《中國藥典 《細菌內(nèi)毒素檢查法》》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《中國藥典 《細菌內(nèi)毒素檢查法》（8頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、凝膠法鱟試劑使用闡明書 【名稱】通用名：鱟試劑 英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （簡稱TAL） 漢語拼音：hou shi ji 本品重要成分為B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。 【用途】專用于細菌內(nèi)毒素檢查。 【性狀】本品為白色或類白色凍干塊或粉末，在水和生理鹽水中易溶。 【原理】本品為鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品，在合適的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反映形成凝膠。 【用法】 1．材料和設(shè)備 1.1選擇所需的規(guī)格及敏捷度的鱟試劑、細菌內(nèi)毒素工作品及細菌內(nèi)毒素檢查用

2、水。 1.2準(zhǔn)備若干支10ⅹ75mm玻璃反映試管（若使用0.1ml規(guī)格的鱟試劑無需準(zhǔn)備此試管）、多種規(guī)格吸管或移液器或注射器、稀釋內(nèi)毒素用玻璃管、反映試管架、計時器、旋渦混合儀、恒溫水浴箱（37±1℃）。 2．實驗操作 2.1 稀釋細菌內(nèi)毒素工作品：取內(nèi)毒素工作品（凍干品）1支，按細菌內(nèi)毒素工作品使用闡明書進行操作。 2.2 TAL試劑的溶解：按標(biāo)示量加細菌內(nèi)毒素檢查用水于TAL試劑中，輕輕振搖至少30S至試劑完全溶解。注意不要引起氣泡，溶解后的試劑應(yīng)在短時間內(nèi)使用（即配即用）。 2.3 檢查操作 2.3.1 取分裝有0.1ml 鱟試劑溶液的10×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml

3、 /支規(guī)格的鱟試劑原安瓿8支，其中2支作供試品管，2支作陰性對照管，2支作陽性對照管，2支作供試品陽性對照管。 2.3.2 每支供試品管加入0.1ml供試品；陰性對照管加入0.1ml檢查用水；陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ的內(nèi)毒素溶液，供試品陽性對照管加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素的供試品。 2.3.3 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘，然后取出觀測成果。試管在孵育期間應(yīng)避免任何的振動。 2.4 成果判斷 2.4.1 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°時，管內(nèi)的內(nèi)容物呈堅實凝膠，不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；不呈凝膠或雖生成凝膠但不

4、能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。 2.4.2 陰性對照管均為陰性，陽性對照管、供試品陽性對照管均為陽性，實驗有效，否則無效。 【注意事項】 1.本品僅用于體外細菌內(nèi)毒素檢測，嚴(yán)禁用于注射、口服等。 2. 實驗所用的器皿需經(jīng)解決，以清除也許存在的外源性內(nèi)毒素，常用的措施是在250℃干烤至少60min，也可采用其她確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的合適措施。 3.當(dāng)使用新批號的鱟試劑或?qū)嶒灄l件發(fā)生了任何也許影響檢查成果的變化時，應(yīng)進行鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗，措施見《中華人民共和國藥典》中《細菌內(nèi)毒素檢查法》的“鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗”。 4.有些物質(zhì)也許引起假陽性或假陰性，因此第一次

5、使用本品，供試品必須進行干擾實驗，措施見《中華人民共和國藥典》中《細菌內(nèi)毒素檢查法》的“干擾實驗”。 5.若陰性對照管為陽性，表白鱟試劑或檢查用水或?qū)嶒炂骶呤艿轿廴?；若陽性對照管為陰性，表白鱟試劑或原則內(nèi)毒素已失效，或鱟試劑的敏捷度及原則內(nèi)毒素的效價標(biāo)示不精確，或原則內(nèi)毒素的稀釋有誤；供試品陽性對照管為陰性，表白反映體系內(nèi)有克制反映的干擾因素存在。 【貯藏條件】避光，陰涼處保存。 【批準(zhǔn)文號】[88]衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ-02號 【規(guī)??? 格】0.1ml、0.5ml、1ml、2ml 【包??? 裝】安瓿10支裝、抗生素瓶10瓶裝 【產(chǎn)品批號】見外盒【生產(chǎn)日期】見外盒【有效期至】見外盒

6、【生產(chǎn)公司】公司名稱：廈門鱟試劑實驗廠有限公司 公司地址：廈門海滄新陽工業(yè)區(qū)新嘉路131號（361022） 銷售電話：（0592）2085561、2095294銷售傳真：（0592）2095294網(wǎng)??? 址： 中國藥典 《細菌內(nèi)毒素檢查法》 　　 ??? 本法系運用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量與否符合規(guī)定的一種措施。 ??? 細菌內(nèi)毒素檢查涉及兩種措施，即凝膠法和光度測定法，后者涉及濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種措施進行實驗。當(dāng)測定成果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法成果為準(zhǔn)。 ??? 細菌內(nèi)毒素

7、的量用內(nèi)毒素單位（EU）表達。 ??? 細菌內(nèi)毒素國標(biāo)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑敏捷度和標(biāo)定細菌內(nèi)毒素工作原則品的效價。 ??? 細菌內(nèi)毒素工作原則品系以細菌內(nèi)毒素國標(biāo)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于實驗中鱟試劑敏捷度復(fù)核、干擾實驗及設(shè)立的多種陽性對照。 ??? 凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量不不小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測定用的細菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)不不小于0.005EU/ml。 ??? 實驗所用的器皿需經(jīng)解決，以清除也許存在的外源性內(nèi)毒素。常用的措施是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其她確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的合適措施

8、。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對實驗無干擾的器械。實驗操作過程應(yīng)避免微生物的污染。 ??? 供試品溶液的制備 某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般規(guī)定供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范疇內(nèi)。對于過酸、過堿或自身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的合適的緩沖劑調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已清除內(nèi)毒素的容器中進行配制。緩沖液必須通過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。 ??? 內(nèi)毒素限值的建立 藥物、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）一般按如下公式擬定： L=K

9、/M ??? 式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表達； ????K為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表達，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥物注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。 ??? M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表達，人均體重按60kg計算，注射時間若局限性1小時，按1小時計算。 ??? 按人用劑量計算限值時，如遇特殊狀況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際狀況做必要調(diào)節(jié)，但需闡明理由。 ??? 擬定

10、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被容許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)下可進行內(nèi)毒素限值的檢測。用如下公式來擬定MVD： MVD=CL/λ ??? 式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值； ??? C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表達時，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表達時，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計算供試品的最小有效濃度C=λ/L。 ??? λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示敏捷度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的原則曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。 ??? ??? 措施1 凝膠

11、法 ? ??? 凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反映的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的措施。在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示敏捷度，用EU/ml表達。 ??? 鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗 當(dāng)使用新批號的鱟試劑或?qū)嶒灄l件發(fā)生了任何也許影響檢查成果的變化時，應(yīng)進行鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗。 ??? 根據(jù)鱟試劑敏捷度的標(biāo)示值（λ），將細菌內(nèi)毒素國標(biāo)品或細菌內(nèi)毒素工作原則品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素原則溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取具有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的1

12、0mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素原則溶液，及每一種濃度平行做4管；此外2管加入0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃合適恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動導(dǎo)致假陰性成果。 ??? 若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，實驗方為有效。按下式計算反

13、映終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑敏捷度的測定值(λc). λc=1g-1(∑X/4) ??? 式中X為反映終點濃度的對數(shù)值（1g）。反映終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一種呈陽性成果的濃度。 ??? 當(dāng)λc在0.5λ-2λ(涉及0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示敏捷度λ為該批鱟試劑的敏捷度。 ??? 干擾實驗 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢查出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗項下操作。 只有當(dāng)溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的成果在鱟試劑敏捷度復(fù)核范疇內(nèi)時，實驗方為有效。

14、按下式計算C和B的反映終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) ??? 式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反映終點濃度的對數(shù)值（1g）。 ??? 當(dāng)Es在0.5λ-2λ(涉及0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (涉及0.5 Es和2 Es)時，覺得供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在不不小于MVD的稀釋倍數(shù)下對實驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再反復(fù)干擾實驗。 表1 凝膠法干擾實驗溶液的制備 編號 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒 素的濃度 平

15、行 管數(shù) A 無/供試品溶液 - - - 2 B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4 4 4 4 C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4 4 4 4 D 無/檢查用水 - - - 2 注：A 供試品溶液；B干擾實驗系列；C鱟試劑標(biāo)示敏捷度的對照系列；D陰性對照。 ??? 可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其她合適的措施（如過濾、中和、透析或加熱解決等）排除干擾。為保證所選擇的解決措施能有效的排除干擾且不會使內(nèi)毒

16、素失去活性，要使用預(yù)先添加了原則內(nèi)毒素再通過解決的供試品溶液進行干擾實驗。 ??? 當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查實驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾實驗。 ??? 當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒灜h(huán)境中發(fā)生了任何有也許影響實驗成果的變化時，須重新進行干擾實驗。 ??? 檢查法 ??? 1）凝膠限量實驗 ??? 按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗項下操作。 表2 凝膠限量實驗溶液的制備 編號 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù) A 無/供試品溶液 2 B

17、 2λ/供試品溶液 2 C 2λ/檢查用水 2 D 無/檢查用水 2 ??? 注：A供試品溶液；B供試品陽性對照；C陽性對照；D陰性對照。 ??? 成果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀測成果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，實驗有效。 ??? 若溶液A的兩個平行管都為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性另一管為陰性，需進行復(fù)試。復(fù)試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。 ??? 2）凝

18、膠半定量實驗 ??? 本措施系通過擬定反映終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實驗項下操作。 ??? 成果判斷 若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照B的平行管均為陽性，系列溶液C的反映終點濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，實驗有效。 ??? 系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個系列的反映終點濃度，所有平行管反映終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果實驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將成果乘上稀釋倍數(shù)。 ??? 如實驗中供試品溶液的成

19、果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度不不小于λ（如果檢查的是稀釋過的供試品，則記錄為不不小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。如果成果都為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度不小于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。 ??? 若內(nèi)毒素濃度不不小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度不小于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。 表3 凝膠半定量實驗溶液的制備 編號 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒素的濃度 平行管數(shù) A 無/供試品溶液 檢查用水 1 2 4 8 - - - - 2 2 2 2 B 2λ/供試品溶液 　 1 2λ 2

20、C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2 2 2 2 D 無/檢查用水 - - - 2 注：A：沒有超過MVD并且通過干擾實驗的供試品溶液。用檢查用水進行2倍系列稀釋，從通過干擾實驗的稀釋倍數(shù)開始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過MVD； ??? B：含2λ濃度原則內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照）； ??? C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度原則內(nèi)毒素的檢查用水系列； ??? D：陰性對照。 　??? 措施2 光度測定法 ???? 光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。 ??

21、? 濁度法系運用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反映過程過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的措施。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是根據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終結(jié)時的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的措施。動態(tài)濁度法是檢測反映混合物的濁度達到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時間，或是檢測濁度增長速度的措施。 ??? 顯色基質(zhì)法系運用鱟試劑與內(nèi)毒素反映過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的措施。根據(jù)檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是根據(jù)反映混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終結(jié)時釋放出的有色團的量之間存在著量化

22、關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的措施。動態(tài)顯色法是檢測反映混合物的色度達到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時間，或是檢測色度增長速度的措施。 ??? 光度測定實驗應(yīng)在特定的儀器中進行，溫度一般為37℃±1℃。 ??? 供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)闡明進行。 ??? 為保證濁度和顯色實驗的有效性，應(yīng)預(yù)先進行原則曲線的可靠性實驗以及供試品溶液的干擾實驗。 ??? 原則曲線的可靠性實驗 當(dāng)使用新批號的鱟試劑或?qū)嶒灄l件發(fā)生了任何也許會影響檢查成果的變化時，需進行原則曲線的可靠性實驗。 ??? 用原則內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰

23、濃度間稀釋倍數(shù)不得不小于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限。每一稀釋環(huán)節(jié)的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同步規(guī)定做2支陰性對照。當(dāng)陰性對照在設(shè)定的時間內(nèi)不發(fā)生反映，將所有數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。 ??? 根據(jù)線性回歸分析，原則曲線的有關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)當(dāng)不小于或等于0.980，實驗方為有效。否則須重新實驗。 ??? 干擾實驗 選擇原則曲線中點或一種接近中點的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個平行管。 表4 光度測定法干擾實驗的制備 編號 內(nèi)毒素濃度 配制內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù) A 無 供試品溶液 不少于2個 B 原

24、則曲線的中點（或附近點）的濃度（設(shè)為λm） 供試品溶液 不少于2個 C 至少3個濃度（最低一點設(shè)定為λ） 檢查用水 每一濃度不少于2個 D 無 檢查用水 不少于2個 注 A：稀釋倍數(shù)未超過MVD的供試品溶液。 ?? B：加入原則曲線中點或接近中點的一種已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相似稀釋倍數(shù)的供試品溶液。 ?? C：如“原則曲線的可靠性實驗”項下描述的，用于制備原則曲線的原則內(nèi)毒素溶液。 ?? D：陰性對照。 ??? 按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含原則內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該實驗條件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct

25、)/λm×100% ??? 當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%~200%之間，則覺得在此該實驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。 ??? 當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范疇時，須按“凝膠法干擾實驗”中的措施清除干擾因素。并要反復(fù)干擾實驗來驗證解決的有效性。 ??? 當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒灜h(huán)境中發(fā)生了任何有也許影響實驗成果的變化時，須重新進行干擾實驗。 ??? 檢查法 ??? 按“光度法的干擾實驗”中的操作環(huán)節(jié)進行檢測。 ??? 使用溶液C生成的原則曲線來計算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。 ??? 實驗必須符合如下三個條件方為有效： ??? （1）系列溶液C的成果要符

26、合 “原則曲線的可靠性實驗”中的規(guī)定。 ??? （2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范疇內(nèi)。 ??? （3）溶液D在規(guī)定的時間內(nèi)不發(fā)生反映。 ??? 若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，不不小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若不小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。 ??? （注：本檢查法中，“管”的意思涉及其她任何反映容器，如微孔板中的孔。）? ??????????????????????來源--中華人民共和國藥典 附錄Ⅺ E?? 廈門鱟試劑廠整頓 　　　 　?? 中國藥典

27、和美國藥典中的細菌內(nèi)毒素檢測法的不同點比較 Requirements CP USP 細菌內(nèi)毒素工作原則品（CSE） 對CSE的用途及效價進行定義“細菌內(nèi)毒素工作原則品中每1ng細菌內(nèi)毒素的效價應(yīng)不不不小于2EU，不不小于50EU” 未提到CSE 細菌內(nèi)毒素檢查用水 與敏捷度為0.03EU/ml或更高敏捷度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產(chǎn)生凝集反映的滅菌注射用水 與鱟試劑在限定的敏捷度下不發(fā)生反映的滅菌注射用水或其他水 用于細菌內(nèi)毒素定量測定用的細菌內(nèi)毒素檢查用水，內(nèi)毒素含量應(yīng)不不小于0.005EU/ml 未提到 實驗用品的準(zhǔn)備 實驗所用器皿需經(jīng)解決，除去也許存在

28、的外源性內(nèi)毒素，常用的措施是250℃下干烤至少1小時，也可用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的合適措施。 使用經(jīng)驗證的除熱原程序?qū)λ胁Ａ髅蠛陀鰺岱€(wěn)定的材料在熱空氣烘箱中進行除熱原，常用的最低溫度和至少的時間是250℃下30分鐘 實驗操作過程應(yīng)避免微生物污染 未提到 內(nèi)毒素原則品儲藏液和原則品溶液的制備 未提到 USP的RSE的效價定為10,000USP EU/支，用5ml鱟試劑檢查用水復(fù)溶1支RSE的所有內(nèi)容物，用漩渦混合器間歇混合30分鐘，并用此原液作系列稀釋，將原液置于冰柜中保存不超過14天，作后來的稀釋之用，在使用前用漩渦混合器強力混合不少于3分鐘，在作下一步稀釋前需對前面的

29、稀釋液混合不少于30秒，不要貯存稀釋液，由于沒有數(shù)據(jù)能證明其不會由于吸附作用而失去活性。 供試品溶液的制備 某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提 用LRW復(fù)溶或稀釋藥物或抽提醫(yī)療器械，某些物質(zhì)也許更適于用其他水性溶液來溶解、稀釋或抽提 對于過酸、過堿或自身有緩沖能力的供試品需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般規(guī)定供試品溶液的pH值在6.0-8.0的范疇內(nèi) 如果需要，可調(diào)節(jié)待測溶液（或其稀釋液）的pH值，以使鱟試劑和樣品的混合物的pH范疇落在鱟試劑生產(chǎn)商指定的范疇內(nèi)，這一般合用于pH值在6.0-8.0范疇內(nèi)的產(chǎn)品 內(nèi)毒素限值的建立 藥物、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）

30、一般按如下公司擬定：L=K/M 非經(jīng)腸道藥物的內(nèi)毒素限值，以劑量定義，等于K/M K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg.h)表達。注射劑，K=5EU/(kg.h)，其中放射性藥物注射劑，K=2.5EU/(kg.h)，鞘內(nèi)用注射劑，K=0.5EU/(kg.h) 除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內(nèi)給藥時，K為0.2 USP-EU/kg，對于非鞘內(nèi)給藥放射性藥物，內(nèi)毒素限值的計算為175/V，V為以mL為單位的最大推薦劑量，對于鞘內(nèi)給藥的放射性藥物，其內(nèi)毒素限值為14/V，對于按以每平方體表面積計算的給藥劑量（一般是抗

31、腫瘤藥物），計算公式為K/M，其中K=5EU/kg，M為（最大劑量/m2/小時×1.80m2)/70kg 敏捷度復(fù)核算驗 未闡明 至少用每批鱟試劑中的1支試劑進行敏捷度復(fù)核算驗 當(dāng)最大濃度2.0λ管為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性時，實驗方為有效 濃度最低的原則品溶液的所有反復(fù)管均為陰性，實驗方為有效 按下式計算反映終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑敏捷度的測定值（λc）： λc=lg-1(ΣX/4) 用下式計算終點濃度的對數(shù)值的平均值，然后再計算該平均值的反對數(shù)： 終點濃度的幾何平均值= antilog(Σe/f) Σe是稀釋系列的終點濃度的對數(shù)值之

32、和，f為反復(fù)管數(shù)，反映終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑敏捷度的測定值 凝膠法限量實驗 溶液制備中的表添加了內(nèi)毒素的溶液為“供試品溶液” 為“經(jīng)稀釋的供試品溶液” 使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品液來制備溶液A和B 使用稀釋倍數(shù)不超過MVD的稀釋液來制備溶液A和B 在復(fù)試中，溶液A需做4支平行管，當(dāng)所有平行管都為陰性時，供試品溶液符合規(guī)定 在復(fù)試中，如果溶液A的兩支平行管均為陰性，供試品溶液符合規(guī)定 未闡明 如果供試品溶液以不超過MVD的某個稀釋倍數(shù)稀釋，檢測成果為陽性時，可進一步稀釋供試品溶液但不能超過MVD，再重新進行實驗。 光度測定法 所有的光度測定實驗都

33、規(guī)定在特定的儀器中進行，溫度一般在37±1℃ 所有的光度法實驗都應(yīng)在鱟試劑供應(yīng)商推薦的恒溫溫度下進行，一般為37±1℃ 未提到 如果動態(tài)法中所需的濃度范疇不小于兩個對數(shù)級，應(yīng)增長一種原則品以便在原則曲線范疇內(nèi)涉及每個對數(shù)增長 溶液D（陰性對照）在規(guī)定的反映時間內(nèi)沒有可檢測到的內(nèi)毒素 陰性對照系列D的成果不超過所用鱟試劑所闡明的空白對照限值 細菌內(nèi)毒素化學(xué)構(gòu)造(LPS)： (1) O-特異性多糖鏈(親水端) (2) 核心多糖 (3) 類脂A（生理活性中心）(疏水端) 細菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)： 細菌內(nèi)毒素很容易吸附在容器

34、壁上或匯集在一起，中國藥典明確注明：細菌內(nèi)毒素溶液要混旋15min和30s，以充足混勻。 1.4 細菌內(nèi)毒素的耐熱特性 由于細菌內(nèi)毒素要在高溫250℃ 30分鐘才干完全滅活，因此在制藥工業(yè)和一次性醫(yī)療器械及血袋等生產(chǎn)工藝中都是讓人頭疼的問題，檢測使用的多種玻璃器材均應(yīng)嚴(yán)格清除內(nèi)毒素后才干使用，我們提供的成品實驗器材要通過7道嚴(yán)格工序才達到規(guī)定。 2 鱟試劑（TAL） 海洋節(jié)肢動物——鱟 鱟血提獲得生物制劑——鱟試劑細菌內(nèi)毒素和鱟試劑生化反映原理： 細菌內(nèi)毒素（LPS） 1,3-(β,D)-葡聚糖 C因子 被活化為活化C因子 B因子 被活化為活化B因子 G因子 被活化為活化G因子 凝固酶原產(chǎn)生 凝固酶 凝固蛋白原產(chǎn)生凝固蛋白（凝膠） 革蘭氏陰性菌死亡 真菌等代謝產(chǎn)生 鱟試劑有兩條反映通路，可檢測革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素和真菌產(chǎn)生的 1,3-(β,D)-葡聚糖，即可以間接檢測革蘭氏陰性菌和真菌的存在，目前試劑廠家可以提供分別針對于這兩種物質(zhì)的特異性鱟試劑