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1、乙型肝炎病毒cccDNA 檢測(cè)方法與應(yīng)用價(jià)值,,一、幾個(gè)相關(guān)問(wèn)題簡(jiǎn)介,什么是HBV cccDNA?,即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）進(jìn)入細(xì)胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓?fù)涿傅取靶迯?fù)”形成的、結(jié)構(gòu)完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。,乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖,乙型肝炎病毒的復(fù)制過(guò)程,我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBV cccDNA?, cccDNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，成為乙肝病毒的復(fù)制“池” 目前尚沒(méi)有可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并能夠清除cccDNA 的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治

2、療效果不佳和治 療后容易復(fù)發(fā)的原因之一 肝臟以外器官組織細(xì)胞可能存在cccDNA，成為肝臟 移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來(lái)源 還沒(méi)有穩(wěn)定、可靠、敏感的cccDNA檢測(cè)試劑盒問(wèn)世,為什么沒(méi)有cccDNA檢測(cè)試劑盒問(wèn)世?,,研究和開(kāi)發(fā)該檢測(cè)技術(shù)的時(shí)間不長(zhǎng) 檢測(cè)技術(shù)上的難度較大 前期研究主要集中于細(xì)胞模型和動(dòng)物肝臟 模，不能滿足臨床檢驗(yàn)的需求 現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，檢測(cè)低限104 copy /ml左右 分研究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對(duì)檢測(cè)技術(shù)的特異性認(rèn) 識(shí)不足，存在缺陷,,多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必須有 效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA 如何

3、進(jìn)一步解決特異性的問(wèn)題？ 如何解決靈敏度不高的問(wèn)題（細(xì)胞內(nèi)cccDNA 含量的較低），血清中含量？ 如何簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟？,建立cccDNA檢測(cè)技術(shù)必須克服的難點(diǎn),分離cccDNA和rcDNA的分子基礎(chǔ),分離cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差異,二、HBV cccDNA檢測(cè)技術(shù),,1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR) 2.侵入者探針?lè)ǎ↖nvader assaay） 3.嵌合引物熒光PCR法,現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介,,現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介,選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR) 2.侵入者探針?lè)ǎ↖nvader assaay） 3

4、.嵌合引物熒光PCR法,設(shè)計(jì)一對(duì)特殊引物：跨雙缺口引物 正義引物P1 ：與負(fù)鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于正 鏈缺口上游 反義引物P2 ：與正鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于負(fù) 鏈缺口下游 目的：rcDNA不被擴(kuò)增,1.選擇性PCR,選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增,選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物自身退火（self annealing）,“選擇性”P(pán)CR：并非萬(wàn)無(wú)一失,rcDNA被大量擴(kuò)增，陽(yáng)性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可靠 Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):

5、82-85(血清),Kock等：反應(yīng)管中rcDNA含量不能超過(guò)105copy Hepatology 1996;23:405-413,血清HBV rcDNA超過(guò)108copy/ml，進(jìn)行熒光PCR可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性,“選擇性”P(pán)CR：并非萬(wàn)無(wú)一失,與定性法比較增加了一個(gè)熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（負(fù)鏈缺口下游），與cccDNA的負(fù)鏈互補(bǔ)。,選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,rcDNA不能被擴(kuò)增 無(wú)熒光信號(hào),EcoR I,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5,+,P1,P2,3200(1),,5,,,,,,,

6、,,3,,,,,,,,,,,,1590,,,,,3,,1820,,,P1,,,,1820,1590,,+,3200（1）,,,,,EcoR I,,P2,cccDNA能被擴(kuò)增 檢測(cè)到熒光信號(hào),選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相關(guān)指數(shù)： R2=0.995 靈敏度至少可以達(dá)到103copy/ml,結(jié)果 ：,選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA 非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題 由于靈敏度較普通PCR高，假陽(yáng)性率比

7、普 通PCR更高,缺陷：,選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,解決方案,特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或質(zhì)粒抽提試劑盒抽提法 酶切純化cccDNA 采用綠豆核酸酶或ATP依賴的plasmid-safe DNA酶,選擇性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA,,1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR) 侵入者探針?lè)ǎ↖nvader assaay） 3.嵌合引物熒光PCR法,現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介,2.侵入者探針?lè)?Invader assay),兩個(gè)體系： 兩種特殊的探針：invader prob

8、e和primary probe，后者含與待測(cè)模板無(wú)關(guān)的5側(cè)翼的堿基片段。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：被核酸內(nèi)切酶 (cleavase,裂解酶)特異地切割5側(cè)翼堿基片段作為第二個(gè)invader，與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒（FRETC）結(jié)合，裂解酶切割FRETC上含有熒光基團(tuán)的短臂，發(fā)出熒光信號(hào)。 特點(diǎn)：一個(gè)模板可以重復(fù)使用，每“結(jié)合裂解結(jié)合裂解”一次為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)生一個(gè)熒光信號(hào)，呈線性信號(hào)放大,侵入者探針?lè)ǘ繖z測(cè)cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：線性信號(hào)放大，特異性比熒光 PCR法強(qiáng) 缺點(diǎn)：靈敏度低：104copy/ml,,1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR) 2.侵入者分析法

9、（Invader assaay） 嵌合引物熒光PCR法,現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介,3. 嵌合引物熒光PCR法,Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52,,N：與HBVDNA非同源片段,rcDNA,cccDNA,3. 嵌合引物熒光PCR法,嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部分缺陷，靈敏 度比侵入法提高 缺點(diǎn)：仍不能完全避免待測(cè)標(biāo)本中存在的 rcDNA被非特異性擴(kuò)增,無(wú)論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針?lè)ɑ蚯逗弦餆晒釶CR，本身都不能解決在高rcDNA背景條件下的假陽(yáng)性問(wèn)題，必須結(jié)合抽提分離、酶切純化等步驟

10、，以提高特異性。,三、影響cccDNA池的因素,1.cccDNA池的自身恒定, cccDNA池：感染肝細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA的 含量在無(wú)外來(lái)干擾的情況下保 持恒定(550copy/cell) 病毒自身調(diào)節(jié)：關(guān)于病毒的進(jìn)化 關(guān)于病毒的“思維” 病毒自身的調(diào)節(jié) 外來(lái)壓力：打破病毒含量自身恒定的結(jié)果,2.抗病毒藥物對(duì)cccDNA的影響,現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素和各種核苷類似物，可以一過(guò)性地減少cccDNA，但均不能清除cccDNA 細(xì)胞核內(nèi)cccDNA含量的相對(duì)穩(wěn)定性，決定了長(zhǎng)療程抗病毒治療的必要性,3.肝外組織也是cccDNA的儲(chǔ)存池？,肝外組織細(xì)胞中HBV標(biāo)志的存在情況： 腎、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃腸黏 膜、皮膚、睪丸、前列腺、唾液腺 等組織或細(xì)胞中均檢測(cè)到HBV的標(biāo)志物 HBV吸附？暫居？建立感染狀態(tài)？ 依據(jù)：從上述組織細(xì)胞中檢測(cè)到cccDNA， 但必須解決檢測(cè)技術(shù)問(wèn)題,(2)關(guān)于血清中是否存在cccDNA的問(wèn)題, “血清中rcDNA含量越高，cccDNA陽(yáng)性率 越高和含量越高”的現(xiàn)象，使我們對(duì)方法 學(xué)提出質(zhì)疑 肝衰竭的病人在一定病期有可能大量釋放 cccDNA入血 細(xì)胞壞死后，cccDNA釋放入血是必然的， 但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 時(shí)間？,Thank you,