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《核酸和蛋白質(zhì)技術(shù)》PPT課件.ppt

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核酸和蛋白質(zhì)技術(shù) 蛋白質(zhì)ppt課件.ppt 技術(shù)課件.ppt 核酸和蛋白質(zhì) 課件.ppt PPT課件.ppt 核酸與蛋白質(zhì)
資源描述:
核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù),第一節(jié) 核酸分析技術(shù),講述內(nèi)容: 1、核酸電泳 2、雜交技術(shù) 3、PCR技術(shù) 4、基因芯片,一、核 酸 電 泳,(一)DNA的凝膠電泳 凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于2001000bp的片段; 操作簡單、快速,且分離范圍廣,分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5500bp的片段; 效果好、分辨率極高,相差1bp的DNA片斷就能分開,能容納相對大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析,瓊脂糖凝膠電泳的基本過程,材料:電泳緩沖液(常用TAE或TBE)、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液(核酸顯示劑)、加樣緩沖液(保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時間的指示系統(tǒng))、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 基本過程:制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 注意:溴化乙錠具有致癌性,操作時要帶手套,不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍,瓊脂糖濃度(,W/ V ) DNA分子的有效分離范圍(kb),0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2,影響DNA在凝膠中遷移速率的因素:,1 DNA分子的大小 2 構(gòu)象 3 凝膠濃度 4 電壓 5 緩沖液,瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中 DNA Ladder的形成,PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳,聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析,特殊的凝膠電泳,倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE):用于分離分子量102000kb的DNA分子; 鉗位均勻電場電泳(CHEF電泳):可分離大于107bp的DNA分子,基本過程同DNA電泳一樣,但應(yīng)明確一點(diǎn)的是,因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感,因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液,所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解;另外,因為RNA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果,因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行,常用的變性劑為甲醛和戊二醛。,(二)RNA 電 泳,二 核酸雜交技術(shù),(一)Southern Blot 原理:,將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上,固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列,則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合,游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測,從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 用途:檢測樣品中的DNA及其含量,了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。,Southern Blot 操作步驟:,DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交(變性探針) 洗膜 放射自顯影或顯色,原理:在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。 用途:檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)及其含量。,(二)Northern Blot,操作過程,mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交(變性探針) 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光,(三)探針標(biāo)記技術(shù),1 標(biāo)記物:放射性和非放射性兩種 放射性: 非放射性:生物素、地高辛素、熒光素 2、標(biāo)記方法 (1)切口平移法 (2)隨機(jī)引物法 (3)末端標(biāo)記法 (4)單鏈DNA探針標(biāo)記 (5)寡核苷酸探針標(biāo)記法,32P、35S和3H,三 PCR技術(shù),PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物,通過加溫變性退火DNA合成這一周期的多次循環(huán),使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的,經(jīng)2530個循環(huán)后,擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。 Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明,獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎;,目的: 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。,(一)原理: 雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA 變性 與一對寡核苷酸引物(5, 3)降低溫度退火 DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合,形象地稱為退火 適溫延伸5/3引物形成新鏈變成4條鏈DNA 延伸 第二輪:變性退火延伸 呈指數(shù)增長 理論值:一輪一倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109 理論 模板擴(kuò)增30輪 1ng-1g 實(shí)際 模板擴(kuò)增30輪 1ng-10g,1 Taq DNA聚合酶: 水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 53DNA聚合酶活性; 無35外切酶活性, 35輪0.25%錯配,與原始模板有差別; 最適聚合酶 溫度72,選擇72延伸 半衰期:92.5 130min 95 40min 97.5 56min 變性溫度:95使其在整個擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性,(二)基本要素,pfu DNA 聚合酶,耐熱 53DNA聚合酶活性 35外切酶活性 精確度:pfu Taq 但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差 文獻(xiàn)報道:Taq+pfu 會起到較好效果,2 .引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60, Tm值要相近,每條10-50pmol /100l 設(shè)計原則: (1)靠近5上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同 3下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ),與負(fù)鏈相同 正鏈5 3 上游Primer 下游Primer 負(fù)鏈 3 5 例如: IL-3正鏈 5GCTCCATGACCCAG- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3 負(fù)鏈3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游: 與其相同 下游: 先寫出相應(yīng)負(fù)鏈35然后倒過來53 所以負(fù)鏈Primer:5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3,(2)Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列 形成loop環(huán),內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 如: GGGTCGATTCCTACCCATGC (3)注意減少Primer間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致2個Primer形成dimer 一般不要超過3個互補(bǔ)bp 如:CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC,修飾 如:32P、生物素、熒光素,不影響其效果 突變: AGCTCCATGACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 注意:絕不可以在3端進(jìn)行上述改造 DNA聚合酶是53聚合,若3端改造不能互補(bǔ)不能延伸,(4)Primer 5未端可修飾、突變:,(5)primer 5端增加堿基 內(nèi)切酶識別點(diǎn): (G)GAATTC GCTCCATGACCCAG 保護(hù)bp 對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處 便于內(nèi)切酶消化,不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 Hind 3 BamHI 2-3 PstI 4 XhoI 4 NotI 10 如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適影響內(nèi)切酶消化影響下步克隆 未切開,連接不上,ATG起始密碼 TAA、TAG、TGA終止密碼 如: 可溶性受體的表達(dá),無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū),只有膜外區(qū)。,3.模板: 可選:DNA mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA DNA包括: 質(zhì)粒 噬菌體 染色體DNA 較小 較大 目的gene是單拷貝 變性較易 變性較難 非常大,變性難 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意: 防止交叉污染,4.dNTP: 四種脫氧核苷酸,基本原料 終濃度:50M 注意:不穩(wěn)定,保存時間長會失效,5.Mg2+ TaqDNA聚合酶作用時需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq:較少,Mg2+ 對反應(yīng)影響很大,0.5-1.5mM終濃度 pfu:Mg2+ 2-3mM,dNTP、primer用量約增加一倍 外界影響: EDTA鰲合Mg2+ 選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA); DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+ 結(jié)合, 降低Mg2+ 有效濃度。 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想,要注意調(diào)整合適的 Mg2+濃度,(1)變性溫度:94-95 Templete:GC比例高、長度很長,則變性T (2)退火:溫度越高,擴(kuò)增特異性越好 取決于Tm值:Tm退火T; Tm退火T 若Tm較高,可使退火和延伸在同一溫度 (3)延伸: 500nt-1min 500nt3min 一般:4060sec,6.溫度和時間:,(三)PCR技術(shù)的應(yīng)用,1. 基因檢測: 2. 基因克隆化 3. DNA突變 4. DNA序列分析,四、基因芯片,利用核酸雜交的原理,應(yīng)用于DNA、RNA的研究,操作流程,(1)探針的設(shè)計、合成與芯片的制作(商品化產(chǎn)品); (2)靶基因樣品的制備; 靶基因的制備:RT-PCR (設(shè)實(shí)驗組和對照組) 標(biāo)記方法:分別進(jìn)行熒光素標(biāo)記如:Cy3和Cy5 (3)生化雜交反應(yīng);與常規(guī)的分子雜交過程基本相似 封閉 預(yù)雜交 雜交 洗脫 (4)雜交信號的檢測與結(jié)果的分析 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號,計算機(jī)分析,基因芯片的應(yīng)用,用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究 舉例:美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段,制成芯片,然后與熱處理的T淋巴細(xì)胞和未處理的T細(xì)胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交,經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析,共發(fā)現(xiàn)17個差異表達(dá)的基因,其中11個是被熱誘導(dǎo)的,6個是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實(shí),其中3個是未報導(dǎo)的新基因。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析技術(shù),講述內(nèi)容: 一、Western Blot 二、ELISA 三、免疫熒光技術(shù) 四、免疫組織化學(xué)技術(shù) 五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),一 Western Blot,1 原理: 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上,然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng),洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后,加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體,反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體,加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等,觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn),也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。,2 操作過程,SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜(PVDF或硝酸纖維素膜) 封閉 一抗 洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng) 洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影,Hours 0 4 8 16,Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control,0h 4h 8h 16h,Western Blot analysis of cytochrome C release.,Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10M gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.,Cyto-C,X-Protein,3 注意的問題,(1) 蛋白質(zhì)電泳 常用SDS-PAGE:單一亞基組成的蛋白質(zhì) 非變性PAGE:多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) Tris-Tricine膠中電泳:用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳,能夠獲得較好的分離效果。,聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時要戴手套,(2)轉(zhuǎn)膜,戴手套,避免用手接觸濾紙、凝膠和膜,因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜1530min,如果是PVDF膜,必須先用甲醇激活后浸泡。 方向正確:凝膠在陰極,膜在陽極 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。 電轉(zhuǎn)時間:100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇 轉(zhuǎn)移結(jié)束后,凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置,(3)封閉,用5脫脂奶粉或3BSA (含0.1Tween20 TBS或PBS配制) 時間:室溫2h或4C過夜,(4)顯色或顯影,顯色 辣根過氧化物酶:底物為DAB 堿性磷酸酶:底物為BCIP/NBT 化學(xué)發(fā)光顯影 最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物(商品化產(chǎn)品) 注意:化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次 曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實(shí)際情況而定,(5)膜的再利用,化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后(洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME ) 用不同的一抗進(jìn)行雜交,檢測其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用34次。 堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交,1 原理: ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度(pg-ng/ml水平),并且重復(fù)性好。,二、ELISA,ELISA 常用的酶和底物,辣根過氧化物酶,底物為OPD, 深桔黃色 ,檢測波長492nm TMB, 藍(lán)綠色,檢測波長450nm 堿性磷酸酶,底物為PNPP(對消基苯磷酸酯), 黃色 檢測波長405nm ELISA各步驟的反應(yīng)時間 包被:2436h,蛋白濃度為15ug/ml 封閉:37C 2h 或4C過夜(3BSA) 樣本反應(yīng)時間:37C 45min-1h 酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間: 37C 45min-1h 顯色時間:15min(避光) 設(shè)對照 可以一次包被多塊板,凍存?zhèn)溆?2 類型,(1)間接法測抗體,間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗 抗 體,檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。 常用于臨床血清中自身抗體的檢測,以及雜交瘤上清特異性 抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。,方法: 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標(biāo)二抗 洗滌 顯色反應(yīng) 終止反應(yīng) ELISA Reader檢測 OD值,(2) 雙抗體夾心法測抗原,是檢測抗原最常用的方法。 只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 常用的組合:單克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體 后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個抗原決定簇,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 用途:測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用 于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成 兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。,雙抗體夾心法測抗原的方法: 捕獲抗體包被 封閉(3BSA) 待測抗原 洗滌(含0.1Tween的PBS) 酶標(biāo)單抗或多抗 洗滌 顯色 檢測,(3)競爭法測抗原,1)抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,可以采用競爭法模式。 其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,最后的顯色也愈淺。 方法:抗體包被 封閉 同時加入待測抗原和酶標(biāo)抗原 洗滌 酶底物 顯色 ELISA reader檢測,2)抗原固相測抗原,其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多,結(jié)合在固相上的抗體愈少,最后的顯色也愈淺。 方法: a: 抗原包被96孔板; b:封閉; c: 待測抗原與抗體反應(yīng)一定時間; d: 加入96孔板 e: 洗滌 f:加入酶標(biāo)二抗 g:洗滌 h:顯色和檢測,如臨床血清樣本的檢測以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測,(4)IgM抗體的檢測,1)間接法: 間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體,因標(biāo)本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體,后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上,將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此,如果用抗IgM作為二抗,間接測定IgM抗體,必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的干擾。,方法,a: 抗原包被96孔酶標(biāo)板; b:封閉; c: 待測血清與A蛋白反應(yīng)一定時間后離心 d: 吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板 e: 洗滌 f:加入酶標(biāo)抗IgM的抗體 g:洗滌 h:顯色和檢測,2)捕獲包被法(夾心法) 先用抗人IgM抗體包被ELISA板,以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(包括針對抗原特異性的IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應(yīng)抗原,繼而加入針對抗原特異的酶標(biāo)抗體,再與底物作用,顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。 方法:,a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板; b:封閉; c: 加入待測血清; d: 洗滌96孔酶標(biāo)板 e: 加入相應(yīng)抗原 f:加入抗原特異的酶標(biāo)抗體 g:洗滌 h:顯色和檢測,(5) ABS-ELISA技術(shù) (Avidin Biotin system-ELISA,原理 親和素是一種分子量是60,000的堿性蛋白,由四個相同亞基組成,每個亞基有一個生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián),又可被酶類等多種材料所標(biāo)記,成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個親和素,后者再與酶結(jié)合,加入底物后,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。,操作過程: 抗原包被 封閉 待檢標(biāo)本 生物素化抗體 洗滌 酶標(biāo)記親和素 洗滌 加底物顯色和檢測,三 免疫熒光技術(shù),利用某些熒光素,如FITC、R-PE等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針,然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合,形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光,因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測未知抗原或相應(yīng)配體。,(一)細(xì)胞膜蛋白分子的檢測,原理: 細(xì)胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應(yīng)的抗體或配體結(jié)合,將針對細(xì)胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標(biāo)記,根據(jù)不同熒光物質(zhì)的最大激發(fā)和發(fā)射波長的不同,即可準(zhǔn)確定量每種熒光物質(zhì)的強(qiáng)度,從而推出相應(yīng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量,1 直接法:細(xì)胞熒光素標(biāo)記的抗CD分子的抗體 4C反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計分析。 2 間接法:細(xì)胞抗CD分子的抗體 4C 反應(yīng)30-60min 熒光素標(biāo)記的二抗 4C 反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計分析,懸浮細(xì)胞:用PBS洗二次后再做染色 貼壁細(xì)胞:先用胰酶消化成懸浮細(xì)胞再染色,1 細(xì)胞膜CD分子的檢測,2 Annexin V檢測技術(shù) (檢測細(xì)胞凋亡的一個常規(guī)指標(biāo)),磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。,原理,樣本處理和染色方法,1 懸浮細(xì)胞的染色:將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞(0.51106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室溫避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反應(yīng)5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(一般不超過1h), 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。 2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。 3 爬片細(xì)胞染色:同上,最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。,(二)細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測等。,操作過程: (1)直接法: 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和 滲透化 封閉 熒光素標(biāo)記的 抗體 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計分析 (2)間接法: 細(xì)胞 3多聚甲醛固定和滲透化 封閉 針對蛋白的特異 抗體 洗滌 熒光素標(biāo)記的二抗 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計分析,凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析,TFAR19(PDCD5)是由本研究室在國際上首先報導(dǎo)的一個擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因,前期的功能研究表明,它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素(FITC)標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針,對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時我們發(fā)現(xiàn),凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細(xì)胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明,凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義,不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件,提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。,1 懸浮細(xì)胞的染色: (1)收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞(0.51106),PBS洗2次, (2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm10min。 (3)加入PBS-T溶液,37C孵育15min,PBS洗2次, (4)加入200ml胎牛血清,室溫反應(yīng)30min。 (5)加入 FITC標(biāo)記的TFAR19單抗,4C反應(yīng)30min (6)熒光細(xì)胞洗液洗2次,熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時用流式細(xì)胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。 2:貼壁細(xì)胞的原位染色 (1) 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中(內(nèi)有潔凈蓋玻片),讓其爬片生長,待長到50%80%滿時,凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。 (2) 將不同時間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,染色步驟同上。 (3) 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油(5ul)的載玻片上,熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。,原理: 是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng),對相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量測定的一項技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙的結(jié)合起來,借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等)的顯像和放大作用,在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等),并可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。,四免疫組織化學(xué)技術(shù),免疫組化染色技術(shù)的分類,免疫熒光法(Immunofluorescence technique) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique) 免疫金銀法(Immunogold technique) ABC法( Avidin-Biotin Complex),五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),1 GST融合蛋白進(jìn)行Pulldow實(shí)驗,(1)原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白主要用于蛋白的親和純化,也可以將GST融合蛋白作為探針,與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合,然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前,或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用時,可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。 兩種應(yīng)用: 1)確定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間的新的相互作用 2)證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用,(2)方法:,1) GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育(a, 單一明確的重組蛋白;b,細(xì)胞裂解蛋白混合液;c, 體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白) 2)混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4C 2h 3)離心棄上清 4)沉淀加入2 蛋白Loading Buffer煮沸,離心 5)取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 6)考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶,進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白;電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 該實(shí)驗設(shè)立GST對照,反應(yīng)均在4C進(jìn)行,GST-Pulldown Assay,2 免疫共沉淀,(1)原理 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時,完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔 缺點(diǎn):可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用,免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)的原理和常見問題,(2)方法,1) 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞(11071108)冷PBS洗滌2次 2)細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,冰浴30min 3) 12000rpm 離心 30min 4)收集上清并加入適量抗體,4C搖動1h 5)加入ProteinG-Sepharose懸液, 4C搖動1h 6)細(xì)胞裂解液洗滌ProteinG-Sepharose混合液 7)離心棄上清 8)沉淀加2蛋白Loading Buffer煮沸510min 9)離心,上清液跑SDS-PAGE 膠 10)考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析,(3)注意的問題,1)細(xì)胞裂解 采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過經(jīng)驗確定。 不能用高濃度的變性劑(0.2SDS),細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。 2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用 3)使用對照抗體: 單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體:正常兔IgG,(1)原理: 將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個雜交體,將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個雜交體,當(dāng)兩個雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞(此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報告基因),若X和Y沒有相互作用,則單獨(dú)不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄;若X和Y可相互作用,則使BD和AD靠近形成一個有效的轉(zhuǎn)錄激活子,激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。,3 酵母雙雜交系統(tǒng),雙雜交系統(tǒng)的原理,LacZ,Gal4激活域,Gal4結(jié)合域,Gal4結(jié)合域,LacZ,LacZ,Gal4激活域,LacZ,Gal4激活域,Gal4結(jié)合域,X,Y,X,Y,1)已知蛋白之間相互作用的檢測: 2)蛋白質(zhì)的功能域研究:通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變,再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用,可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸; 3)克隆新基因和新蛋白:將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒,將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫,共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列,并推測其蛋白質(zhì)序列。,用途,4 蛋白質(zhì)芯片,其制作原理類似于基因芯片,所不同的是,蛋白、多肽芯片所用的樣品是提純的蛋白、多肽。其檢測的原理類似于抗原、抗體檢測的ELISA法。如采用雙抗夾心的形式,可通過機(jī)械點(diǎn)涂的方法,將多種不同的單克隆抗體點(diǎn)樣固定在固相介質(zhì)表面,如PVDF膜上,制備成抗體蛋白芯片,與制備的多種抗原樣本雜交、結(jié)合,芯片上的抗體捕獲相應(yīng)的抗原,然后再與標(biāo)記的多種不同的抗體雜交,由于抗原具有多價結(jié)合表位而結(jié)合標(biāo)記抗體,根據(jù)雜交信號的有無、多少而進(jìn)行定性、定量的分析。,
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