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1、第三章 利用生物合成原理尋找微生物新藥,根據(jù)微生物藥物的生物合成原理發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑,通過(guò)非基因定向改變、基因定向改變，以及組合生物催化的技術(shù)，或是改變?cè)形⑸锼幬锏纳锖铣赏緩剑蚴菍?duì)原有的微生物藥物（或先導(dǎo)化合物和中間體）進(jìn)行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥 .,定向與雜交生物合成,化學(xué)修飾,微生物藥物生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn)的基本途徑,通過(guò)非基因定向改變的方法包括：定向生物合成、雜交生物合成、突變生物合成，以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化； 基因定向改變，即為組合生物合成。,第一節(jié)生物合成途徑的非基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),一、非遺傳操作的定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),已有的研究表

2、明，在抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成中酶底物的特異性足以使結(jié)構(gòu)相關(guān)的代謝產(chǎn)物在其發(fā)酵液中積累； 但由于生物合成酶的底物專一性較低（寬泛性），其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過(guò)程中添加一些已知結(jié)構(gòu)類似物作為前體物質(zhì)，可以產(chǎn)生含有與這種已知結(jié)構(gòu)類似的新衍生物； 這種獲得新次級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑，可以被稱之為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。,前體（precursor）,即在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，外源添加的某一化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)微生物的代謝，能夠?qū)⑵湔w地或部分地整合到某一特定的次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。,非遺傳操作的定向生物合成,這種

3、在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加某種特定的前體物質(zhì)，使微生物的生物合成朝著將這些前體物質(zhì)摻入到產(chǎn)物分子的某一特定部位而產(chǎn)生過(guò)量的含有這種前體的產(chǎn)物的方法，即為非遺傳操作的定向生物合成。 其基本原理是由于參與這些反應(yīng)的生物合成酶的底物專一性較差，而能使外源添加的某些前體物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性地?fù)饺氲教囟óa(chǎn)物的分子中去。,定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶的特點(diǎn)：是一個(gè)由一系列酶參與催化的多酶體系。參與催化反應(yīng)的酶的底物專一性比初級(jí)代謝合成酶要差。,應(yīng)用實(shí)例,應(yīng)用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的有： 青霉素G和V； 培羅霉素； 四環(huán)素和金霉素等。,青霉素定

4、向生物合成,培羅霉素定向生物合成,.,培羅霉素定向生物合成可結(jié)合進(jìn)入BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物,.,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一些四環(huán)素類抗生素,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,在生產(chǎn)金霉素時(shí)需添加氯化物作為前體，而當(dāng)生產(chǎn)四環(huán)素時(shí)，則必須要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或M-促進(jìn)劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四環(huán)素產(chǎn)物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過(guò)程中添加適量的甲基化反應(yīng)抑制劑如磺胺嘧啶鈉，能夠獲得去甲基金霉素。,非基因改變定向生物合成的研究進(jìn)展,盡管近年來(lái)基因改變的定向生物合成發(fā)展很快，但利用非遺傳操作定向生物合成原理尋找新的生理活性物質(zhì)的研究還

5、在不少實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)進(jìn)行，特別是對(duì)一些肽類如環(huán)孢菌素A、aureobasidins及糖肽類如替考拉寧產(chǎn)生菌的定向生物合成研究取得了很大的進(jìn)展。,二、添加外源酶抑制劑的雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),雜交生物合成（hybrid biosynthesis）似乎可以理解為是一種“強(qiáng)化”的非遺傳定向生物合成，如在苦霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵過(guò)程中添加聚乙酰途徑中-酮酯?；铣擅敢种苿┚€蘭菌素(cerulenin)，使其失去合成苦霉素大環(huán)內(nèi)酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中添加泰樂(lè)菌素大環(huán)內(nèi)酯苷元(protylonolide)，使其與苦霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)生的糖基結(jié)合，得到一種被稱之為M43

6、65G1的雜合抗生素(hybrid antibiotic)。,雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),雜交生物合成產(chǎn)物工業(yè)化的可能性,盡管通過(guò)雜交生物合成能夠得到一些新的抗生素，但由于所添加的淺藍(lán)菌素本身就是一種昂貴的抗生素，再則所添加的苷元的結(jié)構(gòu)受到限制，所以這種方法似乎沒(méi)有很大的實(shí)際意義。,三、非定向誘變的突變生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),突變生物合成（mutational biosynthesis）： 突變生物合成是指野生型產(chǎn)生菌經(jīng)化學(xué)或物理等因素誘變處理后，喪失合成原來(lái)次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突變株時(shí)添加某種外源物質(zhì)，參與生物合成以獲得新的次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)程。 另外

7、，突變生物合成也包括由于突變而引起產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。,突變生物合成原理阻斷突變株的類型,營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株： 由于編碼菌體生長(zhǎng)之必須的酶的基因發(fā)生了突變，而使菌體不能生長(zhǎng)，導(dǎo)致不能合成次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，這類突變株也可以稱為初級(jí)代謝阻斷突變株。 獨(dú)需型突變株： 這種突變株的生長(zhǎng)和初級(jí)代謝正常，但由于編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的某一基因發(fā)生突變，而使喪失了合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。這是突變生物合成所需要的突變株。 雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級(jí)代謝酶的基因上，也發(fā)生在編碼次級(jí)代謝酶的基因上。,突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn),.,利用獨(dú)需型突變株合成產(chǎn)生新抗生素的基本原理,突變生物合成的基本流程

8、,.,突變生物合成產(chǎn)生的新抗生素,.,紅霉素生物合成途徑,.,突變株產(chǎn)生的新蒽環(huán)類抗生素,.,,突變株產(chǎn)生的一些新的次級(jí)代謝產(chǎn)物,.,我國(guó)應(yīng)用突變生物合成原理找到的小諾霉素,.,四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),微生物原生質(zhì)體融合，即是指將雙新株的微生物細(xì)胞分別通過(guò)酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲溶液的條件下混合，并加入物理的（如電融合）或化學(xué)的(如聚乙二醇)或生物的（如仙臺(tái)病毒）助融條件，使雙親株的原生質(zhì)發(fā)生相互凝集，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)融合，核融合，爾后發(fā)生基因組間的交換，重組，進(jìn)而可以在適宜的條件下再生出微生物細(xì)胞壁，獲得重組子的過(guò)程。,利用微生物原生質(zhì)融合尋找新抗生素的基本原理是來(lái)源于兩

9、種已知產(chǎn)生不同抗生素的產(chǎn)生菌的融合子，有可能將它們的部分生物合成基因整合在一起而產(chǎn)生新的雜合抗生素；另一個(gè)原理是由于抗生素產(chǎn)生菌中存在著沉默基因，當(dāng)這些沉默基因受到外源物質(zhì)刺激后，有可能被激活而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)與親株完全不同的新的抗生素。 應(yīng)用這種方法獲得的第一個(gè)新抗生素是吲哚佐霉素（indloizomycin）：其親株為鏈霉素產(chǎn)生菌灰色霉菌和天神霉素（istamycin）產(chǎn)生菌天神鏈霉菌S. tenjimariensis。,第二節(jié)生物合成途徑的基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),組合生物合成Combinatorial biosynthesis,是一種通過(guò)對(duì)天然產(chǎn)物生物合成途徑中的基因進(jìn)行中斷、置換及重組

10、等操作，改變?cè)瓉?lái)抗生素產(chǎn)生菌或其他天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌生物合成代謝產(chǎn)物的途徑，產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)的“非天然的天然雜合產(chǎn)物（unnatural natural hybrid compounds）”的技術(shù)或方法。,組合生物合成的潛能 potential,重組、組合、互補(bǔ)、替換 R=可利用的基因 n=基因的等位形式 化合物數(shù)Rn R=4, n=4 Compounds=44=256,組合生物合成的原理,生物合成酶基因的結(jié)構(gòu)和組成 生物合成酶基因的特異性及底物寬容性 生物合成酶基因之間的相互作用 生物合成途徑的研究基礎(chǔ),一、具有聚酮體生物合成途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成,一些具有聚酮體生物合成（pol

11、yketide synthases，PKSs）途徑的“天然產(chǎn)物”，如紅霉素、阿維菌素、泰樂(lè)菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司和利福霉素等可采用組合生物合成。,具PKS途徑的抗生素,1、紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成,通過(guò)操作PKS的模塊中單個(gè)基因的組合生物合成； 在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過(guò)量表達(dá)組合生物合成產(chǎn)物； 通過(guò)操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 ； 通過(guò)操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成。,紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成的可能性,參與紅霉素生物合成的PKSs，或6脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6個(gè)模塊組成，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)合成聚酮體中

12、的一部分。 由于各模塊之間的協(xié)調(diào)性，以及每個(gè)模塊延伸單位的選擇、功能和立體化學(xué)性質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域，因此，就有可能通過(guò)對(duì)PKSs結(jié)構(gòu)域或模塊的操作獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物。 由于具有聚酮體結(jié)構(gòu)的化合物其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和具有眾多的立體異構(gòu)體，因而，難以用常規(guī)的化學(xué)方法來(lái)獲得。,紅 霉 素 的 生 物 合 成 途 徑,PKS中的每一個(gè)模塊的組成,酮基合成酶（ketosynthase，KS） ?；D(zhuǎn)移酶（acyl transferase，AT） ?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP -酮基修飾酶：包括酮基還原酶（ketoreductase，KR）、脫氫酶（dehydrogenas

13、e，DH）和烯酰還原酶（enoylreductase，ER） DEBS含有編碼三個(gè)獨(dú)立的多肽亞單位的6個(gè)模塊 大多數(shù)典型的聚酮體合成途徑的產(chǎn)物包括對(duì)PKS產(chǎn)物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進(jìn)行糖苷化以及通過(guò)細(xì)胞色素P450進(jìn)行氧化。圖中所示的LD為裝載域（loading domains），TE為硫酯酶（esterases）。,1）通過(guò)操作PKS的模塊中單個(gè)基因的組合生物合成,一是用利福霉素PKS模塊2中的DH/ER/KR結(jié)構(gòu)域取代紅霉素PKS模塊2中的KR； 二是將模塊5中的KR缺失； 三是用利福霉素模塊2中的丙二酰特異性AT取代模塊6中的甲基丙二酰特異性的AT），將得到一個(gè)發(fā)生三重突變的PKS產(chǎn)

14、物。,2）在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過(guò)量表達(dá)組合生物合成產(chǎn)物,將E.coli 開發(fā)成能夠表達(dá)PKS產(chǎn)物需要解決的問(wèn)題主要有三個(gè)方面： 一是能夠功能性表達(dá)巨大的蛋白（330kDa）； 二是PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺?；?； 三是聚酮體途徑中的前體物質(zhì)，特別是（2S）甲基丙二酰CoA在E.coli中不存在。,Pfeifer等的工作包括：,運(yùn)用來(lái)源于枯草芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶（NRPS）基因簇的磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶（phosphopantetheinyl transferase）基因sfp，以對(duì)PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺酰化； 過(guò)量表達(dá)E.coli中的

15、丙酰CoA合成酶基因prpE，擾亂丙酰CoA代謝途徑，以及過(guò)量表達(dá)來(lái)自S.coelicolar的丙酰CoA羧化酶基因pcc，使丙酰CoA轉(zhuǎn)化為（2S）甲基丙二酰CoA,3）通過(guò)操作PKS模塊之間連接的組合生物合成,通過(guò)對(duì)DEBS模塊在E.coli和體外的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)在PKS裝配過(guò)程中那些短的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的“連接件”是至關(guān)重要的成分。研究發(fā)現(xiàn)在相繼非共價(jià)連接的模塊中，其氨基和羧基末端存在有多肽內(nèi)連接件，這種連接件與單個(gè)多肽內(nèi)的模塊之間的連接件不同。 因此，使用一種合適的連接件就有可能允許雜合的模塊之間進(jìn)行功能性連接。,a：已經(jīng)鑒定了不同的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的連接件，并由此指導(dǎo)合成模塊之間的聚酮體

16、中間體，這里需要合適的氨基和羧基末端連接配對(duì)，以產(chǎn)生功能性連接模塊； b：在構(gòu)建功能性互補(bǔ)體時(shí)，可以使用編碼來(lái)源于不同微生物多個(gè)模塊的全亞基； 如圖所示：來(lái)源于苦霉素（picromycin）的PKS（PikAI和PikAII），與來(lái)源于竹桃霉素（oleandomycin）的PKS（OleA3）相結(jié)合。,4）通過(guò)操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成,對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由自然界中植物、真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的很多具有生理活性的糖苷類化合物的分析發(fā)現(xiàn)，連接在苷元上的糖基的結(jié)構(gòu)大多為6-脫氧己糖（6-deoxyhexoses, 6DOHs）。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些具有生理活性的糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)上含有70多種不同的6-脫氧己糖

17、。,,,由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的結(jié)構(gòu)特性,具有單糖殘基的化合物：烏達(dá)霉素A、柔紅霉素、urdamycin A和rebeccamycin； 具有雙糖殘基的化合物：光輝霉素（mithramycin）； 具有三糖殘基的化合物：烏達(dá)霉素A（urdamycin A）和光輝霉素（前者同時(shí)具有單糖和三糖殘基，后者同時(shí)具有雙糖和三糖殘基）； 以O(shè)-糖苷鍵連接的化合物：紅霉素A、光輝霉素、柔紅霉素和烏達(dá)霉素A； 以C-糖苷鍵連接的化合物：烏達(dá)霉素A； 以N-糖苷鍵連接的化合物：rebeccamycin。,,由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu),a）通過(guò)將竹桃霉素產(chǎn)生菌S.an

18、tibioticus中齊墩果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在不同的S.erythraea中的表達(dá)，得到了3O鼠李糖基紅霉素和6dEB衍生物，以及一個(gè)desosaminylated tylactone；b）改造來(lái)源于刺孢霉素（calicheamicin）產(chǎn)生菌的基因，可以得到一個(gè)新的脫氧氨基糖，并將其附著在S.lividans產(chǎn)生的苷元上；,c）在S.lividans產(chǎn)生菌中構(gòu)建desosamine的途徑，然后導(dǎo)入通過(guò)遺傳操作的DEBS，可以得到具有新穎結(jié)構(gòu)的desosaminylated大環(huán)內(nèi)酯類文庫(kù)。,將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈霉菌中編碼竹桃霉素oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基因oleGII，（該酶負(fù)責(zé)將相應(yīng)

19、的糖基轉(zhuǎn)移到8，8a-脫氧竹桃內(nèi)酯（8，8a-deoxyoleandolide）的4位羥基上），整合到紅霉素產(chǎn)生菌eryBV缺失突變株中，eryBV基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將L-mycarose糖基轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯（6-deoxyerythronolide）甙元的相同位置，并進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果得到了將天然糖基L-rhamnose轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯4位的新紅霉素衍生物，其具有抗菌活性，,將泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編碼mycaminose糖基轉(zhuǎn)移酶基因tylM2整合到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株SGT2，（分別缺失聚酮體合成酶基因、mycarose和desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具

20、有合成L-mycarose和D-desosamine的能力），并使之表達(dá)，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中外源加入16-元環(huán)的泰樂(lè)酮（tylactone），結(jié)果得到一種新的泰樂(lè)星衍生物5-O-desosaminyl-tylactone，如圖）所示。說(shuō)明泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶TylM2能夠識(shí)別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。 這兩個(gè)例子同時(shí)也表明抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶具有較寬的底物專一性。,5）通過(guò)表達(dá)雜合基因方法的組合生物合成,第一個(gè)例子是應(yīng)用有些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素3位或糖基4位的羥基酰化酶基因，使某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在相應(yīng)的位置?；?1）異戊酰螺旋霉素（來(lái)自碳霉素的4”異戊酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的carE基因 ）； 2）丙酰螺旋霉

21、素（來(lái)自麥迪霉素的4”丙?；傅膍pt基因）； 3）乙酰泰樂(lè)菌素等（來(lái)自碳霉素的3O乙酰轉(zhuǎn)移酶的acyA基因）。,引入外源酶基因產(chǎn)生雜合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖,必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu),R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3,2、蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生菌的 組合生物合成（略）,蒽環(huán)類抗生素是一類臨床上非常重要的抗腫瘤抗生素，它們同樣是PKS生物合成途徑，因此，通過(guò)以下集中組合生物合成的方法，可以得到一系列“非天然的天然雜合化合物”。,1）通過(guò)

22、破壞靶基因的組合生物合成,通過(guò)基因框內(nèi)的誘變或缺失，或插入抗生素耐藥基因盒的方法，可以將所選擇的靶基因特異性地鈍化； 盡管靶基因的破壞可以得到新的化合物，但會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果，這是因?yàn)橐环矫嬗捎跇O性效應(yīng)影響下游基因的表達(dá)，另一方面受到由于外源DNA片斷的插入造成的反義RNA合成影響上游基因。,1）通過(guò)破壞靶基因的組合生物合成,在光神霉素（mithramycin）產(chǎn)生菌S.argillaceus中，破壞編碼葡萄糖1磷酸胸苷5三磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的基因mtmD后，獲得了兩個(gè)四環(huán)類的光神霉素衍生物：premithramycinone和4脫甲基premithramycinone衍生物； Premithram

23、ycinone的抗腫瘤生物活性與光神霉素相似，且有趣的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)與來(lái)源于黑曲霉A.niger的神經(jīng)肽受體抑制劑BMS非常相似，如圖所示。,通過(guò)基因破壞后得到的兩個(gè)光神霉素衍生物和BMS-192548,2）通過(guò)表達(dá)雜合基因方法的組合生物合成,來(lái)源于S.fradiae的urdE基因，編碼一種氧化酶，其可能涉及到將1分子氧引入到烏達(dá)霉素結(jié)構(gòu)中； 在控制啟動(dòng)子ermE的條件下，將其在丁省霉素C產(chǎn)生菌S.glaucescens中表達(dá)，產(chǎn)生一種新的雜合化合物，6羥基丁省霉素C，如圖所示。,通過(guò)將烏達(dá)霉素產(chǎn)生菌的urdE基因在丁省霉素C產(chǎn)生菌 中表達(dá)，得到一種雜合產(chǎn)物6羥基丁省霉素C,2）通過(guò)表達(dá)雜合基因

24、方法 的組合生物合成,另外一個(gè)實(shí)例是，將柔紅霉素產(chǎn)生菌S.peucetius中編碼11-aklavinone-羥化酶的基因（dnrF），在阿克拉霉素產(chǎn)生菌S.galilaeus中表達(dá)，結(jié)果得到了一種新的雜合化合物，11羥基阿克拉霉素A，如圖所示。 這種羥基化的產(chǎn)物，其對(duì)白血病細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的生物活性比阿克拉霉素要強(qiáng)。,雜合化合物11羥基阿克拉霉素A的組合生物合成,2）通過(guò)表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成,通過(guò)這種組合生物合成的方法，已經(jīng)獲得了數(shù)個(gè)雜合糖苷化的丁省霉素，如用含有一個(gè)完整埃羅霉素（elloramycin）基因簇（具有產(chǎn)生8去甲基丁省霉素C的能力）的黏粒轉(zhuǎn)化烏達(dá)霉素產(chǎn)生菌

25、或光神霉素產(chǎn)生菌，可以得到四種新的糖苷化合物：齊墩果糖基、鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和雙齊墩果糖基丁省霉素C，如圖所示。 有趣的是，這些脫氧糖在烏達(dá)霉素和光神霉素苷元上的附著位置，與在埃羅霉素的附著位置不同。表明，這些聚酮體的糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物寬泛性。,雜合糖苷化丁省霉素的組合生物合成,能夠被ElmGT糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的一些 糖基和elloramycin甙元的結(jié)構(gòu),,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,通過(guò)鈍化dnmV基因，得到一個(gè)柔紅霉素和阿霉素產(chǎn)生菌的阻斷突變株，dnmV基因編碼4酮基還原酶，其與合成這類抗生素結(jié)構(gòu)中的脫氧糖，柔毛霉胺的

26、合成有關(guān)。 分別將阿維菌素產(chǎn)生菌中編碼合成齊墩果糖的基因avrE，以及紅霉素產(chǎn)生菌中編碼合成mycarose的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻斷突變株中。 由于重組工程菌中的外源基因表達(dá)的4-酮基還原酶的特性與柔紅霉素產(chǎn)生菌中的4-酮基還原酶不同，前者具有非對(duì)映立體催化特性而能夠形成L-epidaunosamine（表柔毛霉氨）。而突變株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基轉(zhuǎn)移酶的能力仍然保持，且由于糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性較差而不影響將表柔毛霉氨連接在原來(lái)的蒽環(huán)酮上，從而得到4-表柔紅霉素和4-表阿霉素，如圖所示。,表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建,二、具有非核糖體生物合成肽類途徑的

27、微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成,具有非核糖體生物合成途徑（none ribosomal peptide synthases，NRPSs）的環(huán)肽或糖肽類“天然產(chǎn)物”，如萬(wàn)古霉素、博萊霉素、環(huán)孢菌素A和埃坡霉素等進(jìn)行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。,Chloroeremomycin 生物合成,（1）小分子準(zhǔn)備 在酶的催化下生成裝配過(guò)程中需要的小分子化合物，對(duì)于萬(wàn)古霉素族糖肽類抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L-b-epivancosamine； （2）裝配 上步準(zhǔn)備好的氨基酸通過(guò)腺苷化反應(yīng)（adenylation）轉(zhuǎn)換成為腺苷酸，而后與鄰近肽載體蛋白（peptide carrier

28、 protein, PCP）上的巰基形成硫酯（thiolation），PCP之間的縮合功能域（condensation）催化肽鍵形成。經(jīng)過(guò)幾個(gè)延伸過(guò)程，最后TE域?qū)⑼瓿傻碾那邢?。有時(shí)過(guò)程中還會(huì)有差向異構(gòu)作用(epimerisation)。 （3）裝配后修飾 在這步反應(yīng)中通常進(jìn)行氧化反應(yīng)和糖基化，對(duì)于有的化合物還存在N端甲基化反應(yīng)。,萬(wàn)古霉素的生物合成,另?yè)?jù)研究，天然的萬(wàn)古霉素生物合成共有35步，其先以五種自由的氨基酸單體合成一線形的七肽，然后芳基側(cè)鏈在交聯(lián)酶的催化下適時(shí)地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下連

29、接到七肽骨架上。,萬(wàn)古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體,萬(wàn)古霉素生物合成的逆向合成分析圖,在萬(wàn)古霉素家族中發(fā)現(xiàn)的糖基,GtfE糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并將UDP-glucose轉(zhuǎn)移至七肽骨架上,GtfD糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并將4epivancosamine連接至萬(wàn)古霉素骨架上,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,糖肽類抗生素的組合生物合成主要有4條途經(jīng): 第一，提供新的氨基酸單體，或者是利用已知生物合成途經(jīng)中的酶來(lái)催化生成新的我們所需要的氨基酸單體，使合成新的七肽骨架; 第二，改變七肽NRPS裝配線上的基因，從而達(dá)到重新設(shè)計(jì)生物合成途經(jīng)的目的; 第三，在七肽裝配之后，干預(yù)修飾酶（tailoring）

30、作用的步驟，包括N甲基化、酪氨酸的羥化等; 第四，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將不同結(jié)構(gòu)的糖基與不同苷元連接以及連接不同的個(gè)數(shù)，從而產(chǎn)生具有不同生理活性的最終產(chǎn)物。因此糖苷化酶可以作為一種制備各種不同糖苷化合物的催化劑，有可能從中找到具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新活性物質(zhì)。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Solenberg等從萬(wàn)古霉素產(chǎn)生菌東方擬無(wú)枝酸菌C329.4中克隆到了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE和gtfD，并從chloroeremomycin產(chǎn)生菌中克隆到了3個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfA、gtfB和gtfC; 將gtfB和gtfE在大腸埃希氏菌中表達(dá)，研究了其體外活性。結(jié)果表明當(dāng)TDP-葡萄糖存在時(shí)，從

31、大腸埃希氏菌中表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB和GtfE能夠在體外將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素糖苷上，從而得到中間體DVV（desvancosaminyl vancomycin）; 當(dāng)?shù)孜飺Q為UDP葡萄糖，UDP-D-木糖時(shí)，仍然能夠轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素糖苷上; GtfE也能夠?qū)DP/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到無(wú)糖基化的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能將化合物A47934糖基化，表明GtfE相對(duì)于GtfB底物特異性差。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,在Matsushima等建立地?zé)o糖基化合物A47934產(chǎn)生菌豐加鏈霉菌（Streptomyces toyocanesis）基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的基礎(chǔ)

32、上，Solenberg等還成功地將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE的質(zhì)粒導(dǎo)入到豐加鏈霉菌中，得到了糖基化的A47934衍生物。,GtfE和GtfB在體內(nèi)進(jìn)行的糖苷化反應(yīng),2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Losey等采用化學(xué)和酶法合成了很多NDP-葡萄糖的類似物來(lái)研究GtfD和GtfE的催化活性。結(jié)果表明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖類似物，TDP-葡萄糖類似物作為糖基供體，同時(shí)還可以采用脫氧葡萄糖類似物以及氨基在2、3、4、或6位的TDP/UDP-葡萄糖類似物作為糖基供體; 更值得注意的是，一般來(lái)講GtfD將vancosamine連接至萬(wàn)古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，試驗(yàn)結(jié)果表明GtfD

33、還可以將4-epi-vancosamine連接至GtfE以不同的糖基供體為底物所催化生成的衍生物上（糖基化位點(diǎn)在2-脫氧的除外）。這樣產(chǎn)生的帶有兩個(gè)氨基糖的萬(wàn)古霉素衍生物就提供了一種新的結(jié)構(gòu)，以便于繼續(xù)進(jìn)行類似于oritavancin的烷基化從而提高生物活性。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,Chen等從chloroeremomycin 的生物合成基因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，在大腸埃希氏菌中表達(dá)，并成功地在體外重建了從TDP-4-酮基-6-脫氧D-葡萄糖經(jīng)過(guò)C-2脫氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化(amination)、甲基化(met

34、hylation)、C-4酮基還原、C-5表構(gòu)異化等步驟得到了TDP-L epivancosamine。這個(gè)糖基的基因克隆和表達(dá)為以后組合生物合成提供了信息。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,對(duì)萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素進(jìn)行的組合生物合成，不單單可以通過(guò)外源添加不同的糖基供體，還可以通過(guò)將產(chǎn)生菌體內(nèi)原有的糖合成途徑進(jìn)行破壞或置換、以及對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行改造等改變糖基化方式產(chǎn)生新的化合物; 另外，對(duì)肽骨架裝配時(shí)所需的氨基酸生物合成的了解以及相關(guān)基因的分離和表達(dá)，也為萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成提供了有益的信息。,2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀,目前對(duì)于研發(fā)新的萬(wàn)古霉素等糖肽

35、類雜合抗生素主要集中在對(duì)糖基化方式的研究和改造，但至今為止絕大多數(shù)的研究是在大腸埃希氏菌中或在S. toyocanesis等鏈霉菌中進(jìn)行異源表達(dá); 美國(guó)Christopher領(lǐng)導(dǎo)的小組以及德國(guó)Wohlleben所領(lǐng)導(dǎo)的小組對(duì)萬(wàn)古霉素生物合成途徑中的很多酶進(jìn)行了體外表達(dá)，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)，立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成做了充分的準(zhǔn)備; 但目前在萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素產(chǎn)生菌體內(nèi)進(jìn)行組合生物合成還未見報(bào)道，關(guān)鍵可能是缺乏完善的擬無(wú)枝酸菌遺傳操作系統(tǒng)。,3、類胡蘿卜素的組合生物合成,作為抗氧化劑，類胡蘿卜素具有很大的藥物應(yīng)用前景，如已經(jīng)顯示這類化合物對(duì)心血管疾病和腫瘤具

36、有相當(dāng)?shù)寞熜? 迄今為止，已有600多種類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)被確證，但由于化學(xué)合成的困難，以及從微生物代謝產(chǎn)物和植物組織中分離困難而難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化; 但是，近年來(lái)發(fā)展的組合生物合成技術(shù)，有可能通過(guò)外源基因在E.coli中的雜合表達(dá)，來(lái)制備這些稀少的衍生物甚至產(chǎn)生新的類胡蘿卜素化合物。,第三節(jié) 組合生物催化與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),組合生物轉(zhuǎn)化（催化）（combinatorial biocatalysis）,是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的微生物或酶，對(duì)同一個(gè)母體化合物進(jìn)行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡(jiǎn)單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段; 從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡(jiǎn)單和有效; 這是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。,模擬生物體的生命過(guò)程，利用組合生物催化技術(shù)構(gòu)建先導(dǎo)化合物庫(kù),可用于組合合成的生物催化反應(yīng),利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性,可能進(jìn)行反應(yīng)的范圍廣； 能夠定向進(jìn)行區(qū)域選擇性和立體選擇性； 不需基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)，一步實(shí)現(xiàn)所需的反應(yīng)； 在溫和和均一的條件下可容易地實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和一 步反應(yīng)的重現(xiàn)性； 溫和的反應(yīng)條件復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性； 高的催化活性可以降低催化劑的用量； 酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用； 生物催化劑在環(huán)境中完全被降解。,生物催化產(chǎn)生的分子庫(kù),矮茶素的組合生物催化,謝謝大家！,