《05-生物化學實驗--聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《05-生物化學實驗--聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質（8頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質 【目的】 1 ． 掌握圓盤電泳分離血清蛋白的操作技術。 2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。 【原理】 帶電粒子在電場中向著與其自身電荷方向相反的電極移動，稱為電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質的電泳。在電泳時，蛋白質在介質中的移動速率與其分子的大小，形狀和所帶的電荷量有關。 聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺（ Acr ）單體和少量交聯劑 N,N- 亞甲基雙丙烯酰胺（ Bis ）在催化劑 過硫酸銨（ Ap ） 和加速劑 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下發(fā)生聚合反應而制得的（其化學結構式見第 2 篇第 1 章）。 聚丙烯酰胺凝膠具有網狀結構，其網眼的孔徑大小可用改變凝膠液中單體的濃度或單體與交聯劑的比例來加以控制。根據血清蛋白分子量的大小，學生實驗一般選用 7 ％聚丙烯酰胺凝膠分離血清蛋白質。 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳利用濃縮效應、分子篩效應和電荷效應的三重作用分離物質（見第 2 篇第 1 章）， 使樣品分離效果好， 分辨率較高。一般醋酸纖維薄膜電泳只能把血清蛋白質分離出 5 ～ 7 條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳卻能分離出十幾條到幾十條來（圖 3-4 ），是 目前較好的支持介質， 應用十分廣泛。 圖 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 根據凝膠支持物的形狀不同，分為垂直板電泳和盤狀電泳兩種，二者原理相同。本實驗采用的盤狀電泳是在直立的玻璃管中，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質的不連續(xù)體系，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮（濃縮效應）成厚 度 為 10 -2 cm 的起始區(qū)帶，然后再利用 分子篩效應和電荷效應的雙重作用在分離膠中 進行電泳分離。 【器材】 1 ．電泳儀 直流穩(wěn)壓電源，電壓 400 ～ 500V ，電流 50mA 。 2 ．垂直管型圓盤電泳裝置 目前這類裝置的種類很多，可根據不同的實驗要求選擇其中的一種。這類裝置均由兩個基本的部分組成，一部分為載膠玻璃管，須選用內徑均勻（ 5 ～ 6mm ） , 外徑 7 ～ 8mm ，長 80 ～ 100mm 的玻璃管作為材料，也可以使用更細的玻璃管。另一部分為電泳液槽，可分為上下兩槽 。電泳時，上下兩槽通過凝膠柱溝通電流（圖 3-5 ）。 圖 3-5 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖 (A 為正面， B 為剖面 ) 3 ．大號試管和中號試管 4 ．微量移液器 5 ． 5ml 注射器和 9 號注射針頭 6 ．洗耳球、濾紙條、封口膜等 【試劑】 1 ．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺 一般性的分析工作，用分析純的 Acr 和 Bis 即可，精細的分析工作，尤其是分子量的測定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 進行重結晶，進一步純化。 2 ． N ， N ， N ＇， N ＇ — 四甲基乙二胺（ TEMED ） 商品 TEMED 即可，低溫，避光保存。 3 ． 10% 過硫酸銨溶液（ AP ， W/V ） 10g 過硫酸銨定容到 10ml ，最好使用新鮮配制的溶液。 4 ．染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考馬斯亮藍 R 250 用玻璃棒攪拌，待完全溶解后，再加入蒸餾水加至 1000ml 。 5 ．脫色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸餾水溶解后加至 1000ml 。 6 ．儲備液的配制 電極緩沖液、凝膠緩沖液及凝膠儲備液配制見下表： 濃縮膠 緩沖液 Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸餾水至 100ml PH 6.7 凝膠儲液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸餾水至 100ml 分離膠 緩沖液 Tris 36.3g 1mol/LHCl 48ml 加蒸餾水至 100ml PH 8.9 凝膠儲液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸餾水至 100ml 10 電極緩沖液 Tris 6g Gly 28.8g 加蒸餾水至 1000ml PH 8.3 儲液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏備用，用時 10 倍稀釋，學生用時大約 3 天需更換一次。 7 ．凝膠液的配制 分離膠和濃縮膠的配制見下表： 7% 分離膠配制（ ml ） 3% 濃縮膠配制（ ml ） 雙蒸水 13.5 雙蒸水 5.7 凝膠儲液 7 凝膠儲液 1 PH 8.9 緩沖液 7.5 PH 6.7 緩沖液 1.3 1%TEMED 2 1%TEMED 2 總體積 30 總體積 10 8 ． 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ，加少許蒸餾水溶解，最后加至 100 ml 。 9 ．加樣緩沖液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 鹽酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混勻后，再加入 0.02g 溴酚藍， 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? 【操作】 1 ．凝膠系統(tǒng)的聚合和制備 一般先制備分離膠，然后再在分離膠上面制作濃縮膠。 （ 1 ）電泳玻璃管的準備 取一根潔凈的電泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶蓋的凹穴中或用封口膜密封，備用。 （ 2 ）分離膠（小孔膠）的制備 取分離膠 3ml 放入試管，加入 100μl 10% Ap 溶液混勻后使用。 用微量移液器抽取膠液小心迅速加入到玻璃管內，當加到液面距離電泳玻璃管上口 2cm 時停止（約 1.6ml ）。注意在加的過程中不要混進空氣，用過的注射器和針頭要及時用水清洗，防止堵塞。 再在其上面小心覆蓋 0.5cm 高的蒸餾水層（約 0.2ml ）以隔絕空氣，并防止柱表面的彎月面。加水過程中不要用力過猛，防止將液面膠液沖起。剛加入水層時在水層和膠面的交接處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現時標志分離膠聚合已經開始，應使玻璃管垂直靜置約 15~20 分鐘后，完成凝膠的聚合過程。然后用濾紙小心吸去表面的水層，切勿破壞膠面的完整性。 （ 3 ）濃縮膠（大孔膠）的制備 取濃縮膠 1ml 放入試管，加入 50μl 10%Ap 溶液混勻后使用。 用微量移液器吸取少量濃縮膠緩沖液漂洗一下分離膠的膠面，用濾紙吸取殘留的緩沖液，濾紙盡量不要接觸膠表面。 再加入約 1cm 高的濃縮膠（約 0.25ml ），表面也覆蓋一層蒸餾水。剛加入水層時在水層和膠面的交接處可見一明顯的折光面，此折光面會逐漸消失，等再次出現時標志濃縮膠聚合已經開始，聚合 20~30 min 后除去上面的水層，同樣不要破壞膠面的完整性。 吸去水層后用電泳緩沖液漂洗膠面，再用電泳緩沖液注滿至管口，在室溫下放置 10~20 min 后即可使用了。 2 ．樣品的制備和點樣 （ 1 ）樣品的準備：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加樣緩沖液混合。可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周。 （ 2 ）點樣：將制好的膠管裝入電泳槽中調節(jié)高度并塞緊，防止電泳中產生漏液。然后分別在電泳槽的上下槽體內注入電泳緩沖液，下槽的液面應沒過玻璃管的下管口（注意不要有氣泡存在）和電極絲；上槽的液面應沒過玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取 50μl 樣品；標準蛋白樣品 1 份（蛋白質含量 1mg/ml ，溶于加樣緩沖液中）小心的加入玻璃管內，注意不要讓樣品溢出管口。 4 ．電泳 （ 1 ）電流電壓條件 圓盤電泳：直流穩(wěn)流電流強度通常為 4mA/ 管 。 （ 2 ）電泳時間 一般約需 3 小時。樣品中溴酚藍電泳至距分離膠前緣約 1cm 處時即可停止電泳。 5 ．剝膠 電泳結束后，取下玻璃管，用帶長針頭的注射器（內盛蒸餾水）從濃縮膠一端緊貼玻璃管壁緩慢插入針頭，一面注入蒸餾水一面緩慢旋轉玻璃管。靠水流的壓力和潤滑作用使凝膠和玻璃管的內壁分開，待水流從另一端流出時，再慢慢將針頭退出（注意操作中不要把膠條攪碎）。然后用洗耳球輕輕在膠管的一端加壓，將膠條從玻璃管中緩慢滑出。 6 ．染色和脫色 剝膠完畢后，將膠條放入染色液中過夜（ 16 小時以上）。 將膠條以自來水沖洗兩次，然后在脫色液中脫色約 5 分鐘，共兩次。 7 ．結果分析 脫色完全后，從脫色槽中取出凝膠（小心折斷或撕裂），觀察區(qū)帶的數量及遷移率。如果需定量，可進行區(qū)帶掃描，計算出各區(qū)帶中蛋白質的含量。 【注意事項】 1 ．制膠時必須以封口膜將管下口封嚴密，加 AP 后立即灌膠。 2 ．灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。 3 ．電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。 4 ．電泳時，為保證電泳結果滿意，最好使用新稀釋的緩沖液。 5 ．丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時宜帶手套，純化應在通風柜中進行。 【思考題】 1 ． 聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，有何優(yōu)缺點？ 2 ． 哪些因素可以影響凝膠的聚合？ 3 ． 為什么在樣品中加含有少許溴酚藍的 40 ％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍各有何用途？ 附： 1 ． 不同濃度 聚丙烯酰胺 凝膠的配制，見表 3 -2 。 表 3-2 不同濃度 聚丙烯酰胺 凝膠的配制 分離膠濃度 試劑名稱 配制 30ml 不同濃度分離膠液所需試劑量（ ml ） 配制 10ml 3% 濃縮膠 7% 10% 12% 15% 20% 分離膠 儲備液 緩沖液 7 7.5 10 7.5 12 7.5 15 7.5 20 7.5 濃縮膠 儲備液 緩沖液 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 1.0 1.25 1%TEMED 蒸餾水 2 13.3 2 10.3 2 8.3 2 5.3 2 0.3 2 5.65 以上各液加入后，為了去除抑制凝膠聚合的氧，在加入 Ap 之前應進行抽氣處理。 10% 過硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 2 ．幾種染料的性能及染色原理 （ 1 ）氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 ， MW=715,λmax=620 ～ 630mm 。氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽。是最常用的蛋白質染料。缺點是靈敏度不太高，對 SDS— 蛋白質染色效果不好，對不同的蛋白質著色度不同，色調不一（有藍、黑、棕等）。 （ 2 ）考馬斯亮藍 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) ： C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na ， MW=824 ， λmax=560 ～ 590mm ，原理與氨基黑相似，靈敏度比氨基黑高 5 倍。尤其適用于 SDS 電泳微量蛋白質染色。但蛋白質濃度超出一定范圍時，對高濃度蛋白質的染色不合乎 Beer 定律。 （ 3 ）考馬斯亮藍 G 250 ： 比考馬斯亮藍 R 250 多 2 個甲基， MW=854 ， λmax=590 ～ 610mm 。染色的靈敏度不如 R 250 ，但比氨基黑高 3 倍，優(yōu)點在于它在三氯乙酸中不溶解成膠體，能選擇地染蛋白質而幾乎無本底色。所以常用于需重復性染色和穩(wěn)定性的染色，適于定量分析。 聚丙烯酰胺不連續(xù)盤狀電泳和垂直板電泳基本原理是相同的。后者適用于需要對比性分析的樣品的電泳分析。這項電泳技術（ PAGE ）由于能夠使樣品區(qū)帶濃縮變窄，所以分辨力高、設備簡單、樣品量小（ 1 ～ 100μg ）；時間短，操作方便，可分離生物大分子的分子大小范圍廣泛，可結合 SDS 后進行亞基分析和分子量測定。這種方法目前幾乎代替了超速離心沉降法。 PAGE 的用途較廣，對生物大分子能進行分離、定性、定量分析，又能用于制備 mg 水平的材料 。 3 ．蛋白質染色方法（表 3-3 ） 表 3-3 蛋白質染色方法 方 法 固 定 液 染 液 染 色 時 間 脫 色 氨基黑 10B 甲醇或 7% 乙酸 0.1mol/L 氫氧化鈉 - 1% 氨基黑 或 7% 乙酸 - 1% 氨基黑 5 min （室溫） 2 h （室溫）或 10min （ 96 ℃ ） 5% 乙醇，過夜 7% 乙酸，過夜 考馬斯亮藍 R 250 10% 三氯乙酸 20% 三氯乙酸 -1%R 250 過夜 10% 三氯乙酸 考馬斯亮藍 G 250 10% 乙酸 20% 乙酸 - 1%G 250 10 min （室溫） 甲醇 - 水 - 濃氨水 64 ∶ 36 ∶ 1