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第33講 微生物的利用 考綱要求　1.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離(加試)。2.分離以尿素為氮源的微生物(加試)。 考點(diǎn)一　微生物的培養(yǎng)和分離 1．大腸桿菌 (1)特性：大腸桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧(代謝類型)的腸道桿菌，在腸道中一般對(duì)人無(wú)害，但若進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。 (2)用途：是基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具。 2．細(xì)菌的培養(yǎng)和分離 (1)細(xì)菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20 min分裂一次。 (2)培養(yǎng)的方法：需要將已有細(xì)菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，一般用接種環(huán)(工具)轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。 (3)細(xì)菌分離的方法與特點(diǎn) 分離方法 特點(diǎn) 劃線分離法 操作簡(jiǎn)單 涂布分離法 操作復(fù)雜，單菌落更易分開(kāi) 3.消毒和滅菌的區(qū)別 項(xiàng)目 條件 結(jié)果 常用的方法 消毒 較為溫和的物理或化學(xué)方法 僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法 滅菌 強(qiáng)烈的理化因素 殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌 4.大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn) (1)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：將大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)和劃線分離，即用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后再在LB固體平面培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行分離，隨后培養(yǎng)基上就會(huì)形成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的菌落。 (2)實(shí)驗(yàn)步驟 培養(yǎng)基滅菌 ↓ 倒平板 ↓ 接種 ↓ 劃線分離 ↓ 培養(yǎng)觀察 50 mL LB液體培養(yǎng)基和50 mL LB固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌 將培養(yǎng)基分別倒至4個(gè)滅菌后的培養(yǎng)皿中，水平放置，使之形成平面 在裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種大腸桿菌，培養(yǎng)12 h 用接種環(huán)在接種有大腸桿菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，蓋好培養(yǎng)皿 培養(yǎng)皿倒置(蓋在下面)，放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h后，可看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落 (3)大腸桿菌分離的用途：?jiǎn)尉涞姆蛛x是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。 5．微生物接種的兩種常用方法比較 比較 劃線分離法 涂布分離法 工具 接種環(huán) 玻璃刮刀 原理 通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞群體，即菌落 將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落 特點(diǎn) 方法簡(jiǎn)單，但不適宜計(jì)數(shù) 單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜些 目的 使培養(yǎng)基上形成單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體——菌落 思考診斷 1．連線無(wú)菌技術(shù)的方法、類型及對(duì)象 2．觀察甲、乙、丙、丁四幅圖，熟悉倒平板的操作流程，請(qǐng)?zhí)羁眨? (1)請(qǐng)用文字和箭頭寫(xiě)出正確的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。 (2)甲、乙、丙中的滅菌方法是灼燒滅菌。 (3)丁中的操作需要等待平板冷卻凝固才能進(jìn)行。 3．下圖中甲為劃線分離法中最重要的環(huán)節(jié)，乙為操作的結(jié)果： (1)每一次劃線后都要將接種環(huán)灼燒(　√　) (2)除第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)都是第一次劃線的末端(　　) 提示　平板劃線時(shí)除第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)都是上一次劃線的末端，而不是第一次。 4．如圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖，請(qǐng)思考： (1)獲得圖A效果和B效果的接種方法分別是什么？ 提示　獲得效果A的接種方法為涂布分離法，獲得效果B的接種方法為劃線分離法。 (2)某同學(xué)在純化土壤中的細(xì)菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應(yīng)當(dāng)怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？ 提示　最可能的原因是菌液濃度過(guò)高或劃線時(shí)在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數(shù)或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌。 1．下圖為“大腸桿菌的培養(yǎng)和分離”實(shí)驗(yàn)的基本流程，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： ―→―→―→ ―→ (1)A過(guò)程配制的是通用細(xì)菌培養(yǎng)基，稱為_(kāi)_______培養(yǎng)基。配制時(shí)除了加入特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外，還要加入一定量的氯化鈉，以維持______________。對(duì)培養(yǎng)基酸堿度的調(diào)節(jié)，應(yīng)該在B過(guò)程的______(填“前面”或“后面”)。 (2)D過(guò)程與C過(guò)程相比，培養(yǎng)基中增加的物質(zhì)是________________，E過(guò)程所需的溫度是________。 (3)D過(guò)程后，一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)______________，這種分離方法是____________的通用方法，也是篩選特定菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。 (4)植物組織培養(yǎng)時(shí)，先配制MS培養(yǎng)基，再加入一定比例的植物激素，當(dāng)生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí)，可促進(jìn)________________________________________________________________________。 (5)植物組織培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)都需要無(wú)菌操作，下列不適宜用高壓蒸汽滅菌的是(　　) A．接種環(huán)和鑷子 B．三角瓶和廣口瓶 C．發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基 D．用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽 答案　(1)LB液體　滲透壓　前面　(2)瓊脂　4 ℃　(3)(單)菌落　消除污染雜菌(或純化菌種)　(4)生根　(5)D 解析　(1)LB液體培養(yǎng)基是通用的細(xì)菌培養(yǎng)基，LB固體平面培養(yǎng)基則用于劃線分離形成單菌落。氯化鈉的作用是維持培養(yǎng)基的滲透壓。調(diào)節(jié)好酸堿度后才能進(jìn)行滅菌，若滅菌后再進(jìn)行酸堿度調(diào)節(jié)，又會(huì)產(chǎn)生新的污染。(2)在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入一定量的瓊脂可形成固體培養(yǎng)基。菌種應(yīng)置于4 C冰箱中保存。(3)通過(guò)劃線分離后，一個(gè)菌體就會(huì)繁殖出一個(gè)菌落。(4)植物組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)素相對(duì)較多時(shí)，有利于生根，而細(xì)胞分裂素相對(duì)較多時(shí)，則有利于生芽。(5)高壓蒸汽滅菌常用于培養(yǎng)基、培養(yǎng)器材等的滅菌，而用于培養(yǎng)的幼莖和幼芽則不能進(jìn)行任何滅菌操作，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 2．檢驗(yàn)飲用水的細(xì)菌含量是有效監(jiān)控疾病發(fā)生的必要措施。請(qǐng)回答下列與檢驗(yàn)飲用水有關(guān)的問(wèn)題： (1)要測(cè)定飲用水中大腸桿菌的數(shù)量，常采用________法，通常將水樣進(jìn)行一系列的梯度________________，然后將上述的水樣用玻璃刮刀分別涂布到______________的表面進(jìn)行培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)量。用該方法統(tǒng)計(jì)樣本菌落數(shù)時(shí)____________(填“是”或“否”)需要對(duì)照組。原因是_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)下面所示的四種菌落分布圖中，不可能由上述方法得到的是________。 (3)大腸桿菌的培養(yǎng)條件是無(wú)菌，培養(yǎng)基配制時(shí)需加入氯化鈉，以維持________________。配制培養(yǎng)基時(shí)先________后________。 A．調(diào)節(jié)pH B. 滅菌 C．消毒 D．調(diào)節(jié)溫度 答案　(1)涂布分離　稀釋　LB固體培養(yǎng)基　是　需要判斷培養(yǎng)基使用之前是否被雜菌污染(培養(yǎng)基滅菌是否合格)　(2)D　(3)滲透壓　A　B 3．請(qǐng)回答微生物培養(yǎng)和分離的有關(guān)問(wèn)題： (1)欲從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌：以________為唯一氮源且加入了________指示劑的培養(yǎng)基，用______________法分離細(xì)菌。若培養(yǎng)基平板上有菌落存活且顏色變________，則說(shuō)明分離成功。 (2)分離以尿素為氮源的細(xì)菌和分離大腸桿菌都使用了LB培養(yǎng)基，其成分________________。 A．前者含瓊脂，后者不含瓊脂和瓊脂糖 B．兩者都含有瓊脂 C．前者含有瓊脂糖，后者不含瓊脂糖但含瓊脂 D．兩者都不含瓊脂和瓊脂糖 答案　(1)尿素　酚紅　涂布分離(或涂布)　紅　(2)C 解析　(1)分離能利用尿素的細(xì)菌，只需以尿素為唯一氮源，加酚紅指示劑，采用涂布分離法分離細(xì)菌，只要培養(yǎng)基中的指示劑變紅，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的反應(yīng)，證明菌株可以以尿素為氮源。(2)分離以尿素為氮源的細(xì)菌所用培養(yǎng)基應(yīng)含有瓊脂糖，而分離大腸桿菌所用培養(yǎng)基則不含瓊脂糖而含瓊脂。 考點(diǎn)二　分離以尿素為氮源的微生物 1．菌種特點(diǎn) 含有脲酶，可以通過(guò)降解尿素作為其生長(zhǎng)的氮源。 2．培養(yǎng)基 用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為對(duì)照。 3．實(shí)驗(yàn)原理 (1)篩選以尿素為氮源的微生物，可使用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)選擇。 (2)細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚紅指示劑變紅。 4．實(shí)驗(yàn)步驟 制備培養(yǎng)基：將已滅菌的LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基分別倒入兩個(gè)培養(yǎng)皿中，搖勻，平放至凝固 ↓ 制備細(xì)菌懸液：用1 g土樣配制不同濃度的細(xì)菌懸液 ↓ 用涂布分離法分離細(xì)菌：將不同濃度的土壤稀釋液分別加到有LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用玻璃刮刀涂布到整個(gè)平面上 ↓ 培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h ↓ 　觀察：培養(yǎng)基中菌落數(shù)量 5．反應(yīng)的鑒定 在配制培養(yǎng)基時(shí)，加入指示劑酚紅，培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌將尿素分解并產(chǎn)生堿性的氨，使培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)紅色的環(huán)帶。 思考診斷 1．分析下表所示培養(yǎng)基的配方，回答下列問(wèn)題。 成分 含量 成分 含量 KH2PO4 1.4 g 葡萄糖 10.0 g Na2HPO4 2.1 g 尿素 1.0 g MgSO47H2O 0.2 g 瓊脂糖 15.0 g 將上述物質(zhì)溶解后，用自來(lái)水定容到1 000 mL (1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的物質(zhì)是葡萄糖，提供氮源的物質(zhì)是尿素。 (2)該培養(yǎng)基是(填“是”或“否”)具有選擇作用，因?yàn)橹挥心芊纸饽蛩氐奈⑸锊拍苌L(zhǎng)。 2．如圖為分離以尿素為氮源的微生物的實(shí)驗(yàn)，思考回答問(wèn)題。 (1)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘褂煤心蛩氐呐囵B(yǎng)基分離能產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌；使用酚紅作為指示劑，由顏色變化檢測(cè)知酶所催化的反應(yīng)，相關(guān)的反應(yīng)式為(NH2)2C＝O＋H2O2NH3＋CO2。 (2)制備尿素固體培養(yǎng)基過(guò)程中采用的滅菌方法有高壓蒸汽滅菌法、G6玻璃漏斗過(guò)濾法。 (3)從上圖所示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可判斷出細(xì)菌懸液C的稀釋度為10－4，用涂布分離法分離細(xì)菌。 3．判斷下列敘述的正誤 (1)土樣應(yīng)從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方取(　√　) 提示　有哺乳動(dòng)物排泄物的地方含脲酶的細(xì)菌較多。 (2)取10－4、10－5的土壤稀釋液各0.1 mL，分別涂布于全營(yíng)養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基、尿素固體培養(yǎng)基上(　√　) (3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置，37 C恒溫培養(yǎng)24～48 h(　√　) (4)在尿素固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌都是以尿素為氮源的細(xì)菌(　　) 4．2013年11月22日凌晨3點(diǎn)，青島黃島區(qū)發(fā)生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制選擇培養(yǎng)基將這類微生物選擇出來(lái)？ 提示　配制的選擇培養(yǎng)基中，石油作為唯一的碳源，然后用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)多種微生物，凡是能在該種培養(yǎng)基上生存的就是能分解石油的微生物。 1．現(xiàn)從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下圖所示： →→→→ 請(qǐng)回答： (1)欲從土壤中分離出能分解尿素的細(xì)菌，將土壤用____________進(jìn)行一系列的梯度稀釋，同一濃度的土壤稀釋液應(yīng)至少涂布________個(gè)平板，通常以每個(gè)培養(yǎng)皿中有________個(gè)以內(nèi)的單菌落的那一組稀釋倍數(shù)為最合適。 (2)接種后的培養(yǎng)皿______________于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)。若培養(yǎng)基中存在含脲酶的細(xì)菌，其菌落周圍會(huì)出現(xiàn)________，這是由于尿素被分解產(chǎn)生氨氣，遇培養(yǎng)基中的____________產(chǎn)生的顏色變化，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。 (3)分離能利用尿素的細(xì)菌時(shí)所用的培養(yǎng)基成分上最主要的特點(diǎn)是_____________________。 (4)下列操作需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行的是__________(多選)。 A．稱取葡萄糖、瓊脂糖等培養(yǎng)基成分 B．倒平板 C．涂布平板 D．微生物的培養(yǎng) (5)與LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)相比，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)無(wú)菌水　3　20　(2)倒置　紅色環(huán)帶　酚紅指示劑　(3)以尿素作為唯一氮源的(固體)培養(yǎng)基 (4)BC　(5)土壤中能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少數(shù) 2．如圖是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過(guò)程。 (1)圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以________為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加________作為指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周圍的指示劑將變成________色。 (2)在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。 該過(guò)程采取的接種方法是________，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為_(kāi)_______108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)較________。 答案　(1)尿素　酚紅　紅　(2)涂布分離法　1.75　少 解析　(1)脲酶能夠催化尿素分解為氨，故圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以尿素作為唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，使酚紅指示劑變紅色。(2)用于計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)的接種方法是涂布分離法，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)應(yīng)介于30～300之間，故選擇細(xì)菌菌落數(shù)為156、178和191的平板計(jì)數(shù)，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為(156＋178＋191)/30.1105＝1.75108個(gè)。由于兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連接在一起時(shí)，往往統(tǒng)計(jì)的是一個(gè)菌落，故用此方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)偏少。 歸納整合 1．培養(yǎng)基中觀測(cè)指標(biāo)的分析 (1)培養(yǎng)基中的酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化(變紅)，標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株能以尿素為氮源。紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強(qiáng)弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強(qiáng)。 (2)與全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落，這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少部分。 2．微生物篩選過(guò)程中必要的兩種對(duì)照培養(yǎng)基及其作用 對(duì)照組 作用 現(xiàn)象 結(jié)論 未接種培養(yǎng)基 有無(wú)雜菌污染的判斷 未接種的培養(yǎng)皿中無(wú)菌落生長(zhǎng) 未被雜菌污染 接種的LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基篩選作用的確認(rèn) LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目 選擇培養(yǎng)基具有篩選作用 做模擬　練預(yù)測(cè) 1．(2016溫州中學(xué)期末測(cè)試)下圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序?yàn)?、2、3、4、5。下列操作方法正確的是(　　) A．操作前要將接種環(huán)放在火焰旁滅菌 B．劃線操作須在火焰上進(jìn)行 C．在5區(qū)域中才有可能得到所需菌落 D．在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行滅菌 答案　D 解析　操作前要將接種環(huán)放在火焰上灼燒滅菌，A項(xiàng)錯(cuò)誤；劃線操作須在火焰旁進(jìn)行，B項(xiàng)錯(cuò)誤；在5區(qū)域中最有可能得到所需菌落，C項(xiàng)錯(cuò)誤；在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行滅菌，D項(xiàng)正確。 2．在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，下列有關(guān)操作正確的是(　　) A．涂布器用火焰灼燒進(jìn)行滅菌 B．培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌 C．倒平板和取菌液都必須要在酒精燈火焰旁進(jìn)行 D．分離得到的菌落應(yīng)先接種在平板上，培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中保存 答案　C 解析　涂布器應(yīng)該用高壓蒸汽滅菌，A項(xiàng)錯(cuò)誤；培養(yǎng)基應(yīng)該先滅菌后分裝，B項(xiàng)錯(cuò)誤；倒平板和取菌液都必須要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，以防止雜菌污染，C項(xiàng)正確；分離得到的菌落應(yīng)先接種在斜面上，置于37 ℃的恒溫箱培養(yǎng)24 h后，再置于4 ℃冰箱中保存，D項(xiàng)錯(cuò)誤。 3．下圖是“分離以尿素為氮源的微生物”實(shí)驗(yàn)的基本流程，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基不能含有____________。 A．尿素 B．氯化鈉 C．葡萄糖 D．瓊脂 (2)尿素溶液可用________________________使之無(wú)菌。若要檢查B過(guò)程滅菌是否徹底，可以采用的方法是____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)圖中步驟C為_(kāi)_______________。相對(duì)于劃線分離法，過(guò)程D涂布分離法的優(yōu)點(diǎn)是__________________。 (4)如果菌落周圍出現(xiàn)____________色環(huán)帶，說(shuō)明該菌落能分泌脲酶。 答案　(1)D (2)G6玻璃漏斗過(guò)濾　將空白培養(yǎng)基放在適宜溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間， 觀察有無(wú)菌落出現(xiàn) (3)倒平板　單菌落更易分開(kāi) (4)紅 解析　(1)分離以尿素為氮源的微生物，應(yīng)該以尿素為唯一氮源，所以不應(yīng)有瓊脂。(2)尿素用G6玻璃漏斗過(guò)濾除去其中細(xì)菌等微生物。(4)若菌落能分泌脲酶，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)紅色環(huán)帶。 4．(2014浙江自選，17節(jié)選)(1)現(xiàn)有一份污水樣品，某興趣小組欲檢測(cè)其中的細(xì)菌數(shù)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。將一定量的污水樣品進(jìn)行濃度梯度稀釋。取適量不同稀釋度的稀釋液，用________法分別接種于固體平面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意，接種前，從盛有______________的容器中將玻璃刮刀取出，放在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后待用；分組時(shí)，需用________________作為對(duì)照。 (2)在上述細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)的是接種了(　　) A．各個(gè)稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù) B．合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù) C．各個(gè)稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù) D．合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù) 答案　(1)涂布分離　70%酒精　未接種的培養(yǎng)基　(2)D 解析　(1)細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)常用涂布分離法，即用玻璃刮刀將一定體積的稀釋液涂布到固體平面培養(yǎng)基上。玻璃刮刀在使用前需進(jìn)行滅菌處理，即將其浸入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中，隨后取出放在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后待用。為排除其他因素的影響，提高實(shí)驗(yàn)的可信度，實(shí)驗(yàn)中要設(shè)置空白對(duì)照。(2)將菌液涂布到固體平面培養(yǎng)基上后，倒置放在恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，這樣通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)就可估算出待測(cè)樣品的細(xì)菌數(shù)目，所以要選擇合理稀釋度樣品的培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。 課時(shí)訓(xùn)練 一、選擇題 1．下圖為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和純化大腸桿菌過(guò)程中的部分操作步驟，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(　　) A．①②③步驟操作時(shí)需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行 B．步驟①中，待倒入的培養(yǎng)基冷卻后蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋 C．步驟③中，每次劃線前后都需對(duì)接種環(huán)進(jìn)行灼燒處理 D．劃線接種結(jié)束后，將圖④平板倒置后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 答案　B 解析　由圖可知，步驟①是倒平板，步驟②是用接種環(huán)蘸取菌液，步驟③是進(jìn)行平板劃線，步驟④是培養(yǎng)。①②③步驟操作時(shí)需要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止被雜菌污染，A項(xiàng)正確；倒完平板后應(yīng)立即蓋上培養(yǎng)皿蓋，冷卻后將平板倒過(guò)來(lái)放置，B項(xiàng)錯(cuò)誤；每次劃線前后灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落，C項(xiàng)正確；劃線接種結(jié)束后，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，有利于培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)和防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染，D項(xiàng)正確。 2．(2016舟山中學(xué)期末測(cè)試)下列有關(guān)微生物培養(yǎng)的敘述中，不正確的是(　　) A．獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染 B．單菌落的分離是消除污染的雜菌的通用方法 C．培養(yǎng)基都必須使用高壓蒸汽滅菌法滅菌 D．倒置平板防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落 答案　C 解析　微生物培養(yǎng)中獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染，A項(xiàng)正確；通常可以采用涂布分離法或劃線分離法進(jìn)行單菌落的分離，以消除污染的雜菌，B項(xiàng)正確；培養(yǎng)基通?？梢赃M(jìn)行高壓蒸汽滅菌，但對(duì)于培養(yǎng)基中有高溫易分解的成分，就不能用此方法，如培養(yǎng)基中的尿素等物質(zhì)，C項(xiàng)錯(cuò)誤；劃線接種結(jié)束后需要將培養(yǎng)皿倒置，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)冷凝成的水滴入培養(yǎng)基而造成污染，D項(xiàng)正確。 3．(2015普陀中學(xué)期末測(cè)試)在分解尿素的細(xì)菌的分離和鑒定中，對(duì)先后用到的兩種培養(yǎng)基的敘述正確的是(　　) A．加入酚紅指示劑作為鑒別培養(yǎng)基，再加入唯一碳源作為選擇培養(yǎng)基 B．加入唯一氮源作為鑒別培養(yǎng)基，再加入酚紅指示劑作為選擇培養(yǎng)基 C．加入唯一氮源作為選擇培養(yǎng)基，再加入酚紅指示劑作為鑒別培養(yǎng)基 D．加入酚紅指示劑作為選擇培養(yǎng)基，再加入唯一碳源作為鑒別培養(yǎng)基 答案　C 解析　能合成脲酶的細(xì)菌才能分解尿素。配制以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌就是能分解尿素的細(xì)菌；細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素。 4．在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑的目的是(　　) A．篩選出能分解尿素的細(xì)菌 B．對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步鑒定 C．作細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)成分 D．若指示劑變藍(lán)就能準(zhǔn)確地認(rèn)定該菌能分解尿素 答案　B 解析　篩選出能分解尿素的細(xì)菌用選擇培養(yǎng)基即可，不需要加指示劑。加入指示劑的培養(yǎng)基，目的都是對(duì)要分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定。 二、非選擇題 5．幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)基本步驟如下： →→→→ 請(qǐng)回答： (1)在配制培養(yǎng)基時(shí)，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因?yàn)镠p含有________，它能以尿素作為氮源；若有Hp，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)______色環(huán)帶。 (2)下列對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌的最適方法是__________滅菌。 A．高壓蒸汽 B．紫外燈照射 C．70%酒精浸泡 D．過(guò)濾 (3)步驟X表示____________。在無(wú)菌條件下操作時(shí)，先將菌液稀釋，然后將菌液____________到培養(yǎng)基平面上。菌液稀釋的目的是為了獲得________菌落。 (4)在培養(yǎng)時(shí)，需將培養(yǎng)皿倒置并放在____________中，若不倒置培養(yǎng)，將導(dǎo)致__________________。 (5)臨床上用14C呼氣試驗(yàn)檢測(cè)人體是否感染Hp，其基本原理是Hp能將14C標(biāo)記的________________分解為NH3和14CO2。 答案　(1)脲酶　紅　(2)D　(3)接種　涂布　單 (4)恒溫培養(yǎng)箱　無(wú)法形成單菌落　(5)尿素 解析　(1)幽門(mén)螺桿菌(Hp)含有脲酶，能以尿素為氮源，在加入尿素和酚紅指示劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hp，由于尿素經(jīng)脲酶的降解可產(chǎn)生堿性的NH3，NH3能使培養(yǎng)基中的酚紅由紅黃色變成紅色，故菌落周圍會(huì)出現(xiàn)紅色環(huán)帶。(2)由于尿素加熱會(huì)分解，對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌最好用G6玻璃砂漏斗過(guò)濾。(3)微生物的分離和培養(yǎng)步驟：配制培養(yǎng)基→滅菌、倒平板→接種→培養(yǎng)。為獲得單菌落，接種操作前應(yīng)先將菌液稀釋，然后將菌液涂布到培養(yǎng)基平面上即可。(4)微生物培養(yǎng)時(shí)需將培養(yǎng)皿倒置并放在恒溫培養(yǎng)箱中，若不倒置培養(yǎng)，則無(wú)法形成單菌落。(5)幽門(mén)螺桿菌能將14C標(biāo)記的尿素分解為NH3和14CO2，故臨床上常用14C呼氣試驗(yàn)檢測(cè)人體內(nèi)幽門(mén)螺桿菌的存在。 6．從土壤中分離以尿素為氮源的細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖所示： 請(qǐng)回答： (1)圖中物質(zhì)A為_(kāi)_______________，若要統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中以尿素為氮源的細(xì)菌的活菌數(shù)目，宜采用________________法接種到尿素培養(yǎng)基上，對(duì)照組配制的培養(yǎng)基為_(kāi)___________培養(yǎng)基，若用同濃度的土壤稀釋液接種，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿中菌落數(shù)____________(大于、等于或小于)對(duì)照組。在能利用尿素的細(xì)菌菌落周圍，有紅色環(huán)帶出現(xiàn)的原因是________________ ________________________________________________________________________。 (2)下列培養(yǎng)基中，能分離出分解尿素的細(xì)菌的是(　　) A．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水 B．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水、尿素 C．NaCl、瓊脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素 D．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物 (3)欲將分離得到的以尿素為氮源的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，應(yīng)使用________培養(yǎng)基。 答案　(1)無(wú)菌水　涂布分離　LB全營(yíng)養(yǎng)　小于　因?yàn)槟芾媚蛩氐募?xì)菌產(chǎn)生的脲酶，將培養(yǎng)基中的尿素分解，產(chǎn)生的氨使指示劑呈紅色　(2)B　(3)LB液體 7．(原創(chuàng))有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株。請(qǐng)回答問(wèn)題： (1)在篩選過(guò)程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以________為唯一碳源的培養(yǎng)基上。從功能上講，該培養(yǎng)基屬于________(A.固體　B．液體　C．純化　D．選擇)培養(yǎng)基。 (2)純化菌種時(shí)，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即________________________。 (3)為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍透明圈的大小，透明圈大說(shuō)明該菌株的降解能力____________。 (4)通常情況下，在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有灼燒滅菌、________和高壓蒸汽滅菌。無(wú)菌技術(shù)要求實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈________附近進(jìn)行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。 答案　(1)原油　D　(2)劃線分離法和涂布分離法 (3)強(qiáng)　(4)干熱滅菌　火焰 解析　(1)可以將所需要的微生物從混雜的微生物群中分離出來(lái)的培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基。欲篩選出能降解原油的菌株，培養(yǎng)基中應(yīng)只含有原油而無(wú)其他碳源，這樣不能降解原油的細(xì)菌在此培養(yǎng)基上不能生存，可篩選出能分解原油的菌種。(2)分離純化菌種時(shí)，接種的方法有劃線分離法和涂布分離法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單菌落，以便于純化菌種。(3)降解原油能力越強(qiáng)的菌株，在菌落周圍形成的透明圈越大。(4)實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有灼燒滅菌(如接種環(huán))、干熱滅菌(如培養(yǎng)皿)和高壓蒸汽滅菌(如培養(yǎng)基)等。無(wú)菌技術(shù)要求整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作都要在酒精燈火焰附近進(jìn)行，以避免周圍微生物的污染。 8．(2016金麗衢十校聯(lián)考)下表是3組生物實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： 組別 培養(yǎng)基 a 無(wú)機(jī)鹽、蔗糖、維生素和甘氨酸等有機(jī)物、水、瓊脂 b 葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、酚紅、水、瓊脂糖 c 蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水、瓊脂 (1)分離以尿素為氮源的細(xì)菌應(yīng)選用培養(yǎng)基________。在含有脲酶的細(xì)菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)________________，這是由于尿素被分解產(chǎn)生的________使pH升高，酚紅指示劑產(chǎn)生顏色變化，從而證明這一菌株可以尿素為氮源。變色區(qū)域越大，表明該菌株利用尿素的能力________。 (2)用培養(yǎng)基a進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，則培養(yǎng)基中還需加入________。一般先用________(填“發(fā)芽”或“生根”)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)。 (3)生產(chǎn)上利用黑曲霉或蘋(píng)果青霉來(lái)提取果膠酶，在用果膠酶水解果膠的實(shí)驗(yàn)中，下列說(shuō)法正確的是________。 A．實(shí)驗(yàn)后滴加酒精的目的是增加果膠酶的活性 B．沸水浴加熱后果膠酶的活性隨著溫度的下降逐漸恢復(fù) C．間歇攪拌20～30 min的目的是讓果膠酶與果膠充分接觸 D．選用黑曲霉提取液是因?yàn)楣z酶只能在生物細(xì)胞內(nèi)起催化作用 答案　(1)b　紅色環(huán)帶　氨　越強(qiáng)　(2)植物激素(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)　發(fā)芽　(3)C 解析　(1)分離以尿素為氮源的細(xì)菌應(yīng)選用以尿素為唯一氮源并添加酚紅指示劑的培養(yǎng)基。分解尿素的微生物可產(chǎn)生脲酶，脲酶可催化尿素分解產(chǎn)生氨，氨使酚紅指示劑變紅，從而在菌落周圍形成紅色環(huán)帶，形成的紅色環(huán)帶越大，表明該菌株利用尿素的能力越強(qiáng)。 (2)植物組織培養(yǎng)所需的MS培養(yǎng)基需加入植物激素。培養(yǎng)過(guò)程中一般先用發(fā)芽培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)出較多的叢狀苗，然后將叢狀苗分株培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。 (3)在用果膠酶水解果膠的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)操作后滴加酒精的目的是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中果膠是否被水解；沸水浴加熱后果膠酶會(huì)失去活性；只要條件適宜，果膠酶在細(xì)胞內(nèi)外均可發(fā)揮催化作用。 9．(2015寧波鄞州中學(xué)練習(xí))有機(jī)農(nóng)藥苯磺隆是一種除草劑，長(zhǎng)期使用會(huì)污染環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分離能降解苯磺隆菌株的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)回答問(wèn)題： (1)微生物生長(zhǎng)繁殖所需的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有碳源、水、________、 ________四類，該實(shí)驗(yàn)所用的選擇培養(yǎng)基只能以苯磺隆作為唯一碳源，其原因是_______________________________ ________________________________________________________________________。 (2)純化菌株時(shí)，通常使用的劃線工具是________。在第二次及以后劃線時(shí)，總是從上一次的末端開(kāi)始劃線。這樣做的目的是____________________________。 (3)若要檢測(cè)土樣中的細(xì)菌含量，應(yīng)采用________法。在接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板培養(yǎng)基先行培養(yǎng)了一段時(shí)間，這樣做的目的是______________________________________。 答案　(1)氮源　無(wú)機(jī)鹽　只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長(zhǎng)和繁殖 (2)接種環(huán)　將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個(gè)菌落 (3)涂布分離　檢測(cè)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格 解析　(1)微生物生長(zhǎng)所需要的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、水和無(wú)機(jī)鹽。使用選擇培養(yǎng)基是因?yàn)檫x擇培養(yǎng)基上只有能利用苯磺隆的微生物能正常生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)又能抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。(2)劃線分離法接種時(shí)常使用接種環(huán)劃線。在第二次及以后劃線時(shí)，總是從上一次的末端開(kāi)始劃線。這樣做的目的是將聚集的菌體逐步減少以便獲得單個(gè)菌落。(3)涂布分離法常常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離和計(jì)數(shù)。為檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板滅菌是否合格，常常需要在接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板培養(yǎng)基先行培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察有無(wú)菌落形成，若沒(méi)有菌落形成則表明培養(yǎng)基滅菌合格，否則不合格。 10．石油烴是環(huán)境的重要污染源。為了篩選出具有強(qiáng)分解石油烴能力的微生物，進(jìn)行了一系列操作，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)分解石油烴的微生物一般要從土壤中分離，獲取土壤樣品的取樣地點(diǎn)最好選在________________。 (2)微生物實(shí)驗(yàn)室采用________法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理。 A．干熱滅菌 B．過(guò)濾滅菌 C．灼燒滅菌 D．高壓蒸汽滅菌 (3)下圖為獲取土壤樣品后的培養(yǎng)研究過(guò)程： 為了能有效地分離出分解石油烴的微生物，過(guò)程①～④所用培養(yǎng)基的成分的特點(diǎn)是______________________，從而有利于分解石油烴的微生物的生長(zhǎng)。 (4)對(duì)④進(jìn)行接種常采用的兩種方法分別是________________和________________。 (5)若發(fā)現(xiàn)在⑤中無(wú)法區(qū)分菌落，可以將圖中③取出的菌液________________。 (6)若實(shí)驗(yàn)室為分離純化優(yōu)良菌種進(jìn)行了如下操作，排序最合理的是________。 A．②①④③ B．②①④①③② C．②①④②③② D．①④①③② (7)整個(gè)微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在________條件下進(jìn)行。 答案　(1)石油污染明顯處 (2)D (3)以石油烴為唯一碳源 (4)劃線分離法　涂布分離法 (5)進(jìn)行(梯度)稀釋 (6)B (7)無(wú)菌 解析　(1)分解石油烴的微生物在石油污染明顯處分布較多。 (2)微生物實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌法對(duì)培養(yǎng)基滅菌。 (3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，過(guò)程①～④所用培養(yǎng)基應(yīng)用石油烴作為唯一碳源，以抑制其他種類微生物的生長(zhǎng)，從而分離出以石油烴為碳源的微生物。 (4)在微生物的分離實(shí)驗(yàn)中，常用劃線分離法或涂布分離法進(jìn)行接種。 (5)若發(fā)現(xiàn)在⑤中無(wú)法區(qū)分菌落，可能是菌液中細(xì)菌濃度太高，可進(jìn)行梯度稀釋處理后再進(jìn)行接種。 (6)圖示為用劃線分離法進(jìn)行接種分離。接種過(guò)程中應(yīng)先在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)后，蘸取菌液進(jìn)行接種，整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行，接種結(jié)束后還須在酒精燈上灼燒接種環(huán)。 (7)為避免污染，整個(gè)微生物的分離和培養(yǎng)的操作，一定要注意在無(wú)菌條件下進(jìn)行。