酶工程與蛋白質(zhì)工程有何區(qū)別和聯(lián)系？ 提示：酶工程的重點在于對已存在的酶的合成充分利用，而蛋白質(zhì)工程則是對已存在的蛋白質(zhì)進行修飾改造或制造出自然界不存在的蛋白質(zhì)。酶工程是蛋白質(zhì)工程的一部分。 考法　考查蛋白質(zhì)工程的原理及應用 (2015·全國卷Ⅱ)已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)(P)，該

32、蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對蛋白質(zhì)的________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：_____________________________________________

33、_____________ ____________________________________________________________。 (3)蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過__________________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對蛋白質(zhì)的生物________進行鑒定。 解析：(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質(zhì)的功能發(fā)生了改變，此過程是通過對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸

34、的排列順序進行改造，進而改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變了蛋白質(zhì)的功能。 (2)在蛋白質(zhì)工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內(nèi)原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。 中心法則的內(nèi)容如圖所示： 由圖可知，中心法則的全部內(nèi)容包括：DNA以自身為模板進行的復制，DNA通過轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給RNA，最后RNA通過翻譯將遺傳信息表達成蛋白質(zhì)；在某些病毒中RNA可自我復制(如煙草花葉病毒等)，在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA(如HIV)，這是對中心法則的補充。 (3)蛋白質(zhì)工程的基本途徑是預期蛋白質(zhì)功能→設計預期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應有的氨基酸序列→合成

35、DNA→表達出蛋白質(zhì)，經(jīng)過該過程得到的蛋白質(zhì)，需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。 答案：(1)氨基酸序列(或結(jié)構(gòu)) (2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質(zhì))　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(zhì)(或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯) (3)設計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)　推測氨基酸序列　功能 真題體驗| 感悟高考　淬煉考能 1．(2017·北京高考)為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導入菊花中。 下列操作與實驗目的不符的是(　　) A．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B．用含C基因的農(nóng)桿

36、菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰毎? C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞 D．用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上 C　[A對：C基因兩端有EcoR Ⅰ酶切位點，可用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和(DNA)連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒。 B對：一般用農(nóng)桿菌等作為媒介去侵染植物的愈傷組織等，將含有目的基因的質(zhì)粒導入細胞。 C錯：據(jù)圖可知，質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故無法用卡那霉素來篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞。 D對：檢測C基因是否整合到菊花染色體上，常采用DNA分子雜交技術(shù)，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作為標記，以此作為探針，使探針與C基

37、因雜交，若顯示出雜交帶，則表明目的基因已插入染色體DNA中。] 2．(2015·重慶高考)下列有關(guān)人胰島素基因表達載體的敘述，正確的是(　　) A．表達載體中的胰島素基因可通過人肝細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得 B．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原(起)點 C．借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細胞篩選出來 D．啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用 答案：C 3．(多選)(2014·江蘇高考)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯誤的是(　　) A．切割質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶均特異性地識別6個核苷酸序列 B．PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同

38、的反應 C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因 D．抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達 答案：ABC 4．(2018·全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1-GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題： (1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶

39、是________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證________，也是為了保證________________。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的________移入牛的______________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定，在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作

40、為PCR模板。 解析：(1)據(jù)圖示信息分析：將L1-GFP融合基因(甲)插入質(zhì)粒時使用酶E1和E4進行酶切，既能保證L1-GFP融合基因的完整，又能保證L1-GFP融合基因與載體的正確連接。(2)目的基因在受體細胞中的表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個過程。(3)將體外培養(yǎng)的含有目的基因的動物體細胞核移入該動物的去核卵母細胞中，經(jīng)過體外胚胎培養(yǎng)、胚胎移植等技術(shù)可獲得轉(zhuǎn)基因動物。(4)檢測目的基因是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，采用PCR技術(shù)鑒定時，應以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。 答案：(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接　(2)轉(zhuǎn)錄　翻譯　(3)細胞核　去核卵母細胞　(4)

41、核DNA 5．(2017·全國卷Ⅰ)真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}： (1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未得到蛋白A，其原因是__________________________________ ______________________________________________________________ _____________________________________

42、________________________。 (2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用________作為載體，其原因是____________________________ ______________________________________________________________ ____________________________________________________________。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶相比，大腸桿菌具有__________________(答出兩點

43、即可)等優(yōu)點。 (4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質(zhì)是_______ _________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是______________________ ____________________________________________________________。 解析：(1)人是真核生物，從人的基因組文庫中獲得的基因A有內(nèi)含子，而受體細胞大腸桿菌是原核生物，原核生物基因中

44、沒有內(nèi)含子，相應的就沒有切除內(nèi)含子對應的RNA序列的機制，故無法表達出蛋白A。 (2)噬菌體是專一性侵染細菌的病毒，以細菌為宿主細胞，而昆蟲病毒侵染的是昆蟲，以昆蟲為宿主細胞。家蠶屬于昆蟲，故應選用昆蟲病毒作為載體。 (3)與家蠶相比，大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，故要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。 (4)檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用抗原—抗體雜交法。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，S型細菌的DNA可以使R型細菌發(fā)生轉(zhuǎn)化，說明可調(diào)控多糖莢膜產(chǎn)生的基因整合到了R型細菌的DNA分子中并成功得以表達。也就是說DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體并進行表達，這就為基因工程理論的建立提供了啟示。 答案：(1)基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A (2)噬菌體　噬菌體的宿主是細菌，而不是家蠶　(3)繁殖快、容易培養(yǎng)　(4)蛋白A的抗體　(5)DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體 - 16 -