《中國(guó)藥科大學(xué) 生物工程 譚樹(shù)華老師全部PPT.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《中國(guó)藥科大學(xué) 生物工程 譚樹(shù)華老師全部PPT.ppt（274頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、生 物 工 程 譚 樹(shù) 華 博士、教授 ,中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院,參考書(shū)目錄,BOOKS Molecular Biology And Biotechnology (Edited by J.M.Walker and E.B. Gingold) Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA (Edited by Bernard R.Glick and Jack J. Pasternak) Pharmaceutical Biotechnology (Edited by Daan J A Crommeli

2、n and Robert D Sindelar) 現(xiàn)代生物工程 焦炳華、孫樹(shù)漢主編 現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論 瞿禮嘉、顧紅雅、胡蘋(píng) 編著 生物技術(shù)藥物 馬大龍主編 基因工程原理與方法 孫樹(shù)漢主編,JOURNALS NATURE BIOTECHNOLOGY TRENDS IN BIOTECHNOLOGY MOLECULAR BIOTECHNOLOGY,藥物分類(lèi),第一章 緒論 第一節(jié) 生物工程的概念 生物工程（技術(shù)）：就是利用生物有機(jī)體（這些生物有機(jī)體包括從微生物至高等動(dòng)、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器等）發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。,現(xiàn)代生物工程被列為當(dāng)今世界公認(rèn)的七大高新技術(shù)之

3、首（現(xiàn)代生物工程技術(shù)、航天工程技術(shù)、信息工程技術(shù)、激光工程技術(shù)、自動(dòng)化工程技術(shù)、新能源工程技術(shù)和新材料工程技術(shù)。生物工程之所以受到世界各國(guó)的如此重視，是因?yàn)樗诮鉀Q人類(lèi)所面臨的諸如食物短缺、人類(lèi)健康、環(huán)境污染和資源匱乏等重大問(wèn)題上有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)和巨大潛力。它已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工、食品、化工和能源等領(lǐng)域，并以對(duì)人類(lèi)社會(huì)生活產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的革命性影響。,第二節(jié) 生物工程主要研究?jī)?nèi)容 1、基因工程 2、動(dòng)物細(xì)胞工程 3、酶工程 4、微生物工程,生物技術(shù)發(fā)展史上的里程碑,第三節(jié) 生物技術(shù)制藥的誕生與發(fā)展,生物技術(shù)藥物 （biopharmaceutics,Biotech drug): 利

4、用生物體、生物組織、細(xì)胞或其成分，綜合應(yīng)用生物學(xué)與醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、微生物學(xué)與免疫學(xué)、物理化學(xué)與工程學(xué)和藥學(xué)的原理與方法加工制造而成的一大類(lèi)用于預(yù)防、診斷、治療和康復(fù)保健的制品。,其發(fā)展要追溯到1980年十月十五號(hào)，紐約股票交易所開(kāi)盤(pán)后20分鐘內(nèi)，生物制藥公司Genentech的股票價(jià)格從$35到$89,成為當(dāng)時(shí)歷史上上漲最快的股票。當(dāng)時(shí)Genentech的年齡才4歲，其原因是在這之前兩年1978年Genentech成功地分離了人胰島素的兩條鏈的基因，并轉(zhuǎn)入了大腸桿菌宿主細(xì)胞，這樣就有可能利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素，從而解決某些糖尿病患者對(duì)豬胰島素過(guò)敏的問(wèn)題。,1982年世界上第一個(gè)

5、基因工程藥物藥物誕生了，由美國(guó)Lilly公司率先研制的重組人胰島素經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)投放市場(chǎng)，這標(biāo)志著生物制藥技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)新紀(jì)元，也給廣大的制藥企業(yè)帶來(lái)了無(wú)限的商機(jī)。同時(shí)也向世人展示，以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)藥物具有無(wú)限的發(fā)展應(yīng)用前景和生命力。,據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球生物工程制藥產(chǎn)業(yè)的年銷(xiāo)售額1998年為149億美元，到2007年已增長(zhǎng)到840億美元，年增長(zhǎng)速度連續(xù)10年保持在15%-33%，其中，銷(xiāo)售額超過(guò)10億美元的“重磅炸彈”就有29種。由此可見(jiàn)，雖然生物技術(shù)制藥的發(fā)展只有短短20幾年，但已成為發(fā)展最快的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一。,我國(guó)的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)也發(fā)展勢(shì)頭良好，截止至2006年4月，我國(guó)食品

6、藥品監(jiān)督管理局(SFDA)已批準(zhǔn)了35種重組蛋白藥物、治療性抗體或基因治療產(chǎn)品上市，至2006年底，約有50余種生物技術(shù)藥物處于臨床或臨床試驗(yàn)中。,生物技術(shù)藥物在臨床上的應(yīng)用,生物技術(shù)藥物(biotech drugs，biopharmaceuticals）己廣泛用于治療癌癥、艾滋病、冠心病、多發(fā)性硬化癥、貧血、發(fā)育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纖維變性和一些罕見(jiàn)的遺傳疾病。,生物技術(shù)藥物的類(lèi)別,主要有三大類(lèi)： 1、重組治療蛋白質(zhì)（酶、細(xì)胞因子、激素） 2、重組疫苗 3、診斷或治療用的單克隆抗體或基因工程抗體。,2008年美國(guó)處于臨床試驗(yàn)的生物技術(shù)藥物的分布圖（按產(chǎn)品類(lèi)型分）中國(guó)醫(yī)藥生物技

7、術(shù) 2009，4（2）：89,2007 年銷(xiāo)售額最高的6大類(lèi)生物技術(shù)藥物 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù) 2009，4（2）：89,2008年美國(guó)處于臨床試驗(yàn)的生物技術(shù)藥物的分布圖（按適應(yīng)癥分） 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù) 2009，4（2）：89,第四節(jié) 美國(guó)及歐洲主要的生物技術(shù)藥物公司,Genetics Institute Bayer Centeon Genentech Gentocor Boehringer Mannheim Galenus Mannheim Eli Lilly Ortho Biotech Hoechst AG,Aventis Pharmaceuticals Genzyme Schwartz P

8、harma Pharmacia and Upjohn Biotechnology General Serono Organon Amgen Dompe Biotec,Schering Plough Hoffman-la-Roche Chiron Biogen Pasteur Merieux MSD Immunomedics Novartis Abbott Wyeth Unigene,Immunex Bedex Laboratories Merk SmithKline Beecham Medeva Pharma Cytogen Med Immune Roche Isis Pharmaceutic

9、als Sanofi-Sythelabo,（安進(jìn)） 創(chuàng)建于1980年，位于美國(guó)加洲Thousand Oaks，靠近加州大學(xué)和加洲理工學(xué)院。起初由于無(wú)產(chǎn)品上市，于1983，1986，1987通過(guò)公開(kāi)發(fā)行股票募集資金維持公司生存。美國(guó)Nasdaq股票市場(chǎng)代號(hào)為AMGN。 20世紀(jì)后10年是生物技術(shù)飛速發(fā)展的10年，1989年6月該公司第一個(gè)產(chǎn)品重組人紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，簡(jiǎn)稱(chēng)EPO)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和HIV感染治療的貧血1991年2月公司第二個(gè)產(chǎn)品重組粒細(xì)胞集落刺激因子(filgrastim，G-CSF)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，其適應(yīng)證為腫瘤化

10、療引起的嗜中性白細(xì)胞減少癥。1992年安進(jìn)公司首次躋身財(cái)富500強(qiáng)。此外,還有白細(xì)胞介素1受體拮抗劑Kineret和抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎融合蛋白Enbrel等。 公司致力于研發(fā)新的蛋白藥物，應(yīng)用于腫瘤、炎癥、骨疾病、神經(jīng)疾病、代謝性疾病和腎臟疾病的治療。,三個(gè)先驅(qū)生物制藥公司 Amgen,Biogen和Gennentech,Biogen是全球老牌生物技術(shù)公司之一，始建于1978年，并于2003年與制藥公司Idec合并組建成Biogen Idec公司。 總部位于美國(guó)麻省，在歐洲，加拿大，澳大利亞和日本有分支機(jī)構(gòu)。主要研發(fā)癌癥，精神病，皮膚病和風(fēng)濕病相關(guān)藥物。 主要品種是老藥Avonex（野生型干擾素

11、，適應(yīng)癥為多發(fā)性硬化癥）和Rituxan（與Genentech共同研發(fā)的瞄準(zhǔn)癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的單克隆抗體藥物，它可以挑選出癌細(xì)胞，交給免疫系統(tǒng)摧毀，適應(yīng)癥為腫瘤。 ）。 2005年，新藥Tysabri（人源化單抗，適應(yīng)癥為多發(fā)性硬化癥）因安全問(wèn)題撤市使股價(jià)受重大打擊，從70美元下跌至35美元/股左右。2006年，Tysabri因療效確實(shí)，在嚴(yán)格限制下重返市場(chǎng)，現(xiàn)有17000名患者使用該藥，沒(méi)有再發(fā)現(xiàn)致命和嚴(yán)重副作用。,Genentech(基因技術(shù)公司）美國(guó)歷史最久的生物技術(shù)公司，規(guī)模和實(shí)力僅次于安進(jìn)。它成立于1976年。創(chuàng)始人是風(fēng)險(xiǎn)投資家羅伯特. 斯萬(wàn)森(Robert A swanson)和生物化

12、學(xué)家赫伯特玻意爾博土(DrHerbert Boyer)。 70年代早期，玻意爾(Boyer)和遺傳學(xué)家史丹尼科恩(Stanley Cohen)開(kāi)創(chuàng)了個(gè)名為DNA重組技術(shù)的科學(xué)新領(lǐng)域。斯萬(wàn)森(Swanson)為這一突破激動(dòng)不已，他打電話給玻意爾請(qǐng)求會(huì)晤。玻意爾同意給這位年輕的創(chuàng)業(yè)者十分鐘的時(shí)間。斯萬(wàn)森對(duì)這一技術(shù)的熱心和對(duì)其商用前景的堅(jiān)定信念是富有感染力的，會(huì)晤由10分鐘延長(zhǎng)到了3個(gè)小時(shí)：其結(jié)果是，基因工程技術(shù)公司宣布誕生。,1980年，基因技術(shù)公司上市，一個(gè)小時(shí)內(nèi)每股從35美元?jiǎng)q至88美元，公司的身價(jià)因此激增至3500萬(wàn)美無(wú)。這一事件是美國(guó)股市漲幅最大的案例之一 。 上市有10個(gè)基因工程藥物，

13、其中包括:人生長(zhǎng)激素“Nutropin”,抗體藥物“Herceptin”和“Rituxan”,溶栓藥物“Activase”和“TNKase”.該公司目前處于臨床試驗(yàn)階段的還有20個(gè)左右的產(chǎn)品 基因工程公司作為美國(guó)最早和最大的生物技術(shù)類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)投資支持的企業(yè)，代表著美國(guó)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)未來(lái)的發(fā)展的方向，同時(shí)也為世界風(fēng)險(xiǎn)投資事業(yè)的發(fā)展提供了新的思路,人類(lèi)終于有了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥物上市用于臨床。該藥品從經(jīng)過(guò)基因修飾奶山羊分泌出的羊奶中提取純化，是用于治療一種被稱(chēng)為遺傳性抗凝血酶缺乏癥的疾病。這種藥物的上市標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物藥物真正邁入產(chǎn)業(yè)化時(shí)代。,2009年2月6號(hào)美國(guó)FDA批準(zhǔn)了首個(gè)利用轉(zhuǎn)基因山羊生

14、產(chǎn)的重組藥物Atryn（由美國(guó)麻省生物技術(shù)公司 GTC Biotherapeutics生物技術(shù)公司）上市。,第五節(jié) 發(fā)展前景 醫(yī)藥生物工程一直是生物工程技術(shù)中發(fā)展最快、最活躍的領(lǐng)域，也是各國(guó)生物工程研究開(kāi)發(fā)的重中之重，是生物工程產(chǎn)業(yè)最為成熟，競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的領(lǐng)域。近年來(lái)，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、干細(xì)胞和克隆技術(shù)、生物芯片技術(shù)等一系列新興技術(shù)的發(fā)展，為促進(jìn)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的途徑和思路，醫(yī)藥生物工程技術(shù)正在成為整個(gè)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要的技術(shù)推動(dòng)力。所以生物工程醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)依舊是朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。,第二章 基因工程與蛋白質(zhì)工程,基因工程是指在分子水平上按照人們的設(shè)計(jì)方案將DNA片段（目的

15、基因）插入載體DNA分子（如質(zhì)粒、病毒等），從而實(shí)現(xiàn)DNA分子體外重組，產(chǎn)生新的自然界從未有過(guò)的重組DNA分子，然后再將之引入特定的宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，使宿主細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。基因工程有時(shí)也稱(chēng)為重組DNA技術(shù)或分子克隆技術(shù)。,Genetic Codon,一、基因工程的概念及其基本過(guò)程,典型的主要步驟有： 1、 目的基因(靶基因)的制備； 2、 載體的選擇與制備； 3、 目的基因與載體的連接； 4、 將重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，并 在其中進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增； 5、 重組子的篩選與鑒定； 6、 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定； 7、 工程菌（細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)； 8、 表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化。,Clon

16、ing into a plasmid,基因工程必備的四個(gè)工具,工具酶 載體 目的基因(靶基因) 宿主細(xì)胞,二、工具酶,1. 限制性?xún)?nèi)切酶（restriction endonucleases） ：是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。這類(lèi)酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用促進(jìn)了DNA序列測(cè)定和基因工程技術(shù)的發(fā)展。它們已成為分子生物學(xué)研究和基因工程技術(shù)中不可或缺的工具酶。 1968年，科學(xué)家E.Smith首次從大腸桿菌K12和K13中提取出了限制性?xún)?nèi)切酶。由于它們能夠在DNA上尋找特定的切點(diǎn)，然后進(jìn)行交錯(cuò)或平齊切割，因此又稱(chēng)作“分子剪刀”，迄今已發(fā)現(xiàn)400多種。現(xiàn)在基因工程技術(shù)中所使用的限制性?xún)?nèi)切

17、酶幾乎都已商品化，在各生物技術(shù)公司（如國(guó)內(nèi)的華美、美國(guó)的Promega等公司）都能購(gòu)買(mǎi)到。,限制型內(nèi)切酶的命名 為了對(duì)這些酶進(jìn)行合理地命名，H.O.Smith和D.Nathans于1973年提出了限制性?xún)?nèi)切酶的命名規(guī)則：（1）取該酶的產(chǎn)生菌的屬名的第一個(gè)大寫(xiě)字母和種名的第一、二個(gè)小寫(xiě)字母組成酶基本名稱(chēng)；（2）若具有不同株，取其株系的第一個(gè)字母加于酶名稱(chēng)之后，需大寫(xiě)；（3）若同一株中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)切酶則用大寫(xiě)羅馬字碼I、II、III、IV表示分離次序先后。以下是幾種常見(jiàn)內(nèi)切酶的命名情況,限制型內(nèi)切酶的性質(zhì) 基因工程技術(shù)中使用的酶屬于II型限制性?xún)?nèi)切酶，它一般具有以下特性： 識(shí)別序列：大多數(shù)酶的識(shí)別序

18、列為4-6個(gè)雙重對(duì)稱(chēng)（回文結(jié)構(gòu)）的核苷酸，少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列。 切割方式： （1）在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)的位點(diǎn)上，交錯(cuò)切割，形成帶有1到4個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的5，端突出或3，端突出的粘性末端。所謂粘性末端是指含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端，可通過(guò)粘性末端堿基互補(bǔ)，使不同的DNA片段發(fā)生退火，有利于連接酶的連接。 （2）在識(shí)別序列雙重對(duì)稱(chēng)軸上同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平齊末端或鈍端。以下是幾種典型的限制性酶的識(shí)別序列與切割方式。,5端突出,3端突出,平齊末端,反應(yīng)條件： （1）一般限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度為37,但也有例外，如Sma則為25。 （2）不同限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)所需的離子強(qiáng)度也不一樣，一般分高、中、低三種。在

19、進(jìn)行操作時(shí)可供應(yīng)商所提供的反應(yīng)體系與反應(yīng)溫度進(jìn)行。,同裂酶與同尾酶 同裂酶（isoschizomer）：又稱(chēng)異源同工酶，指不同來(lái)源但識(shí)別和切割序列完全相同的限制性?xún)?nèi)切酶。如HpaII和MspI(CCGG)； 不完全同裂酶：指識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不同的酶，如SmaI（CCCGGG）和Xma I（CCCGGG）； 同尾酶：來(lái)源及識(shí)別序列均不相同，但切割后行成的限制性片段具有相同粘性末端的，當(dāng)它們消化后產(chǎn)生的片段互相連接后，這兩種酶的識(shí)別序列一并消失。如：Sal I（GTCGAC）和Xho I(CTCGAG) Sal I片段 Xho I片段 5，G， + TCGAG 3， 3，CAGCT C 5

20、， 5， GTCGAG 3， 3， CAGCTC 5，,星號(hào)活力（第二活力） 迄今所發(fā)表的第II型限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列都是在一定消化條件下測(cè)出的，當(dāng)條件改變時(shí)，酶的專(zhuān)一性可能會(huì)降低，以至同一種酶可識(shí)別和切割更多的位點(diǎn)。 如EcoR I通常只識(shí)別GAATTC，但是在低鹽（50nM），高pH（8）和甘油存在的條件下，EcoR I識(shí)別序列與原來(lái)不同，產(chǎn)生EcoR I星號(hào)酶活，除中間四個(gè)堿基A不能變成T、T不能變成A外，識(shí)別序列的6個(gè)堿基位置上僅在一處與原來(lái)序列不同的任何一個(gè)堿基的替代，EcoR I照舊能識(shí)別此序列（如GAATTA，AAATTC，GAGTTC等）。因而EcoR I的識(shí)別序列在DNA上

21、出現(xiàn)的頻率要比EcoR I識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率高15倍。此外，BamH I也有類(lèi)似情況。 因此，為了獲得一種限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)速度和理想的消化專(zhuān)一性，必須堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件 。,酶的儲(chǔ)存 純化后的限制性?xún)?nèi)切酶酶制劑，通常儲(chǔ)存在含有50%甘油的緩沖液中，保存于-20，不會(huì)冰凍，一般可儲(chǔ)存一年以上。儲(chǔ)存酶的溫度不能過(guò)低，若低于-20，可使50%甘油冰凍，而反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致酶嚴(yán)重失活。保存酶液的緩沖體系，不同的酶略有差異,但不外呼是50-100mMKCl即100mM Tris-HCl pH7.5,0.1mM EDTA,1mM DTT，同時(shí)加入BSA濃度至100-200g/ml,以保護(hù)酶蛋白不失活

22、。所用BSA質(zhì)量要求很高，一定不能含有核酸酶類(lèi)的活性。,酶活力單位的定義 在50l緩沖液中，于最適反應(yīng)條件和溫度下保溫1小時(shí)，能將1gDNA完全降解所需的酶量即為1個(gè)酶活單位。 需要說(shuō)明的是，所謂一個(gè)酶單位降解1gDNA是指在測(cè)活時(shí)所用的特定反應(yīng)體系和DNA種類(lèi)下完成的，若鹽濃度、pH等因素，尤其是DNA的種類(lèi)改變后，并不一定一個(gè)酶單位還能完全消化1gDNA。如，降解1g的pBR322所用的酶量要大于水解1gDNA所用的酶量。,2 T4DNA連接酶 基因工程最常用的連接酶是T4DNA連接酶（T4 DNA ligase）, 它可將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼連起來(lái)，起到分子“縫合”的作用。該酶是從T

23、4噬菌體感染的E.coli 中分離得到的分子量為68KDa的單鏈多肽酶，它可催化一個(gè)DNA片段的3羥基和另一個(gè)DNA片斷的5磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵，連接時(shí)需要ATP為輔助因子。該酶既可連接粘性末端，也可連接齊平末端，是應(yīng)用最廣泛的連接酶。 T4DNA連接酶最適反應(yīng)溫度為37，但為了增強(qiáng)兩段DNA片段粘性末端互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵的穩(wěn)定性，實(shí)際反應(yīng)溫度一般為415。,其它常用修飾酶 DNA聚合酶 分子克隆中 經(jīng)常會(huì)使用各種DNA 聚合酶，從而在有模板存在時(shí)催化合成與模板序列互補(bǔ)的DNA產(chǎn)物。常用的DNA聚合酶有大腸桿菌聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Klenow 片斷）、T4DNA聚合酶，

24、T7DNA聚合酶，耐高溫的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）,反轉(zhuǎn)錄酶等等。不同種類(lèi)的DNA聚合酶來(lái)源不同，酶學(xué)特性及用途也各異，其應(yīng)用涉及到DNA分子的體外合成，定點(diǎn)突變，DNA探針的標(biāo)記，DNA序列測(cè)定，基因文庫(kù)的構(gòu)建，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等等諸多方面。,T4多核苷酸激酶 該酶可催化ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5一OH上?？煞譃檎蚍磻?yīng)及交換反應(yīng)。該酶的一個(gè)用途是用同位素標(biāo)記DNA片段的5末端，反應(yīng)底物包括化學(xué)合成的寡核苷酸片段的5一OH和DNA酶切所得的5粘端或平端，后者必須先用堿性磷酸酯酶去除5一P，再加上P，這種方法不適用于3粘端。另一用途是在化學(xué)合成的寡核苷酸片段的

25、5一OH上加上磷酸基團(tuán)，以便進(jìn)行化學(xué)合成基因的拼連。 堿性磷酸酶 包括細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)和牛小腸堿性磷酸酶(CIP)，其作用是去除DNA、RNA、NTP和dNTP的5磷酸根。在基因克隆時(shí)可用于去除載體DNA片斷的5P，以防載體自身環(huán)化；此外，在用32PATP對(duì)基因探針進(jìn)行5進(jìn)行標(biāo)記前，可用該酶去除其5磷酸基團(tuán)。,基因工程載體 目的基因（靶基因）必須與載體DNA重組后才能導(dǎo)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的目的基因克隆以及表達(dá)產(chǎn)物。這種可將外源DNA載入宿主細(xì)胞的工具便稱(chēng)為載體（vector）。 一般作為基因工程載體需要滿足以下條件：1、能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制繁殖；2、有一定的選擇

26、標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；3、可插入一段較大的外源DNA，而不影響其自身的復(fù)制；4、有合適的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，以便進(jìn)行DNA重組與克隆。 目前基因工程載體主要有三類(lèi)： 質(zhì)粒：各種質(zhì)粒，用于基因克隆與表達(dá)； 噬菌體：噬菌體、粘粒、M13噬菌體等； 病毒：SV40等。,質(zhì)粒 質(zhì)粒DNA是微生物細(xì)胞中分子量比染色體DNA小得多的共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子（個(gè)別除外，如酵母自殺質(zhì)粒是RNA），是一種存在于染色體外的能自主復(fù)制的遺傳因子，質(zhì)粒通常帶有與細(xì)胞的主要代謝活動(dòng)無(wú)關(guān)的一些基因，例如抗生素抗性基因，產(chǎn)生細(xì)菌素的基因，碳水化合物分解代謝的基因和誘發(fā)腫瘤的基因等等。由于質(zhì)粒的存在，宿主細(xì)胞往往被賦

27、予新的表型，當(dāng)把一個(gè)含抗藥性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞之后，原來(lái)無(wú)抗藥能力的細(xì)菌則表現(xiàn)出抗藥新表型。,質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì) (1) 質(zhì)粒的復(fù)制 具備復(fù)制起點(diǎn)（原點(diǎn)）是DNA分子在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的一個(gè)必要條件。根據(jù)復(fù)制控制類(lèi)型的不同質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型質(zhì)粒與松弛型質(zhì)粒，前者受宿主細(xì)胞復(fù)制作用的嚴(yán)格控制，因此，每個(gè)細(xì)胞中只含有一至幾個(gè)拷貝；而后者則受宿主細(xì)胞的控制不嚴(yán)，它們?cè)诿總€(gè)細(xì)胞中的數(shù)目可達(dá)10-500個(gè)拷貝，當(dāng)用氯霉素抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成時(shí)，質(zhì)?？截悢?shù)可擴(kuò)增至數(shù)千個(gè)。現(xiàn)在使用的質(zhì)粒載體絕大多數(shù)都是松弛型質(zhì)粒。,（2）質(zhì)粒不相容性（incompatibility) 指在沒(méi)有選擇壓力的條件下，兩種親源關(guān)系密切的

28、質(zhì)粒不能共存于同一宿主細(xì)胞中的現(xiàn)象。原因是它們的復(fù)制子相同，所用的復(fù)制系統(tǒng)也相同，故在復(fù)制和分配到字細(xì)胞的過(guò)程中互相競(jìng)爭(zhēng)。細(xì)菌生長(zhǎng)幾個(gè)世代后，量少的質(zhì)粒就完全消失。至今已發(fā)現(xiàn)30個(gè)以上的不相容組，只有屬于不同不相容組中的質(zhì)粒才能共同存在于同一個(gè)宿主細(xì)胞中。 （3）選擇標(biāo)記 當(dāng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，只有極少部分宿主細(xì)胞接受了DNA，所以需要利用質(zhì)粒編碼的選擇標(biāo)記將轉(zhuǎn)化成功的宿主細(xì)胞（陽(yáng)性克隆）從大量的宿主細(xì)胞中篩選出來(lái)。 質(zhì)粒最常用的選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因，這些抗性主要包括氨芐青霉素（Amp或Ap）、四環(huán)素(Tet)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan或Km)和新霉素（Neo）等。例如，對(duì)氨

29、芐青霉素有抗性的質(zhì)粒，一般寫(xiě)作Apr；而對(duì)該藥敏感的質(zhì)粒則寫(xiě)作Aps。,常見(jiàn)質(zhì)粒載體 由于野生質(zhì)粒往往存在許多不足，因此現(xiàn)在使用的質(zhì)粒載體一般都是人工構(gòu)建的，從而使其滿足以下條件：1、其分子結(jié)構(gòu)中帶有多個(gè)單一限制酶切位點(diǎn)，2、構(gòu)建后的重組質(zhì)粒必須易于轉(zhuǎn)化；3、帶有一個(gè)以上強(qiáng)選擇性標(biāo)記；4、分子量較小，屬松弛型復(fù)制控制，便于操作；5、宿主范圍小，無(wú)感染性。 pUC 系列載體是目前應(yīng)用較廣的一組可用于克隆、測(cè)序和表達(dá)外源基因的非常有用的載體系列。這類(lèi)載體具有以下特征：（1）、高拷貝數(shù)，每個(gè)宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可達(dá)500-700個(gè)；（2）、在相應(yīng)的宿主中可出現(xiàn)互補(bǔ)，便于進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選；（3）、pUC

30、系列載體是成對(duì)出現(xiàn)的，它們之間除多克隆位點(diǎn)排列方向相反外，其它并無(wú)區(qū)別。,2007/10/10,噬菌體 結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 噬菌體分頭部和尾部，其DNA存在于頭部，當(dāng)其尾部附著在大腸桿菌宿主表面時(shí)，其DNA通過(guò)尾部注入宿主菌。噬菌體基因組是一線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)48502bp，含61個(gè)基因，其兩端各有長(zhǎng)為12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈。進(jìn)入宿主后，粘性末端相連（此處稱(chēng)COS位點(diǎn)）形成環(huán)狀DNA分子，根據(jù)噬菌體三個(gè)編碼基因（cI、cII、cro）產(chǎn)物間的平衡情況進(jìn)入溶菌或溶源生活周期。 在溶菌方式中，環(huán)狀DNA分子被復(fù)制許多倍，噬菌體基因產(chǎn)物大量合成，并組裝成子代噬菌體顆粒，最終宿主細(xì)胞裂解，釋放出許多成熟的噬

31、菌體顆粒。 在溶源方式中，噬菌體DNA通過(guò)專(zhuān)一位點(diǎn)重組整合入宿主DNA分子中，隨宿主菌DNA一起復(fù)制并轉(zhuǎn)入子代細(xì)胞中。,噬菌體DNA克隆載體 噬菌體DNA可分為三個(gè)部分：左臂、右臂及中央?yún)^(qū)。溶菌生長(zhǎng)所需的基因位于基因組的左、右臂，而溶源化生長(zhǎng)所需的基因都集中在中央?yún)^(qū)，若用外源DNA置換這個(gè)區(qū)域的基因，并不影響噬菌體顆粒的形成。這便是噬菌體DNA可作為載體攜帶外源基因的基礎(chǔ)。 野生型噬菌體DNA上有許多常用限制性酶切位點(diǎn)（如EcoRI、HindIII等），不能直接作為載體，需要經(jīng)過(guò)人工改建才能成為有價(jià)值的克隆載體，改建工作包括：1、消除或改變DNA必需區(qū)的不必要的限制性酶切位點(diǎn)；2、在可替代區(qū)構(gòu)

32、建所需的酶切位點(diǎn)；3、其它結(jié)構(gòu)上的改建，以提高載體效用，如插入一個(gè)外源啟動(dòng)子，使載體具有表達(dá)外源基因的功能等等。,載體的種類(lèi) 載體可分為插入型和置換型兩大類(lèi)，前者具有單一酶切位點(diǎn)可供外源DNA插入，后者有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，兩酶切位點(diǎn)間的DNA片段可被外源DNA片段置換。常見(jiàn)的載體有g(shù)t系列（置換型載體），常用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建；Charon系列（分插入和置換兩種類(lèi)型）, 可容納0-24Kb大小的外源基因。 載體的特點(diǎn) 載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、可攜帶較長(zhǎng)的外源DNA片段，最長(zhǎng)達(dá)18-22Kb; 2、重組DNA分子包裝成噬菌體顆粒后具有更高的轉(zhuǎn)染能力；3、重組的噬菌體容易篩選和儲(chǔ)存。 此外，為獲得較高

33、的感染宿主能力，DNA構(gòu)建的重組DNA分子必須包裝成完整的噬菌體顆粒，這對(duì)于保證基因文庫(kù)的完整性非常重要。體外包裝是指人為地將重組DNA分子與高濃度噬菌體頭部前體、包裝蛋白和尾部蛋白混合，自動(dòng)包裝成完整的噬菌體顆粒。包裝蛋白可以自己制備也可以從商家購(gòu)買(mǎi)。,粘粒（Cosmid） 粘粒又稱(chēng)柯氏質(zhì)粒，是構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)的的重要載體。載體所克隆的外源片段通常不超過(guò)15-20Kb,然而有些真核基因含有多個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度超過(guò)20Kb，為滿足克隆大片段的需要，于是構(gòu)建出粘粒載體。粘粒大小為4-6Kb,而插入片段則可大至29-45Kb。 粘粒是由質(zhì)粒和噬菌體DNA的粘性末端構(gòu)建而成的載體。重組的粘?？蛇M(jìn)行體

34、外包裝，包裝好的顆?？捎行У馗腥敬竽c桿菌，這樣就避開(kāi)了大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的困難，同時(shí)它在宿主菌內(nèi)也可象質(zhì)粒一樣復(fù)制增殖。 粘粒是包含cos序列的質(zhì)粒，不能裂解宿主菌形成噬菌斑。在篩選重組子時(shí)，菌落篩選比嗜菌斑篩選所需實(shí)驗(yàn)步驟多，一次篩選的菌落數(shù)也遠(yuǎn)不及嗜菌斑多。因此，在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，首選噬菌體載體，只有在克隆大片段基因時(shí)才選用粘粒構(gòu)建基因文庫(kù)。,粘粒在使用方法上與噬菌體載體有所區(qū)別。以粘粒pJB8DNA為例，首先建立兩個(gè)酶切反應(yīng)，分別用HindIII和SalI進(jìn)行消化。由于這兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)分別位于cos位點(diǎn)的兩側(cè)，所以切割后便形成了“右邊” cos片段和“左邊” cos片段。用堿性磷酸酶進(jìn)行處理以

35、去除cos片段的5-末端磷酸基團(tuán)，以防止載體自連或載體與載體之間的連接。然后對(duì)上述去磷酸基團(tuán)的cos片段反應(yīng)物再用BamHI進(jìn)行消化，這樣便可以得到具有BamHI粘性末端的cos片段（一個(gè)為大片段，另一個(gè)為小片段）。將這兩個(gè)大小大片段與MboI或Sau3A部分消化并作了脫磷處理的真核生物DNA（3247Kb）進(jìn)行混合連接。結(jié)果便會(huì)形成一種由“左邊” cos片段、一條長(zhǎng)度為3247Kb的插入片段和“右邊” cos片段組成的可包裝的重組DNA分子。轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌后便可以像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并賦予宿主細(xì)胞氨芐抗性。,用粘粒載體進(jìn)行克隆（方法之一）,M13噬菌體載體 M13是一種絲狀的大腸桿菌噬菌

36、體，只感染具有F因子的雄性E.coli，其基因組是一單鏈環(huán)狀DNA分子，全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸。噬菌體單鏈DNA（+）鏈進(jìn)入細(xì)胞后，便復(fù)制出與之互補(bǔ)的（-）鏈DNA，形成復(fù)制型雙鏈DNA（RFDNA），RFDNA通過(guò)滾環(huán)復(fù)制可積累100-200個(gè)RF拷貝，與此同時(shí)，（+）鏈積累，并被組裝成成熟的噬菌體顆粒，釋放至培養(yǎng)基中，但并不引起細(xì)菌裂解。被M13噬菌體感染的細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，在平板培養(yǎng)基上形成渾濁的 “嗜菌斑”。 不僅M13噬菌體可以侵染細(xì)菌，而且其單鏈或RFDNA無(wú)需包裝也可直接轉(zhuǎn)化雄性E.coli，這為M13用作基因工程載體提供了極大的方便。,M13 噬菌體載體M13mp18/19圖譜,M1

37、3 噬菌體載體M13mp18/19多克隆位點(diǎn)序列,mp載體系列皆由M13噬菌體改造而來(lái)，在M13基因II和基因IV之間的非編碼區(qū)插入LacZ的調(diào)控序列及其N(xiāo)端146個(gè)氨基酸編碼序列，以便利用互補(bǔ)對(duì)重組子進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。在LacZ基因內(nèi)引入一多克隆位點(diǎn)（MCS）以便進(jìn)行外源基因的克隆。如，M13mp18和M13mp19是一對(duì)常用載體，它們的唯一區(qū)別在于LacZ基因內(nèi)的多酶切位點(diǎn)順序正好相反。 由于重組絲狀噬菌體的基因組趨于不穩(wěn)定，因此絲狀噬菌體載體并不用于外源DNA片段的常規(guī)克隆和增殖，主要用來(lái)制備已經(jīng)克隆于另一類(lèi)載體（質(zhì)?；蚴染＃┲械腄NA片段的單鏈拷貝。RF型DNA可以象質(zhì)粒那樣進(jìn)行分子操

38、作，而單鏈DNA（ssDNA）分子則可以在下列工作中用作摸板：（1）雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA序列測(cè)定；（2）進(jìn)行單鏈DNA探針的標(biāo)記；（3）寡核苷酸定點(diǎn)誘變。,動(dòng)物病毒載體 病毒載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因工程中應(yīng)用較多，常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒載體有SV40（猿猴病毒）、BPV（牛乳頭瘤病毒）、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒等；昆蟲(chóng)病毒載體有桿狀病毒等。 SV40病毒基因組為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），長(zhǎng)5243bp，基因組分早期和晚期兩個(gè)功能區(qū)，兩功能區(qū)間含DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。早期區(qū)在整個(gè)裂解周期都被轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)不同剪切方式產(chǎn)生大T和小t抗原的兩種mRNA；晚期區(qū)僅在DNA復(fù)制后才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

39、，編碼病毒外殼蛋白VP1、VP2、VP3。,完整的SV40病毒粒子不需要改造便可作為克隆載體。一般以早期區(qū)取代與晚期區(qū)取代兩種取代方式構(gòu)建重組子。若晚期區(qū)被取代，則需用早期區(qū)域缺失的SV40突變種作為輔助病毒與之混合感染宿主，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒產(chǎn)生的早期基因產(chǎn)物一起形成完整的病毒顆粒，反之亦然。 直接用SV40作為載體有以下缺點(diǎn)：（1）、容量小，外源片段不大于2.5Kb；（2）、感染宿主范圍有限，只能在猴細(xì)胞中復(fù)制；（3）、用輔助病毒進(jìn)行混合感染時(shí)，有可能發(fā)生重組產(chǎn)生野生型的SV40帶來(lái)危險(xiǎn)。 因此，目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所使用的SV40載體都是經(jīng)過(guò)改造的病毒載體質(zhì)粒。如pSV就

40、是由SV40衍生出來(lái)的載體系列，同時(shí)將tk、dhfr、neo、cat等標(biāo)記基因與pSV40質(zhì)粒重組，構(gòu)建出適用于不同目的的表達(dá)載體(pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr)，這類(lèi)載體適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)克隆的外源基因。,目的基因的制備 要實(shí)現(xiàn)某一目的基因（靶基因）的表達(dá)，首先就必須克隆得到該基因?；蚩寺〉姆椒ê芏?，即使是同一類(lèi)的方法也有可能在技術(shù)路線或細(xì)節(jié)技巧上有所差異。 目前應(yīng)用較多的基本方法主要有： 1 基因文庫(kù)的建立與篩選； 2 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法得到； 3 人工化學(xué)合成方法制備。,基因文庫(kù)的建立與靶基因的分離 基因文庫(kù)（gene library 或

41、 gene bank）主要分兩類(lèi)：基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，兩者獲取核酸的來(lái)源不同。 基因組文庫(kù)是通過(guò)機(jī)械剪切或限制性酶消化將某種生物的基因組切成一定大小的片段，然后與合適的載體（噬菌體載體或粘粒）連接，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得一群重組DNA克隆的混合物，其中包含了該生物的各種基因或基因組。原核生物和低等真核生物，由于基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因組文庫(kù)可以作為直接提供目的基因的來(lái)源。,在高等生物中由于結(jié)構(gòu)基因是由外顯子（exon，蛋白質(zhì)編碼序列）與內(nèi)含子（intron,非蛋白質(zhì)編碼的間隔序列）排列組成的，其轉(zhuǎn)錄物需要經(jīng)過(guò)剪接（splicing）去除內(nèi)含子，使外顯子連接加工產(chǎn)生成熟的mRNA，為

42、獲得完整的能直接進(jìn)行表達(dá)的真核生物編碼目的基因，就必須構(gòu)建cDNA（complementary DNA）文庫(kù)。 所謂cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的互補(bǔ)DNA，它是成熟mRNA的拷貝，不含有任何內(nèi)含子序列，可以在任何一種生物體中進(jìn)行表達(dá)。將細(xì)胞總mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并獲得克隆，由此得到的cDNA克隆群體便稱(chēng)為cDNA文庫(kù)，它代表了某種生物的全部mRNA序列，即蛋白質(zhì)編碼信息。,構(gòu)建cDNA文庫(kù)主要包括以下幾個(gè)步驟： （1）、mRNA的分離。真核細(xì)胞mRNA分子是單順?lè)醋?，?端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3多聚腺苷酸(poly A)尾巴，這為mRNA的提取提供了極大的方便。目前

43、，以利用寡聚脫氧胸苷酸（oligo dT）-纖維素柱層析法提取最為常用，其原理是oligo dT與poly A之間可形成氫鍵，從而將mRNA分子有效吸附。值得注意的是，提取的mRNA愈完整，構(gòu)建的cDNA文庫(kù)質(zhì)量也就愈高；其次是，提取的mRNA不能有DNA污染。 （2）、cDNA第一條鏈的合成。利用Oligo-dT或610個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸隨機(jī)引物與poly(A)mRNA雜交，形成引物，在反轉(zhuǎn)錄酶AMV或MLV作用下，以mRNA為模板，利用4種脫氧核苷三磷酸（4dNTPS），從引物3端OH基開(kāi)始合成sscDNA。 （3）、cDNA第二條鏈的合成。堿處理去除DNA/RNA中的mRNA, ssc

44、DNA3 末端自身環(huán)化，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此為引物在E.coliDNA聚合酶I或Klenow片段和反轉(zhuǎn)錄酶的共同作用下，利用4dNTPs完成cDNA第二條鏈的合成。在核酸酶S1作用下，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)和另一端的單鏈切除。,（4）、cDNA與載體的連接。最常用的載體有g(shù)t10和gt11兩種。它們都具有供外源cDNA片段插入的EcoRI位點(diǎn)。由于合成的cDNA為平頭末端，需在其兩端加上EcoRI連接子，再經(jīng)EcoRI甲基化酶甲基化，以免在酶切產(chǎn)生粘性末端時(shí)cDNA內(nèi)部的EcoRI位點(diǎn)被切開(kāi)。 （5）、噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。若用質(zhì)粒作載體，cDNA與載體連接后可直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；若采用噬菌體作載體

45、，必須體外包裝成噬菌體顆粒感染宿主菌。,從cDNA文庫(kù)中篩選目的克隆主要有以下方法： （1）、核酸雜交。這是從cDNA文庫(kù)中篩選目的克隆的最常用、最可靠的方法。根據(jù)靶蛋白純品的氨基酸序列，合成一組所有可能的簡(jiǎn)并寡核苷酸序列，其中至少有一條會(huì)與目的cDNA克隆完全配對(duì)。用它作為探針可篩選出目的cDNA克隆。 （2）、免疫法。在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，選用可使外源DNA表達(dá)的載體（如gt10和gt11等），文庫(kù)構(gòu)建后，可用靶蛋白的特異性抗體篩選目的cDNA克隆。 除構(gòu)建cDNA文庫(kù)外，對(duì)于一些高豐度表達(dá)、容易純化的蛋白質(zhì)，可以直接通過(guò)該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再洗脫下編碼該蛋白的特異mR

46、NA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因克隆，從而直接獲得該特定基因的克隆。,聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR）,PCR技術(shù)由Mullis于1985年創(chuàng)立，1987年獲得專(zhuān)利，1989年被美國(guó)著名Science雜志列為十項(xiàng)重大科技發(fā)明之首，1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。如今，PCR技術(shù)已成為分子克隆工作中必備的基本技術(shù)之一，并廣泛滲透到醫(yī)學(xué)分子基因診斷、法醫(yī)、考古學(xué)等諸多領(lǐng)域?？梢哉f(shuō)PCR技術(shù)發(fā)明給整個(gè)生命科學(xué)都帶來(lái)了一場(chǎng)革命，同時(shí)也為目的基因的快速克隆提供了一種有效的手段。,PCR基本原理 PCR技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)于試管中獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝

47、。它實(shí)際上是在欲擴(kuò)增的目的DNA的兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)正向和反向引物，在模板DNA以及四種脫氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的條件下由TaqDNA聚合酶所引導(dǎo)催化的DNA擴(kuò)增酶促反應(yīng)。 PCR由三個(gè)基本反應(yīng)組成： （1）高溫變性（denaturation）:通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA； （2）低溫退火（annealling）:使溫度下降，引物與模板DNA中所要擴(kuò)增的目的序列的兩側(cè)互補(bǔ)序列進(jìn)行配對(duì)結(jié)合； （3）適溫延伸（extension）：在TaqDNA聚合酶、4dNTP s及Mg2+存在下，引物3端向前延伸,合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的DNA鏈。以上變性、退火和延伸便

48、構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后（約25-30次循環(huán)），介于兩引物間的目的DNA片段便可擴(kuò)增105-107拷貝。,由此可知，我們可以利用目的基因兩側(cè)的核昔酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)和模板互補(bǔ)的引物，十分便捷地以基因組、或己克隆在某一載體中的基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增出所需的目的基因片段。如以真核生物總為模板則可獲得無(wú)內(nèi)含子及不帶調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)基因。此外，通過(guò)在引物的端添加額外的與模板不互補(bǔ)的所需序列，如限制性酶切位點(diǎn)、起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止密碼及終止子等，便可以將其引入目的基因中，從而方便進(jìn)行目的基因的克隆、表達(dá)與調(diào)控研究。,PCR反應(yīng)的影響因素 影響PCR反應(yīng)的因素

49、很多，概括起來(lái)主要有以下幾種： （1） 引物。它在整個(gè)PCR擴(kuò)增體系中占有十分重要的地位，為了提高擴(kuò)增效率和特異性，一般遵循下列原則：A、引物長(zhǎng)度以15-30核苷酸為宜，過(guò)短會(huì)使特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則成本增加，且也會(huì)降低特異性；B、堿基應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量應(yīng)在45-55%左右；C、引物內(nèi)部無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（發(fā)夾是指發(fā)夾柄至少有4個(gè)堿基，而發(fā)夾環(huán)至少有3個(gè)堿基）這種結(jié)構(gòu)尤其應(yīng)避免在引物3端出現(xiàn)。D、兩引物間應(yīng)避免出現(xiàn)二聚體，因?yàn)橐坏┏霈F(xiàn)二聚體，引物就不能很好地與模板結(jié)合（二聚體是指引物序列之間至少有5個(gè)以上的堿基互補(bǔ)配對(duì)），尤其在引物3端不應(yīng)有2個(gè)以上堿基互補(bǔ)；E、

50、引物3端最好選A，其次選G、C，而不要選T；F、引物5端可加上限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，以便擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切和克隆。,（2） 模板。單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）以及由RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA均可作為PCR模板。模板DNA可是線性分子也可是環(huán)狀分子，然而前者略?xún)?yōu)于后者。PCR對(duì)模板純度要求不嚴(yán)，樣品可以是粗提物，但不可混有任何DNA聚合酶抑制劑、核酸酶、蛋白酶及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。尿素、SDS、甲酰胺等也會(huì)嚴(yán)重影響PCR反應(yīng)效率。此外應(yīng)避免交叉污染。 （3） Mg2+濃度。TaqDNA聚合酶是一種Mg2+依賴(lài)酶，因此，反應(yīng)體系中必須有Mg2+存在，然而保持適當(dāng)?shù)腗g2+濃

51、度十分重要，因?yàn)镸g2+濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響引物與模板的結(jié)合、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的形成以及酶的活性與精確性。 （4） TaqDNA聚合酶。Taq酶的添加量必須適當(dāng),如過(guò)高會(huì)增加非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，而酶量過(guò)低則又會(huì)降低產(chǎn)物量。此外，為了保證產(chǎn)物的正確率，可以采用高保真酶如Pfu酶、High-fidelity Taq酶等。,（5） 溫度循環(huán)參數(shù)。 PCR涉及變性、退火、延伸三個(gè)不同溫度和時(shí)間，每步反應(yīng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免降低TaqDNA聚合酶活性。 變性溫度和時(shí)間一般為94和1分鐘,溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低TaqDNA聚合酶活性，破壞dNTP分子； 退火的溫度和時(shí)間取決于引物的堿

52、基組成、長(zhǎng)度、引物與模板的匹配程度以及引物的濃度, 典型的退火溫度和時(shí)間為50和1-1.5分鐘。 延伸的溫度一般為72，接近TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75。延伸時(shí)間與待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度有關(guān)，一般1Kb以?xún)?nèi)的片段，延伸時(shí)間為一分鐘，如擴(kuò)增片段更長(zhǎng)，則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。最后一次循環(huán)的延伸時(shí)間一般都再適當(dāng)延長(zhǎng)（7-10分鐘），以便所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物合成完全。 以上參數(shù)確定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA濃度。一般循環(huán)25-35次為宜，循環(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)使PCR產(chǎn)物嚴(yán)重出錯(cuò)，非特異性產(chǎn)物大大增加。,人工合成基因 自從1983年美國(guó)ABI公司研制的DNA自動(dòng)合成儀投放市場(chǎng)以來(lái)，通過(guò)化學(xué)合成寡核苷酸鏈獲

53、得某些真核生物小分子蛋白或多肽的編碼基因已成為一種重要的基因克隆手段。然而，由于DNA自動(dòng)合成儀只能合成單鏈的寡核苷酸鏈，如何才能獲得雙鏈的目的基因DNA呢？最簡(jiǎn)單的辦法就是首先利用化學(xué)合成法分別合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，然后讓這兩條鏈在適當(dāng)條件下退火，形成雙鏈。但是這種方法僅限于合成組裝較短的基因(60一80bp)，這是由于隨著寡核苷酸鏈合成長(zhǎng)度的增加，出錯(cuò)率也會(huì)增加，同時(shí)產(chǎn)物的得率也會(huì)下降。為了獲得較長(zhǎng)的雙鏈DNA，人們嘗試采用了多種人工基因組裝方法,一種方法是先將設(shè)計(jì)好目的基因進(jìn)行分段, 每一片段間設(shè)計(jì)成4-6個(gè)bp互補(bǔ)的粘性末端, 寡核苷酸鏈合成后先以T4多聚核苷酸激酶對(duì)其5端進(jìn)行磷酸

54、化, 彼此對(duì)應(yīng)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈退火后再以T4DNA連接酶連接,另一種方法是合成一套包括一系列具有重疊區(qū)域的短的(約40一100bp) 寡核苷酸鏈，在適當(dāng)條件下退火，這樣就得到了包括全長(zhǎng)基因、但每條單鏈上都有缺失的雙鏈DNA，然后再用E.coliDNA聚合酶補(bǔ)足缺失的片斷，并用T4DNA連接酶將它們之間的切口連接起來(lái)就得到了完整的目的基因。,重組子的構(gòu)建 目的基因必須與載體連接形成一種重組DNA分子，并轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞后才能實(shí)現(xiàn)目的基因的克隆與表達(dá)。根據(jù)目的基因片段的來(lái)源與類(lèi)型不同，可以采取不同的連接策略，目前應(yīng)用較多的連接方式大致分為三種：粘端連接，平端連接和T-A克隆。,粘端連接 粘端連接

55、是指目的基因與載體之間具有彼此互補(bǔ)的粘性末端，在較低的溫度下可以形成氫鍵，再通過(guò)T4DNA連接酶便可以連接成完整的重組DNA分子。 為了讓基因連接入載體之后保持正確的方向，因此連接時(shí)一般采取定向克隆的策略，即對(duì)基因和載體分別采用不同的限制性酶進(jìn)行切割，這樣載體就無(wú)法自連，且外源基因只能按照正確的方向插入載體才能形成重組DNA分子。 有時(shí)限于條件如果只能用一種限制酶對(duì)基因和載體進(jìn)行切割，為了防止載體自連酶切后可以先對(duì)載體進(jìn)行脫磷處理，即用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）或細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）對(duì)其進(jìn)行處理，脫除其5磷酸基團(tuán)，這樣并不影響其與目的基因的連接。 為了方便重組子的篩選，有時(shí)將外源基因插入載

56、體的某個(gè)選擇性標(biāo)記基因使其失活，這種策略稱(chēng)為插入滅活法。,平端連接 有時(shí)為了滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，必須進(jìn)行DNA的平齊末端之間進(jìn)行連接。這種連接方式的優(yōu)點(diǎn)是給不同分子之間的連接帶來(lái)了極大的方便，因?yàn)槌齼?nèi)切酶酶切直接產(chǎn)生的平齊末端分子外，粘性末端通過(guò)一定的修飾也能產(chǎn)生平齊末端。然而，與粘性末端相比，平齊末端的連接效率較低。因此，在進(jìn)行平齊末端連接時(shí)一般需加入更多的T4連接酶（一股為粘端連接的10-100倍）,同時(shí)適當(dāng)提高底物濃度。,TA克隆 TA克隆是一種直接將PCR基因產(chǎn)物進(jìn)行快速克隆的方法，這一方法省略了諸如用 Klenow 酶或T4多聚激酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行修飾的酶法修飾過(guò)程，大大提高了克隆效

57、率。其原理是，在PCR反應(yīng)過(guò)程中熱穩(wěn)定聚合酶（即Taq聚合酶）可以向PCR產(chǎn)物的3 末端加上一個(gè)不依賴(lài)于模板的腺苷酸（A）。利用這些末端突出的3 A，即可將PCR產(chǎn)物直接插入到插入位點(diǎn)只有一個(gè)3 T突出的線性T載體分子。這種方法只限于PCR產(chǎn)物的克隆，且必須采用3 T突出的T-載體（如 Promega公司的pGEM-T載體等）。,pMD18-T 由pUC18 載體改建而成，它消除了pUC18 載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，再在pUC18 載體的多克隆酶切位點(diǎn)處導(dǎo)入了EcoRV 酶切位點(diǎn)，使用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)時(shí)都有

58、在PCR 產(chǎn)物的3末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR 產(chǎn)物的連接、克隆效率。 本載體盡管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位點(diǎn)，但不影響 -半乳糖苷酶的正常表達(dá)，因此，PCR 產(chǎn)物克隆后仍可以利用 -互補(bǔ)性進(jìn)行藍(lán)白菌落的篩選，挑選陽(yáng)性克隆。 由于本載體上消除了多克隆酶切位點(diǎn)，克隆后的PCR 產(chǎn)物將無(wú)法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR 擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA 酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T 載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。 由于本載體以pUC18 載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，

59、所以它具有同pUC18 載體相同的功能。,基因?qū)爰夹g(shù) 重組分子必須導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)不同的轉(zhuǎn)移對(duì)象與宿主類(lèi)型，目前已發(fā)展出許多種轉(zhuǎn)移方法，下面主要介紹一些常見(jiàn)的和有代表性的方法。,基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 轉(zhuǎn)化(transformation）是指微生物細(xì)胞直接吸收外源的過(guò)程，而通過(guò)轉(zhuǎn)化接受了外源DNA的細(xì)胞稱(chēng)為轉(zhuǎn)化子。在分子克隆中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感細(xì)胞才能用于轉(zhuǎn)化，這時(shí)的細(xì)胞稱(chēng)為人工感受態(tài)細(xì)胞。Cohn（1972）證實(shí)，將細(xì)菌處于0的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球型（感受態(tài)），經(jīng)短時(shí)間熱沖擊后，細(xì)胞可吸收外源DNA，在豐富培養(yǎng)基上

60、生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原，并分裂增殖。在選擇性平板上即可選出轉(zhuǎn)化子。Ca2處理的感受態(tài)細(xì)胞，般每微克DNA可獲得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。此外，還發(fā)展出氯化鈣氯化蜘法、氯化鈣氯化錳法、氯化鎂法等。 除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還可采用高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌。,轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)染作用 入噬菌體載體所構(gòu)建的重組DNA分子可以直接感染進(jìn)入E.coli寄主細(xì)胞內(nèi)，這叫轉(zhuǎn)染（transfection）,但轉(zhuǎn)移效率很低，難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。為了提高轉(zhuǎn)移效率，重組的入噬菌體DNA或重組的粘粒DNA必須包裝成完整的噬菌體顆粒，通過(guò)溫和噬菌體顆粒的釋放和感染將重組

61、DNA轉(zhuǎn)移至宿主內(nèi)，這稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction），而通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)接受外源DNA的細(xì)胞則稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。所謂溫和噬菌體是指既能進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)周期，又能進(jìn)入溶源生長(zhǎng)周期的噬菌體，而烈性噬菌體是指只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體。,基因?qū)雱?dòng)植物細(xì)胞 隨著高等動(dòng)植物細(xì)胞基因工程的發(fā)展，人們發(fā)明了多種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，根據(jù)原理不同，主要可分為物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法三大類(lèi),顯微注射 顯微注射技術(shù)是利用顯微操作儀(micromanipulator)通過(guò)顯微操作將外源基因直接注入細(xì)胞核內(nèi)的一項(xiàng)技術(shù)，它常用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。注射時(shí)首先用口徑約100m的細(xì)玻璃管吸住受精卵細(xì)胞，然后再用口徑為12m的細(xì)玻璃針刺入細(xì)

62、胞核將DNA注入。 基因槍 基因槍(gene gun)技術(shù)是將外表附著有DNA的、高速運(yùn)動(dòng)的微小金屬顆粒射向靶細(xì)胞，金屬顆粒穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，同時(shí)將DNA分子引入受體細(xì)胞，這種顆粒直徑為0.20.4m，由鎢或金制成?；驑尲夹g(shù)可應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞、真菌，尤其是植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。它可以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的懸浮細(xì)胞、愈傷組織、未成熟胚、甚至是未成熟的花序。,電穿孔 電穿孔(electroporation)是指在高壓電脈沖的作用下使細(xì)胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞，外界環(huán)境中的DNA穿孔而入進(jìn)入細(xì)胞最終進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部的方法。該方法既適合于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞也適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，既可用于瞬時(shí)表達(dá)也可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對(duì)于不同的

63、細(xì)胞需要采用不同的電擊電壓和電擊時(shí)間。 磷酸鈣共沉淀法 磷酸鈣共沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）是通過(guò)使DNA形成DNA-磷酸鈣沉淀復(fù)合物，然后粘附到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，從而迅速被細(xì)胞所捕獲的方法?；具^(guò)程是將溶解的DNA加在Na2HPO4溶液內(nèi)，再逐漸加入CaCl2溶液，當(dāng)Na2HPO4與CaCl2形成磷酸鈣沉淀時(shí)，DNA被包裹在沉淀之中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)該沉淀物與細(xì)胞表面接觸時(shí)，細(xì)胞則通過(guò)吞噬作用將DNA攝入其中。該法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，且可以進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，即將不含選擇標(biāo)記的DNA和含選擇標(biāo)記的DNA放在一起形成混合的共沉淀物，一

64、起導(dǎo)人細(xì)胞；其不足在于不太適用于懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。,脂質(zhì)體法 通過(guò)脂質(zhì)體（lioposome）包裹DNA并將其載入細(xì)胞的方法，具有方法簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。目前市場(chǎng)上已有多種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑出售。這些試劑都是基于合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)形成一薄層脂質(zhì)體，它與DNA形成復(fù)合物，這些復(fù)合物迅速被細(xì)胞吸收。應(yīng)用這種方法，已成功地將外源DNA在多種不同的細(xì)胞中進(jìn)行了有效表達(dá)。 二乙胺乙基葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù) 二乙胺乙基葡聚糖 (DEAE-Dextran)是一種高分子量的多聚陰離子試劑，它能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA，但其機(jī)理還不清楚，可能是由于葡聚糖與DNA形成復(fù)合物而抑制了核酸酶對(duì)DNA的作用，也

65、可能是葡聚糖與細(xì)胞結(jié)合而引發(fā)了細(xì)胞的內(nèi)吞作用。它與磷酸鈣共沉淀法比較有3點(diǎn)不同:它一般用于克隆基因的瞬時(shí)表達(dá)，不易形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；由于它對(duì)細(xì)胞有毒性作用，造成有些細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率很高，而其它細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率則不理想；DEAE-Dextran可用于轉(zhuǎn)染小量DNA。,反轉(zhuǎn)錄病毒感染 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）感染可以將基因轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞核基因組中，它是各種基因轉(zhuǎn)移方法中最有效的方法之一，具有轉(zhuǎn)移率高、感染率高和高度整合的特點(diǎn)，尤其適用于處于多細(xì)胞發(fā)育階段的胚胎。但反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA（10kb），因此，轉(zhuǎn)入的基因很容易缺少其相鄰的調(diào)控序列。 原生質(zhì)體融合法

66、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，首先需要用酶將其去除后制得原生質(zhì)體，然后再將外源基因與原生質(zhì)體混合，在PEG作用下經(jīng)短暫的共培養(yǎng)，即可將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。1982年，Kren首次應(yīng)用該法將一段T-DNA轉(zhuǎn)入煙草原生質(zhì)體中，并獲得轉(zhuǎn)化植株。至此，在PEG作用下已實(shí)現(xiàn)多種植物細(xì)胞原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。,陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定 當(dāng)重組DNA分子通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等手段導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，必須從大量的宿主細(xì)胞群體中篩選出我們所需要的陽(yáng)性重組子，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定與分析。為了提高篩選效率，減輕工作量，降低成本，建立一個(gè)好的篩選模型十分重要。因此，在進(jìn)行基因克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)首先必須考慮重組子的篩選方案，根據(jù)目的基因的特性，選擇合適的載體與宿主細(xì)胞。重組子的