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1、 選考部分 現(xiàn)代生物科技專題 第一講基因工程 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (一)基因工程的基本工具 1.已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別為G↓AATTC和CCC↓GGG，判斷下圖中兩種限制酶切割DNA后產生的末端及其種類 ①產生的是黏性末端；②產生的是平末端。 2.判斷下圖所示過程①②需要的工具酶 ①是限制酶；②是DNA連接酶。 3.連線載體須具備的條件及其作用 1.圖解基因工程的三種操作工具 2.明辨與DNA有關的酶 比較 項目 限制酶 DNA 連接酶 DNA 聚

2、合酶 解旋酶 DNA (水解)酶 作用 底物 DNA 分子 DNA分 子片段 脫氧 核苷酸 DNA 分子 DNA 分子 作用 部位 磷酸 二酯鍵 磷酸 二酯鍵 磷酸 二酯鍵 堿基對 間的氫鍵 磷酸 二酯鍵 形成 產物 黏性末端 或平末端 形成重組 DNA分子 新的 DNA分子 形成單 鏈DNA 游離的脫 氧核苷酸 (二)基因工程的基本操作程序 4.目的基因的獲取 (1)目的基因：主要指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具調控作用的因子。 (2) 5.基因表達載體的組成及作用 3.識記基因工程操作的“四

3、步曲” 　　　　　　　　　　　 　　　 (二)基因工程的基本操作程序 6.連線不同種類的受體細胞與目的基因導入的常用方法 7.結合抗蟲棉的培育過程填空 (1)從圖中可以看出，目的基因是Bt毒蛋白基因，使用的載體是Ti質粒，將目的基因表達載體導入受體細胞的方法是農桿菌轉化法。 (2)請寫出兩種檢測目的基因是否表達的方法：抗原－抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲。 4.謹記基因工程的理論基礎 (1)構建基因表達載體的基礎： ①DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。 ②DNA分子都遵循堿基互補配對原則。 ③DNA分子的空間結構都是規(guī)則的雙螺旋結構。 (2)外源基

4、因在受體細胞內表達的基礎： ①基因是控制生物性狀的遺傳單位。 ②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。 ③生物界共用一套遺傳密碼。 5.明確啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子 啟動子和終止子位于DNA片段上，分別控制轉錄過程的啟動和終止；起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。 6.掌握目的基因檢測與鑒定的方法示意圖 (三) 基因工程的應用和蛋白質工程 8.填寫蛋白質工程流程圖中字母代表的含義 A.轉錄，B.翻譯，C.分子設計，D.氨基酸序列，E.預期功能。 9.判斷有關敘述的正誤 (1)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產品，如

5、人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物的乳腺細胞中(×) (2)由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用(×) (3)蛋白質工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質(√) (4)蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構(×) 7.圖解蛋白質工程的三個方面 8.有關基因工程應用的三點提醒 (1)用基因工程生產的藥品，從化學成分上分析都應該是蛋白質類。 (2)動物基因工程的實施主要是為了改善畜產品的品質，不是為了產生體型巨大的個體。 (3)并非所有個體都可作為乳腺生物反應器，制備乳腺生物反應器通常是針對雌性個體進行的操作。

6、基因工程的操作工具 命題點1　限制性核酸內切酶和DNA連接酶的作用 1．(2017·鎮(zhèn)江一模，多選)下列有關基因工程相關工具的敘述，正確的是(　　) A．限制酶能識別并切割DNA任意序列 B．DNA連接酶與Taq酶作用位點不同 C．沒有與目的基因重組的質粒也可以進入受體細胞 D．使用質粒運載體可以避免目的基因在受體內被分解 解析：選CD　 限制酶具有專一性，一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，而不能任意切割DNA分子，A錯誤；DNA連接酶與Taq酶作用位點相同，都是磷酸二酯鍵，B錯誤；沒有與目的基因重組的普通質粒也可以進入受體細胞，所以需要檢測，C正確；若直接將目的基因

7、片段導入受體細胞，則很容易被分解失效，使用質粒運載體是為了將目的基因導入受體細胞，避免目的基因被分解，D正確。 2．(2016·全國卷Ⅲ)圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。 ↓　　　　　　　　↓　　　　　　　↓ ——GAATTC——　——GGATCC——　——GATC—— ——CTTAAG——　——CCTAGG——　——CTAG—— 　　　　↑　　　　　　　↑　　　　　　　↑ 圖(a) 根據基因工程的有關知識，回答下列問

8、題： (1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產物連接，理由是___________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，不能表達的原因是____________________

9、__________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是______________。 解析：(1)由題圖可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制性內切酶的共同識別序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此經BamHⅠ酶切得到的目的基因可以與圖(b

10、)所示表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產物連接。(2)在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能順利地轉錄，再完成翻譯過程，即順利表達。圖中甲所示的目的基因插入在啟動子的上游，丙所示目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄，因此目的基因不能表達。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。 答案：(1)Sau3AⅠ　兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被

11、轉錄　(3)E·coli DNA連接酶　T4DNA連接酶　T4DNA連接酶 拓展·歸納 DNA連接酶連接兩個DNA片段，催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶是把游離的脫氧核苷酸連接到引物或者已有的DNA單鏈上，催化形成磷酸二酯鍵。 命題點2　載體的作用及特點 3．某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被

12、轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}： (1)質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有______________________________(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是_____________________________；并且__________________________和_____________

13、_______的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是__________________________________________________________。 在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有______________的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于________________。 解析：(1)質粒作為載體，應具備的基本條件有：有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受體細胞中能自我復制，或能整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制；

14、有特殊的標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇等。(2)在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素進行篩選，其中未被轉化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌，因不含氨芐青霉素抗性基因而都不能在此培養(yǎng)基上存活，二者不能區(qū)分。含有質粒載體的大腸桿菌和含有插入了目的基因的質粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，都能在此培養(yǎng)基上存活，二者也不能區(qū)分。若要將含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌進一步篩選出來，還需要使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。(3)某些噬菌體經改造后作為載體，導入受體細胞后，其DNA復制所需的原料來自于受體細胞。 答案：(1)能自我復制、具有標記基因(答出兩點即可) (2)二者均不含有氨芐青霉素抗性

15、基因，在該培養(yǎng)基上均不生長　含有質粒載體　含有插入了目的基因的重組質粒(或答含有重組質粒)　二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長　四環(huán)素　(3)受體細胞 歸納·拓展標記基因的標記原理 載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力，當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如下圖所示： 基因工程的基本操作程序 命題點1　目的基因獲取的方法 1．(2017·蘇州一模，多選)下圖表示通過

16、cDNA過程獲得目的基因并利用PCR擴增過程的示意圖。據圖分析，下列有關敘述錯誤的是(　　) A．催化①過程的酶是RNA聚合酶 B．③過程不需要DNA解旋酶 C．④過程需要兩個相同的引物 D．催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶，均需耐高溫 解析：選ACD　催化①過程的酶是逆轉錄酶；③過程中DNA在高溫下解旋，不需要解旋酶；④過程需要兩種引物；催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶，但⑤過程中DNA聚合酶需要耐高溫。 拓展·歸納PCR技術的原理和反應過程 (1)PCR原理：DNA復制原理，即： (2)PCR反應過程： 過程 說明 圖解 變性 當溫度上升到90 ℃以上時

17、，雙鏈DNA解聚為單鏈 復性 溫度下降到50 ℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合 延伸 72 ℃左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5′端向3′端延伸 (3)結果：上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中的緩沖液完成的。 2．(2014·海南高考)下圖是將某細菌的基因A導入大腸桿菌內，制備“工程菌”的示意圖。 據圖回答： (1)獲得A有兩條途徑：一是以A的mRNA為模板，在____________酶的催化下，合成互補

18、的單鏈DNA，然后在________________的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據目標蛋白質的________序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測其DNA的______________序列，再通過化學方法合成所需基因。 (2)利用PCR技術擴增DNA時，需要在反應體系中添加的有機物質有________、________、4種脫氧核糖核苷三磷酸和耐熱性的DNA聚合酶，擴增過程可以在PCR擴增儀中完成。 (3)由A和載體B拼接形成的C通常稱為____________。 (4)在基因工程中，常用Ca2＋處理D，其目的是_______________

19、_______________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)利用逆轉錄法合成目的基因的過程是：以mRNA為模板，在逆轉錄酶的催化作用下合成單鏈DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成雙鏈DNA分子；根據蛋白質工程合成目的基因的過程是：根據目標蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測DNA中脫氧核苷酸的排列順序，再通過化學方法合成。(2)PCR過程中需要酶、底物、模板、引物和能量等條件。(3)目的基因和運載體結合，形成基因表達載

20、體。(4)在利用大腸桿菌作受體細胞時，需要先用Ca2＋處理，使之成為感受態(tài)細胞，有利于吸收重組DNA分子。 答案：(1)逆轉錄　DNA聚合酶　氨基酸　脫氧核苷酸　(2)引物　模板(A基因)　(3)基因表達載體　 (4)使其成為感受態(tài)細胞，有利于吸收重組DNA分子 拓展·歸納幾種獲取目的基因方法的比較 方法 從基因文庫中獲取 人工合成 從基因組文 庫中獲取 從部分基因文 庫，如cDNA 文庫中獲取 化學 合成法 逆轉 錄法 過程 3．(2018·東臺模擬)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，沿海灘涂鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽堿基

21、因培育出了耐鹽堿水稻新品系。請據圖回答下列問題： 限制酶 AlaⅠ EcoRⅠ PstⅠ SmaⅠ 切割位點 表2　幾種限制酶識別序列及切割位點表 (1)獲取真核生物的基因通常采用人工合成法，通過圖示中①方法合成的耐鹽堿基因中是不含________________的，如果要將耐鹽堿基因和質粒重組，應該在基因兩側的A和B位置除了接上以上兩個結構外，還需分別加入EcoRⅠ和__________限制酶識別序列，這樣設計的優(yōu)點是避免質粒和目的基因自身環(huán)化以及定向連接。 (2)過程②采用PCR技術擴增目的基因時，在PCR反應體系的主要成分中應該包含：擴增緩沖液(含M

22、g2＋)、水，4種脫氧核糖苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶和引物I和引物Ⅱ，若在該反應體系中，目的基因擴增了4代，則共用了引物I______個。 (3)請畫出PstⅠ限制性核酸內切酶切割DNA形成黏性末端的過程____________________________。 (4)圖示中將基因表達載體構建完成后沒有直接導入農桿菌，而是先將其導入大腸桿菌，目的是________________________________________________________ ________________________________。 (5)在步驟⑤⑥過程中都需用______處理兩類細

23、菌。為了確認目的基因通過⑦過程導入植物細胞中后是否成功表達，通常從分子水平進行檢測的方法是用____________法。 (6)假設該抗鹽堿基因D，通過基因工程導入水稻后連接到水稻的一條染色體上，則該水稻進行減數(shù)分裂的細胞在聯(lián)會時有______個D基因。 解析：(1)獲取真核生物的基因通常采用人工合成法，通過圖示中①方法合成的耐鹽堿基因中是不含啟動子和終止子的，如果要將耐鹽堿基因和質粒重組，應該在基因兩側的A和B位置除了接上以上兩個結構外，還需分別加入EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶識別序列。(2)若在該反應體系中，目的基因擴增了4代，共形成2×(24－1)＝30個DNA分子單鏈，則共用了引物I

24、是30/2＝15個。(3)PstⅠ限制性核酸內切酶切割DNA形成黏性末端的過程圖： (4)圖示中將基因表達載體構建完成后先將其導入大腸桿菌，目的是獲取大量重組質?；蜃屇康幕驍U增。(5)在步驟⑤⑥過程中都需用Ca2＋處理兩類細菌。為了確認目的基因通過⑦過程導入植物細胞中后是否成功表達，通常采用抗原—抗體結合法進行檢測。(6)假設該抗鹽堿基因D，通過基因工程導入水稻后連接到水稻的一條染色體上，則該水稻進行減數(shù)分裂的細胞在聯(lián)會時，由于DNA復制導致有2個D基因。 答案：(1)啟動子和終止子　SmaⅠ　(2)15　 (3) (4)獲取大量重組質粒(讓目的基因擴增)　(5)Ca2＋ 抗原

25、—抗體結合　(6)2 命題點2　基因表達載體的構建 4．(2016·天津高考)人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值，只能從人血漿中制備。下圖是以基因工程技術獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)為獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取________合成總cDNA，然后以cDNA為模板，使用PCR技術擴增HSA基因。圖中箭頭表示一條引物結合模板的位置及擴增方向，請用箭頭在方框內標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性，構建在水稻胚乳細胞內特異表達rHSA的載體，需要選擇的啟動子是________(填寫字母，單選)。 A．人血細胞啟動

26、子　　　　 B．水稻胚乳細胞啟動子 C．大腸桿菌啟動子 D．農桿菌啟動子 (3)利用農桿菌轉化水稻受體細胞的過程中，需添加酚類物質，其目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)人體合成的初始HSA多肽，需要經過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結構才有活性。與途徑Ⅱ相比，選擇途徑Ⅰ獲取rHSA的優(yōu)勢是__________________

27、_________________ ________________________。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值，須確認rHSA與______的生物學功能一致。 解析：(1)要想合成總cDNA，需要采集人的血液獲得總RNA。由于DNA的復制只能從脫氧核苷酸單鏈的5′端向3′端延伸，因而引物均應結合在DNA單鏈的3′端，而DNA的兩條鏈反向平行，由此可以確定引物在另一條脫氧核苷酸單鏈的位置和方向。(2)若要從水稻胚乳細胞內獲得目的產物，需要控制該目的基因只在水稻胚乳細胞內表達。由題干中的信息“啟動子通常具有物種及組織特異性”可知，此處需要選擇水稻胚乳細胞啟動子。(3)酚類物質能吸引

28、農桿菌，因此在水稻受體細胞中添加該類物質，能吸引農桿菌移向水稻受體細胞，有利于目的基因的成功轉化。(4)途徑Ⅰ和Ⅱ的主要區(qū)別是途徑Ⅰ的受體細胞是真核細胞，途徑Ⅱ的受體細胞是原核細胞。由于人體合成的初始HSA多肽需要經膜系統(tǒng)加工形成正確的空間結構才有生物活性，所以選擇途徑Ⅰ獲取rHSA更具有優(yōu)勢。(5)rHSA是基因工程的產物，其是否具有醫(yī)用價值，還需要在個體水平上進一步確認其與HSA的生物學功能是否一致。 答案：(1)總RNA(或mRNA)　(2)B　(3)吸引農桿菌移向水稻受體細胞，有利于目的基因成功轉化　(4)水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對初始rHSA多肽進行高效加工　(5)HSA

29、 拓展·歸納限制酶的選擇原則 (1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類： ①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。 (2)根據質粒的特點確定限制酶的種類： ①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保具有相同的黏性末端。 ②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限

30、制酶SmaⅠ會破壞標記基因。 基因工程的應用和蛋白質工程 命題點1　基因工程的應用 1．(2017·南京三模)在應用農桿菌侵染植物葉片獲得耐旱基因植株的實驗步驟中，不需要的是 (　　) A．將耐旱基因導入農桿菌并通過農桿菌侵染植物葉片細胞 B．利用標記基因和選擇培養(yǎng)基的作用，篩選導入耐旱基因的細胞 C．用PEG誘導轉基因細胞的原生質體融合后培養(yǎng)出愈傷組織 D．將轉基因幼苗栽培在干旱環(huán)境中以檢驗植株的耐旱性 解析：選C　 應用農桿菌侵染植物葉片獲得耐旱基因植株時，需要將耐旱基因導入農桿菌并通過農桿菌侵染植物葉片細胞；利用標記基因和選擇培養(yǎng)基的作用，篩選導入耐旱基因的細胞；該過

31、程不涉及細胞融合，不需要使用PEG；將轉基因幼苗栽培在干旱環(huán)境中，在個體水平檢驗植株的耐旱性。 命題點2　蛋白質工程 2．(2015·全國卷Ⅱ)已知生物體內有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}： (1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________________進行改造。 (2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因

32、表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內容包括__________________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：_______________________　。 (3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過______________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據此獲得基因，再經表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。 解析：(1)蛋白質的功能由蛋白質的三維結構決定，而蛋白質的三維結構與氨基酸序列有關，因此，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的氨基酸序列進行改

33、造。(2)P基因與P1基因的根本區(qū)別是堿基序列不同，因此可以通過對P基因進行修飾獲得P1基因，也可以直接合成P1基因。中心法則的內容可以通過下圖體現(xiàn)： (3)蛋白質工程的基本途徑：從預期的蛋白質功能出發(fā)→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的脫氧核苷酸序列(基因)。 答案：(1)氨基酸序列(或結構)(其他合理答案也可) (2)P　P1　DNA和RNA(或遺傳物質)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯) (3)設計蛋白質的結構　推測氨基酸序列　功能 拓展·歸納蛋白質工程與基因工程的比較 項目 蛋白質工程 基因工程 區(qū)

34、 別 原理 中心法則的逆推 基因重組 操作起點 預期的蛋白質功能 目的基因 操作核心 改造基因 基因表達載體的構建 區(qū) 別 過程 獲取目的基因 ↓ 構建基因表達載體 ↓ 將目的基因導入受體細胞 ↓ 目的基因的檢測與鑒定 實質 定向改造或生產人類所需蛋白質 定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品(基因的異體表達) 結果 生產自然界沒有的蛋白質 生產自然界已有的蛋白質 聯(lián) 系 蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程，因為要對現(xiàn)有蛋白質進行改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成來實現(xiàn)

35、 [高考真題集中研究——找規(guī)律] 1．(2014·江蘇高考，多選)下列關于基因工程技術的敘述，錯誤的是(　　) A．切割質粒的限制性核酸內切酶均特異性地識別6個核苷酸序列 B．PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應 C．載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因 D．抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達 解析：選ABC　限制性核酸內切酶大多是特異性地識別6個核苷酸序列，但也有少數(shù)限制性核酸內切酶能識別4個、5個或8個核苷酸序列；PCR反應中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用；載體質粒上抗生素抗性基因可作為標記基因，供重組DN

36、A的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因；目的基因導入受體細胞后不一定都能正常表達。 2．(2017·江蘇高考)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖如下，請回答下列問題： (1)從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過________獲得________用于PCR擴增。 (2)設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)，為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當?shù)腳_______________位點。設計引物時需要避免引物之間形成__

37、______________，而造成引物自連。 (3)圖中步驟1代表________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。 (4)PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞________________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但________的引物需要設定更高的退火溫度。 (5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有________(填序號：①升高退火溫度?、诮档屯嘶饻囟取、壑匦略O計引物)。 解析：(1)PCR技術可在體外對DNA進行擴增，模板可以是mRNA經過逆轉錄獲得的cDNA。(2)設

38、計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物(引物1和引物2)時，需在引物中增加適當?shù)南拗菩院怂醿惹忻?限制酶)的識別序列，便于目的基因與質粒的連接。為了避免引物自連，設計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對。(3)根據PCR的過程可知，圖中步驟1代表變性，步驟2代表退火(復性)，步驟3代表延伸，這三個步驟構成一個循環(huán)。(4)退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，過高的退火溫度會破壞引物與模板的堿基配對。因為G、C之間的氫鍵數(shù)多于A、T之間的氫鍵數(shù)，故GC含量高的引物需要設定更高的退火溫度。(5)如果PCR反應得不到任何擴增產物，可能的原因是退火溫度過高使擴增效率降低，也可能是未按照目的基因兩端

39、的核苷酸序列來設計引物，因此可以采取的措施是降低退火溫度、重新設計引物等。 答案：(1)逆轉錄　cDNA　(2)限制性核酸內切酶(限制酶)　堿基互補配對　(3)變性　(4)引物與模板　GC含量高　(5)②③ 3．(2016·江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序列及切割位點 圖1 圖2 (1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用__________________兩種限制酶切割，酶切

40、后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于________態(tài)的大腸桿菌。 (2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中___________________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”、“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得_____

41、___種大小不同的DNA片段。 解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質粒和目的基因時，應保留目的基因和至少一個標記基因結構的完整性，即遵循“目的基因切兩側，標記基因留一個”的基本原則，最好選擇切割產生不同末端的兩種限制酶同時切割質粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達，因此據圖分析應選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質粒，重組質粒需要導入Ca2＋處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細胞膜的通透性大大增加，便于重組質粒進入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導

42、入重組質粒的大腸桿菌，應先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長出的菌落為導入普通質?；蛑亟M質粒的大腸桿菌菌落，進一步鑒定出導入重組質粒的大腸桿菌，可利用PCR擴增的方式，結合電泳技術來分析處理。DNA的兩條鏈是反向平行的，在PCR過程中，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此應選擇引物甲和引物丙。(3)因為BclⅠ和BamHⅠ酶切產生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(4)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割

43、的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質粒上存在3個Sau3AⅠ的切割位點，若將3個切割位點之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個切割位點均被切割)會產生3種大小的DNA片段，即為a、b和c；考慮只切1個切割位點，有三種情況，都產生一種大小的DNA片段，即大小均為a＋b＋c；考慮切2個切割位點，則會產生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。 答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　連接　感受　(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙　(3

44、) 都不能　(4)7 4．(2015·江蘇高考)胰島素A、B鏈分別表達法是生產胰島素的方法之一。下圖1是該方法所用的基因表達載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工程菌生產人胰島素的基本流程(融合蛋白A、B分別表示β-半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白)。請回答下列問題： 圖2 (1)圖1基因表達載體中沒有標注出來的基本結構是________。 (2)圖1中啟動子是_________酶識別和結合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達；氨芐青霉素抗性基因的作用是 _____________________________________________________________

45、___________。 (3)構建基因表達載體時必需的工具酶有____________________。 (4)β-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點隱藏在內部，其意義在于___________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β-半乳糖苷酶被切成多個肽段，這

46、是因為_________________ ________________________________________________________________________。 (6)根據圖2中胰島素的結構，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量。你的推測結果是________，理由是___________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)基因表達載體中應具有啟動子、

47、目的基因、終止子、標記基因和復制原點。(2)啟動子是轉錄過程中RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達。圖中的氨芐青霉素抗性基因充當了標記基因，可用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含有重組質粒的大腸桿菌。(3)構建基因表達載體時，需要用同種限制酶分別切割目的基因和載體，然后用DNA連接酶將目的基因和載體連接。(4)胰島素肽鏈上具有蛋白酶的切割位點，會導致胰島素被菌體內的蛋白酶降解，而通過融合表達將切割位點隱藏在內部可防止胰島素的A、B鏈被菌體內的蛋白酶降解。(5)根據溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，并結合β-半乳糖苷酶被切成多個肽段，獲得了完整的胰島素A鏈、B鏈這一信息，可

48、以推測β-半乳糖苷酶中必然含有多個甲硫氨酸，胰島素A鏈、B鏈不含甲硫氨酸。(6)每一條肽鏈的兩個末端分別含有一個氨基和一個羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含兩條肽鏈的胰島素中至少含有2個游離的氨基。 答案：(1)終止子　(2)RNA聚合　作為標記基因，將含有重組質粒的大腸桿菌篩選出來　(3)限制酶和DNA連接酶 (4)防止胰島素的A、B鏈被菌體內蛋白酶降解　(5)β-半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸　(6)至少2個　兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸R基團中可能還含有游離的氨基 [調研試題重點研究——明趨勢] 一、選擇題 1．(2017·無錫一

49、模)下列有關基因工程的敘述，正確的是(　　) A．限制性核酸內切酶只在獲得目的基因時使用 B．重組質粒的形成是在細胞內完成的 C．目的基因必須整合到受體細胞的DNA中才能復制 D．通過基因工程育種可以定向地改造生物的遺傳性狀 解析：選D　構建基因表達載體時用同種限制酶切割目的基因和質粒；重組質粒的形成是在細胞外完成的，然后再導入受體細胞；重組質粒上有復制原點，不整合到受體細胞的DNA中也可復制；由于目的基因是已知基因，可以定向地改變生物的遺傳性狀。 2．限制性內切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ 的識別序列及切割位點分別為A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相關敘述正確的是(　　) A

50、．兩種限制酶的識別序列在DNA分子中出現(xiàn)的概率不同 B．兩種限制酶切割形成的黏性末端都是—AGCT C．分別用這兩種酶切割目的基因和質粒后能形成重組質粒 D．實驗中可通過控制反應時間、酶的濃度等控制酶切效果 解析：選D　限制性核酸內切酶HindⅢ和XhoⅠ的識別序列均為6個脫氧核苷酸，所以在DNA中出現(xiàn)的概率相同，均為1/46；兩者切出的黏性末端分別為—AGCT和—TCGA；由于黏性末端不同，故用兩種酶切割目的基因和質粒后不能形成重組質粒。 3．用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分別降解一個1 000 bp(1 bp即1個堿基對)的DNA分子，降解產物分別進行凝膠電泳，在電場

51、的作用下，降解產物分開，凝膠電泳結果如下圖所示。該DNA分子的酶切圖譜(單位：bp)正確的是(　　) 解析：選C　根據限制酶KpnⅠ切割后，降解產物只有一種，推測該DNA分子是環(huán)狀DNA，且只有1個KpnⅠ識別位點。根據限制酶EcoRⅠ切割后，降解產物為200 bp和800 bp，推測該DNA分子上有2個EcoRⅠ識別位點。再根據限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ混合切割，得到200 bp和400 bp兩種片段，確定選項C的圖譜是合理的。 4．(2017·泰州一模)將經過擴增的DNA和質粒用相同的限制酶進行如下圖所示的切割，電泳得到純凈的B片段和D片段，將兩種片段置于適宜的緩沖液中用DNA

52、連接酶處理。如果只考慮兩個片段的環(huán)狀連接，則能形成不同核苷酸序列的環(huán)狀DNA的種類是(　　) A．6種　　　　　　　　　 B．3種 C．2種 D．1種 解析：選A　只考慮兩個片段的環(huán)狀連接，能形成的環(huán)狀DNA有B片段與B片段同向連接的、B片段與B片段反向連接的、D片段與D片段同向連接的、D片段與D片段反向連接的、B片段與D片段同向連接的及B片段與D片段反向連接的，共6種。 5．(2017·揚州一模)下列關于核酸分子雜交和抗原—抗體雜交的敘述，正確的是(　　) A．核酸分子雜交是指兩條脫氧核苷酸鏈的雜交 B．抗原—抗體雜交的原理為堿基互補配對原則 C．核酸分子雜交可檢測目的基

53、因的存在和轉錄 D．抗原—抗體雜交常以目的基因產物作為抗體 解析：選C　核酸分子雜交可以是兩條脫氧核苷酸鏈的雜交，也可以是 DNA單鏈和RNA的雜交；抗原—抗體雜交的原理是抗體能與對應的抗原發(fā)生特異性結合；核酸分子雜交可檢測目的基因的存在和轉錄；抗原—抗體雜交中目的基因產物常作為抗原。 6．(2018·啟東中學段考)如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用效果的順序，正確的是(　　) A．①④②③　　　　　 B．①②④③ C．①②③④ D．①④③② 解析：選A?、偈菍⒁粋€DNA切成互補的兩個黏性末端，由限制性內

54、切酶發(fā)揮作用；DNA聚合酶是在DNA復制時發(fā)揮作用，④是DNA復制；DNA連接酶是將兩個DNA片段連接在一起(②)；解旋酶是將DNA分子雙鏈解旋成兩條互補的單鏈(③)。 7．(2018·海安期中)從某海洋動物中獲得一基因，其表達產物為一種抗菌體和溶血性均較強的多肽P1。目前在P1的基礎上研發(fā)抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，首先要做的是(　　) A．合成編碼目的肽的DNA片段 B．構建含目的肽DNA片段的表達載體 C．依據P1氨基酸序列設計多條模擬肽 D．篩選出具有優(yōu)良活性的模擬肽作為目的肽 解析：選C　已經獲得該目的基因片段，不需要合成編碼目的肽的DNA片段，A錯誤；需要構建含目的肽

55、的DNA片段的表達載體，但這不是第一步，B錯誤；蛋白質工程的第一步是根據蛋白質的功能，設計P1氨基酸序列，從而推出其基因序列，C正確；該基因表達產物為一種抗菌體和溶血性均較強的多肽P1，目前在P1的基礎上研發(fā)抗菌性強但溶血性弱的多肽藥物，而目的多肽是抗菌性強但溶血性弱，所以必需對其改造，保持其抗菌性強，抑制其溶血性，D錯誤。 8．(2018·泰興期中)微生物常被用于基因工程中。下列相關敘述正確的是(　　) A．從耐熱的細菌中獲取PCR所需的DNA連接酶 B．大腸桿菌、酵母菌等是基因工程常用的載體 C．作為載體的DNA分子需具有合成抗生素的基因 D．常利用土壤農桿菌將目的基因導入植物細

56、胞 解析：選D　從耐熱的細菌中獲取PCR所需的DNA聚合酶，A錯誤?；蚬こ讨谐Ｓ玫妮d體是質粒、動植物病毒、噬菌體的衍生物，B錯誤。作為載體的DNA分子需要有抗生素抗性基因，便于后期的篩選，C錯誤。常利用土壤農桿菌將目的基因導入到雙子葉植物細胞中，D正確。 9．下面為利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是(　　) A．②的構建需要限制性核酸內切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異 解析：選D　構建重組質粒需要用到限制性

57、核酸內切酶和DNA連接酶，不需要DNA聚合酶；含重組Ti質粒的農桿菌侵染植物細胞后，重組Ti質粒的T-DNA整合到受體細胞的染色體上，而不是重組Ti質粒整合到受體細胞的染色體上；導入受體細胞的目的基因表達后，轉基因植株方能表現(xiàn)出相應性狀，若目的基因在受體細胞中不表達，轉基因植株不能表現(xiàn)出相應性狀；⑤表現(xiàn)出抗蟲性狀則表明該植株細胞發(fā)生了基因重組，基因重組是可遺傳變異。 10．(2017·南京三模)根據某基因上游和下游的堿基序列，設計合成了用于該基因PCR的兩段引物(單鏈DNA)。引物與該基因變性DNA(單鏈DNA)結合為雙鏈DNA的過程稱為復性。下圖是兩引物的Tm(引物熔解溫度，即50%的引物

58、與其互補序列形成雙鏈DNA分子時的溫度)測定結果，下列敘述錯誤的是(　　) A．通常引物1和引物2不能有堿基互補配對關系 B．兩引物分別是子鏈延伸的起點，并可以反復利用 C．若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，推測引物2的GC含量較高 D．復性所需溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素 解析：選B　引物1和引物2不能有堿基互補配對關系，以免二者結合，A正確；兩引物參與形成子鏈，不能反復利用，B錯誤；若兩引物的脫氧核苷酸數(shù)相同，引物2的熔解溫度較高，推測GC含量較高，C正確；綜上所述，復性所需溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度等因素，D正確。 11．(2018·南

59、通模擬，多選)科學家利用基因工程技術將魚的抗凍蛋白基因導入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。在培養(yǎng)轉基因番茄的過程中，下列操作合理的是(　　) A．可用PCR技術或逆轉錄法獲得抗凍蛋白基因 B．利用選擇性培養(yǎng)基對構建的基因表達載體直接篩選 C．利用農桿菌轉化法將基因表達載體導入番茄體細胞 D．在低溫條件下篩選已導入抗凍蛋白基因的番茄植株 解析：選ACD　利用逆轉錄法可獲得cDNA；構建的基因表達載體不可以直接在選擇培養(yǎng)基上進行篩選，需要先導入受體細胞中再進行篩選；農桿菌轉化法是目的基因導入受體細胞的常用方法；利用低溫條件對耐寒番茄進行個體性狀水平的檢測，篩選出耐寒番茄植株。 12．(

60、2017·南通三模，多選)科研人員先分別PCR擴增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信號肽基因(編碼的肽鏈能引導新合成的蛋白質轉移、分泌)，再將它們拼接形成融合基因，并導入大腸桿菌生產尿酸酶。相關敘述正確的是(　　) A．擴增兩類基因時可以通過設計引物來控制兩類基因的拼接方向 B．構建融合基因的目的是使大腸桿菌能合成尿酸酶并分泌到細胞外 C．融合基因導入大腸桿菌前需構建基因表達載體，以保證目的基因正常表達和遺傳 D．在導入融合基因前，應先用NaCl處理大腸桿菌，使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞 解析：選ABC　 每個基因的兩端都有啟動子和終止子，它會調節(jié)基因的表達，因此擴增兩類基因時可以通過設計引物來控

61、制兩類基因的拼接方向，以便它們都能正常表達，A 正確；根據題干中原核生物胞外蛋白信號肽基因的功能可知，構建融合基因的目的是使大腸桿菌能合成尿酸酶并分泌到細胞外，B正確；融合基因導入大腸桿菌前需構建基因表達載體，以保證目的基因正常表達和遺傳，C正確；在導入融合基因前，應先用CaCl2處理大腸桿菌，使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞，D錯誤。 二、非選擇題 13．(2017·常州一模)我國科學家屠呦呦因在青蒿素研究中的特殊貢獻榮獲2015年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。青蒿素是青蒿植株的次級代謝產物，其化學本質是一種萜類化合物，其生物合成途徑如圖1所示。正常青蒿植株的青蒿素產量很低，難以滿足臨床需求，科學家為了提高

62、青蒿素產量，將棉花中的FPP合成酶基因導入了青蒿植株并讓其成功表達，獲得了高產青蒿植株，過程如圖2所示。 (1)研究人員從棉花基因文庫中獲取FPP合成酶基因后，可以采用________技術對該目的基因進行大量擴增，該技術除了需要提供模板和游離的脫氧核苷酸外，還需要提供________、__________________等條件。 (2)圖2中的①為________________，形成過程中需要________________等酶；棉花FPP合成酶基因能夠和質粒連接成①的主要原因是_____________________________________。 (3)若②不能在含有抗

63、生素Kan的培養(yǎng)基上生存，則原因是_______________。 (4)由題意可知，除了通過提高FPP的含量來提高青蒿素的產量外，還可以通過哪些途徑來提高青蒿素的產量？ (試舉一例)________________________________。 解析：(1)PCR技術的實質是DNA復制，需要熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、模板、引物和能量等。(2)①是重組質粒(即基因表達載體)，需要先利用限制酶切割棉花FPP合成酶基因和質粒，再用DNA連接酶連接。能夠連接的原因是具有相同的黏性末端。(3)若重組質粒沒有導入農桿菌，則農桿菌不含抗生素Kan抗性基因，不能在含有抗生素Kan的培養(yǎng)基上生存。(4)由

64、圖1可以看出，提高青蒿素的產量可以通過提高FPP的含量或增強ADS基因的表達來實現(xiàn)，也可以通過抑制SQS基因的表達，從而抑制FPP形成其他萜類化合物來實現(xiàn)。 答案：(1)PCR　引物　熱穩(wěn)定的DNA聚合酶　(2)基因表達載體(重組質粒)　限制酶和DNA連接酶　切割后具有相同的黏性末端　(3)重組質粒沒有導入農桿菌 (4)抑制SQS基因的表達(或增強ADS基因的表達) 14．(2017·鹽城三模)如圖為培育轉基因抗蟲棉的兩種途徑示意圖，請據圖回答問題： (1)與圖2相比，圖1的優(yōu)點是篩選出的目的植株_____________________。 (2)構建重組質粒時，需要使用的限制酶

65、是___________________，還需要使用的工具酶是_____________________。 (3)圖中過程①獲取的完整的重組質粒，除了圖中標出的特殊DNA片段外，還應該有_________________________等部分；過程②常用的方法是_______________________；過程③常用的試劑為___________________；培育獲取棉株2 或棉株4采用的生物學技術是_____________________。 (4)為檢測棉株3、棉株4的抗蟲特性，常使用的方法是_________________。 解析：(1)圖1是采用單倍體育種方法，結合基因工

66、程，培育出目的植株與圖2相比，該方法的優(yōu)點是目的植物是純合子，能穩(wěn)定遺傳。(2)用圖中的質粒和目的基因構建重組DNA分子時，不能使用SmaⅠ酶切割(SmaⅠ破壞目的基因)。因此只能選用的限制酶是EcoRⅠ和BamHⅠ切割目的基因和運載體，還需要DNA連接酶以構建基因表達載體。(3)過程①是構建基因表達載體(重組質粒)，基因表達載體中除了具有目的基因、啟動子和終止子之外，還需具有標記基因；過程②是將目的基因導入受體細胞中，受體細胞是植物細胞，常用的方法是農桿菌轉化法；棉株2是單倍體幼苗外植體中細胞經過植物組織培養(yǎng)技術獲取的，是單倍體；過程③常用的試劑為秋水仙素，過程③使棉株2細胞中染色體數(shù)目增倍，進而獲取純合子棉株3。(4)為檢測棉株3、棉株4的抗蟲特性，常使用的方法是接種害蟲，觀察棉株是否有抗蟲能力。 答案：(1)能穩(wěn)定遺傳(是純合子)　(2)EcoRⅠ和BamHⅠ DNA連接酶　(3)標記基因(和復制原點)　農桿菌轉化法　秋水仙素　植物組織培養(yǎng)　(4)接種害蟲，觀察棉株是否有抗蟲能力 15．(2017·蘇北三市三模)如圖所示為A、B、C三種質粒和一個含目的基因D的DNA片段示意