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1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題,,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題,電泳技術(shù)簡(jiǎn)介,什么是電泳技術(shù)？ 電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。,電泳技術(shù)的分類,電泳法可分為自由電泳（無(wú)支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。 自由電泳包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。 區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠

2、性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。,凝膠電泳技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理,瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。,瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理,DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同D

3、NA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。,瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別,瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。 在瓊脂糖制備過(guò)程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團(tuán)，就會(huì)造成電內(nèi)滲，

4、電內(nèi)滲對(duì)質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。 簡(jiǎn)言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細(xì)提取的，有自身獨(dú)特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。,瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn),瓊脂糖凝膠的配置,1.根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。 2.根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的50%容量。 3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖

5、像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。,瓊脂糖凝膠的配置,3.使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見(jiàn)光下會(huì)分解。 5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(60)，會(huì)使得水分過(guò)分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。 6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注意： 凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜

6、將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存25 天。,瓊脂糖凝膠緩沖液,有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳 Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液） Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE),瓊脂糖凝膠緩沖液,瓊脂糖凝膠緩沖液,瓊脂糖凝膠緩沖液,TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。 電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,載樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的

7、。載樣緩沖液有三個(gè)作用： 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)； 使樣品帶有顏色便于上樣操作； 其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。 上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無(wú)關(guān)； 在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,瓊脂糖凝膠的濃度,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,瓊脂糖凝膠的濃度,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析,DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析,DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析,