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1、第第 3 章章n動物細胞與組織培養(yǎng)動物細胞與組織培養(yǎng)動物的細胞與組織培養(yǎng) 定義：從動物體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理環(huán)境，在體外建立無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）Definitions of Tissue Culture Termsncell culture-the maintenance and growing of dispersed cells outside the organism.nSecondary cultureCells taken from a primary culture and passed

2、 or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages.ntissue culture-the maintenance of a tissue or fragment in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function nmonolayer-single layer of cells growing on a surfacenorgan culture-mai

3、ntenance of tissues,whole or parts of organs in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or functionnexplant-an excised fragment of an organ which usually retains some degree of tissue architecture2 發(fā)展歷史發(fā)展歷史n動物細胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于動物細胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)起源于1919世紀所應(yīng)用的某些胚胎世紀所應(yīng)用的某些胚胎學(xué)

4、技術(shù)。學(xué)技術(shù)。n動物細胞（組織）培養(yǎng)的奠基人是美國生物學(xué)家動物細胞（組織）培養(yǎng)的奠基人是美國生物學(xué)家HarrisonHarrison。在在19071907年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)年采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時間，并觀察到細胞組織培養(yǎng)在淋巴液中，保持存活了幾周時間，并觀察到細胞突起的生長過程。突起的生長過程。nHarrison-isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres-grew them in frog lymph

5、-observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.n法國學(xué)者法國學(xué)者CarrelCarrel功不可沒。他功不可沒。他19231923年設(shè)計的卡氏培養(yǎng)瓶，用年設(shè)計的卡氏培養(yǎng)瓶，用雞胚抽提液培養(yǎng)心肌組織取得成功并維持雞胚抽提液培養(yǎng)心肌組織取得成功并維持3434年之久年之久,特別注特別注意到實驗中的無菌操作。意到實驗中的無菌操作。Henrietta Lacks,American black,died of cancer of uterine cervix in 1951 3 應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域n生產(chǎn)單克隆抗體和疫苗。生產(chǎn)單克隆抗體和疫苗

6、。n組織與器官再生、培養(yǎng)。組織與器官再生、培養(yǎng)。n動物細胞基因工程動物細胞基因工程動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品 n（1 1）病毒疫苗：病毒疫苗：乙肝疫苗乙肝疫苗(HbsAg)(HbsAg)、脊髓灰、脊髓灰 質(zhì)炎疫苗質(zhì)炎疫苗(Polio)(Polio)、狂犬疫苗、狂犬疫苗(Rabies)(Rabies)等。等。n（2 2）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素（干擾素（IFN IFN）、）、白細胞介素（白細胞介素（IL IL）、）、B B 細胞生長因子細胞生長因子 （BCGF BCGF）、巨噬細胞激活因子（）、巨噬細胞激活因子（MANMAN）T T 細胞替代因子（細胞

7、替代因子（TRFTRF）等。）等。n（3 3）多肽生長因子：多肽生長因子：神經(jīng)生長因子（神經(jīng)生長因子（NGF NGF）、）、成纖維細胞生長因子（成纖維細胞生長因子（FGFFGF）、表皮生長因）、表皮生長因 子（子（EGFEGF）、血清生長因子（）、血清生長因子（SFSF）等。）等。n（4 4）酶類：酶類：組織血纖維溶酶原激活劑（組織血纖維溶酶原激活劑（t tPA PA）等。）等。n（5 5）激素：激素：紅細胞生成素（紅細胞生成素（EPOEPO）、促黃體生）、促黃體生成素（成素（LHLH）、促濾胞素（）、促濾胞素（FSHFSH）等。）等。n（6 6）腫瘤特異性抗原：腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（癌胚

8、抗原（CEACEA）等。）等。n（7 7）單克隆抗體單克隆抗體（MCAB MCAB）。）。n（8 8）病毒殺蟲劑：病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。桿狀病毒等。n（9 9）皮膚移植：皮膚移植：單細胞培養(yǎng)等。單細胞培養(yǎng)等。n3.1.1 動物細胞的特點動物細胞的特點n問題一問題一n與微生物、植物細胞相比，動物細胞有哪與微生物、植物細胞相比，動物細胞有哪些特殊之處？些特殊之處？動物細胞與微生物細胞相比，主要有以動物細胞與微生物細胞相比，主要有以下不同：下不同：n（1 1）動物細胞比微生物細胞）動物細胞比微生物細胞大大，無細胞壁無細胞壁。n（2 2）動物細胞倍增時間長，）動物細胞倍增時間長，生長緩慢生長緩慢，易

9、易 受污染受污染。n（3 3）培養(yǎng)過程）培養(yǎng)過程需氧量少需氧量少，對機械攪拌或，對機械攪拌或剪剪 切力敏感切力敏感。n（4 4）動物細胞間主要以）動物細胞間主要以聚集體形式聚集體形式存在。存在。n（5 5）原代細胞一般繁殖）原代細胞一般繁殖5050代代左右即退化左右即退化 死亡。死亡。3.1.2 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）（亦稱初代培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。（亦稱繼代培養(yǎng)）。Primary Cultureretention of the 3D shapeoutgrowth and migration of cells3.1.3 動物細胞（組織）培養(yǎng)的生長特

10、性動物細胞（組織）培養(yǎng)的生長特性 n體外培養(yǎng)細胞類型體外培養(yǎng)細胞類型1 1 粘附型細胞粘附型細胞 anchorageanchoragedependentdependent n粘附生長粘附生長是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細發(fā)育的基本存在方式。粘附有兩種含義：一是細胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質(zhì)結(jié)合。胞之間相互接觸；二是細胞與細胞外基質(zhì)結(jié)合。n動物細胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細胞是必須附動物細胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當(dāng)細胞布滿表面后即壁即附著在固體表面生長，當(dāng)細胞布滿表面后即停止

11、生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上停止生長，這時若取走一片細胞，存留在表面上的細胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面的細胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面,稱為稱為單層附壁培養(yǎng)單層附壁培養(yǎng)。細胞貼壁延展過程細胞貼壁延展過程Contact inhibitionWhen cells contact each other,they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.體外培養(yǎng)細

12、胞類型（形態(tài)）體外培養(yǎng)細胞類型（形態(tài)）n1 成纖維型成纖維型n2 上皮型上皮型n3 游走型游走型n4 多形型多形型（一）成纖維細胞型細胞（一）成纖維細胞型細胞 FibroblastFibroblastn外形與體內(nèi)外形與體內(nèi)成纖維成纖維細胞形狀相細胞形狀相似，細胞大致呈似，細胞大致呈梭形或不規(guī)則梭形或不規(guī)則形形。前者貼壁后呈長梭形，圓。前者貼壁后呈長梭形，圓形細胞核位于中央，胞質(zhì)外伸形細胞核位于中央，胞質(zhì)外伸出出2 23 3個長短不同的突起，生個長短不同的突起，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。長時呈放射狀、漩渦狀走向。n多數(shù)細胞之間多數(shù)細胞之間排列疏散排列疏散，有較，有較大的細胞間隙。有時也相互平大

13、的細胞間隙。有時也相互平行排列，成群細胞呈現(xiàn)行排列，成群細胞呈現(xiàn)放射狀、放射狀、旋渦狀旋渦狀等形式。心肌，平滑肌、等形式。心肌，平滑肌、血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)常呈血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)常呈此類型。此類型。（二）上皮型細胞（二）上皮型細胞 Epithelial celln類似上皮細胞的細胞，特類似上皮細胞的細胞，特點是：點是：扁平扁平狀，形態(tài)較為狀，形態(tài)較為規(guī)則規(guī)則，細胞貼壁后呈，細胞貼壁后呈三角三角形形及不規(guī)則扁平的及不規(guī)則扁平的多角形多角形，中央有扁圓形核，生長時中央有扁圓形核，生長時彼此彼此緊密緊密連接成單層細胞。連接成單層細胞。因為相互擁擠而呈現(xiàn)因為相互擁擠而呈現(xiàn)“鋪鋪路石狀路石狀”。n

14、皮膚的表皮細胞、消化道皮膚的表皮細胞、消化道與呼吸道的上皮細胞、肺與呼吸道的上皮細胞、肺泡上皮細胞、消化腺上皮泡上皮細胞、消化腺上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞等，細胞、血管內(nèi)皮細胞等，HelaHela（三）游走型細胞（三）游走型細胞 wanderingn分散生長，一般不連接成片形成群分散生長，一般不連接成片形成群落；細胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；落；細胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長位置不固定，在培養(yǎng)器皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則。且方向不規(guī)則。n該類細胞不穩(wěn)定，該類細胞不穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不外形不規(guī)則且不斷變化斷變化，當(dāng)細胞密度

15、增大、連接成，當(dāng)細胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細胞型片時，形狀類似于成纖維樣細胞型或上皮細胞型?；蛏掀ぜ毎?。n表現(xiàn)這種細胞形態(tài)的主要是單核巨表現(xiàn)這種細胞形態(tài)的主要是單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，如顆粒性白細噬細胞系統(tǒng)的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、某些腫瘤細胞等。胞、某些腫瘤細胞等。（四）多形型細胞（四）多形型細胞 Polymorphicn多形型細胞是一些形態(tài)多形型細胞是一些形態(tài)上上不規(guī)則不規(guī)則的細胞。的細胞。n多形型細胞不常見，只多形型細胞不常見，只有某些像神經(jīng)組織細胞有某些像神經(jīng)組織細胞等等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的

16、，才可歸于多形細胞。的，才可歸于多形細胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細胞的細胞最常見的是胞的細胞最常見的是神神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。影響細胞形態(tài)的因素影響細胞形態(tài)的因素n能夠影響細胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括：能夠影響細胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括：血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)血清成分、培養(yǎng)基成分及添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。例如，等。例如，一些已分化的細胞在有無血清的培養(yǎng)液中一些已分化的細胞在有無血清的培養(yǎng)液中生長，形態(tài)特征就會有所差異。生長，形態(tài)特征就會有所差異。n形態(tài)會因條件而改變（來源、生長條件和形態(tài)會因條件而改

17、變（來源、生長條件和功能狀態(tài)不同）。功能狀態(tài)不同）。2 非粘附型細胞（懸浮型細胞）非粘附型細胞（懸浮型細胞）n體外生長不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因體外生長不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因此也叫此也叫懸浮懸浮型細胞。型細胞。n一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細胞或微一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細胞或微生物，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生物，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。血液白細胞、淋巴組織細胞，某些腫瘤生長。血液白細胞、淋巴組織細胞，某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系等都屬此類細細胞、雜交瘤細胞、轉(zhuǎn)化細胞系等都屬此類細胞。這類細胞形態(tài)學(xué)特點是胞體始終為胞。這類細胞形態(tài)學(xué)

18、特點是胞體始終為球形球形。n懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，細胞密度一般都較高，培是懸浮生長，細胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易。養(yǎng)的效率也高、操作也容易。n這種方法有多方面的優(yōu)越性，易于大規(guī)這種方法有多方面的優(yōu)越性，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制。模生產(chǎn)，便于過程的控制。n可惜能在懸浮狀態(tài)下生長的細胞可惜能在懸浮狀態(tài)下生長的細胞種類有種類有限限，且不太方便觀察。，且不太方便觀察。3.2 動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 的基本技術(shù)的基本技術(shù)3.2.1 體外培養(yǎng)的條件體外培養(yǎng)的條件3.2.1.1 與微生物細胞培養(yǎng)相比動物與微生物細胞培養(yǎng)相比動

19、物 細胞培養(yǎng)的特殊性細胞培養(yǎng)的特殊性n大多數(shù)哺乳動物細胞只有大多數(shù)哺乳動物細胞只有附著附著在固在固體或半固體的表面才能生長。體或半固體的表面才能生長。n動物細胞對于動物細胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要或半乳糖外，還需要血清血清。n對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對環(huán)境極其對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對環(huán)境極其敏敏感感，包括，包括 pH pH、溶解氧、溫度、剪切力等都、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴格監(jiān)控。比微生物有更高的要求，一般需嚴格監(jiān)控。n動物細胞動物細胞生長緩慢生長緩慢，因此培養(yǎng)時間較

20、長。，因此培養(yǎng)時間較長。n對環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空對環(huán)境的影響又比微生物為大，因此常用空氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進行供氧氣、氧、二氧化碳和氮的混合氣體進行供氧和調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)pHpH。培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件TemperaturepHDissolved gasNutrients培養(yǎng)基培養(yǎng)基n2020世紀世紀4040年代以后，從事動物組織培養(yǎng)的年代以后，從事動物組織培養(yǎng)的各國科學(xué)家把研究的重點集中在培養(yǎng)基的各國科學(xué)家把研究的重點集中在培養(yǎng)基的改造上。改造上。n19511951年，年，Earle等人開發(fā)了供動物細胞體等人開發(fā)了供動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。MediaThe c

21、hoice of media is cell type specific and often empirical-no all purpose medium.Should provide:nutrients,buffering capacity,isotonic,and be sterile天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基n動物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等動物血清、組織提取液、雞胚胎提取液等n優(yōu)點優(yōu)點：營養(yǎng)價值高：營養(yǎng)價值高n缺點缺點：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高n?。ㄌィ┡Ｑ逍。ㄌィ┡Ｑ宓鞍踪|(zhì)、氨基酸、葡蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、多種生長因子萄糖、激素、多種生長

22、因子等成分。等成分。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基nEarle 于于1951年首次使用。年首次使用。n優(yōu)點優(yōu)點：成分已知、易控制：成分已知、易控制n缺點缺點：無法替代一些未知成分：無法替代一些未知成分n解決途徑解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血合成培養(yǎng)基中添加小牛血 清，彼此互補清，彼此互補無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基n血清培養(yǎng)基的優(yōu)點血清培養(yǎng)基的優(yōu)點：含有豐富的利于細胞：含有豐富的利于細胞生長的成分生長的成分n血清培養(yǎng)基缺點血清培養(yǎng)基缺點：對后期產(chǎn)物的分離、提：對后期產(chǎn)物的分離、提純及檢測造成干擾。來源有限、成本較高純及檢測造成干擾。來源有限、成本較高n無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基：試圖全部替代血清成分，：試圖全

23、部替代血清成分，尤其是生長因子（例如胰島素）、激素尤其是生長因子（例如胰島素）、激素（例如生長激素）等。（例如生長激素）等。培養(yǎng)過程圖解培養(yǎng)過程圖解細胞系生長過程的細胞系生長過程的3個主要階段個主要階段（一）原代（初代）培養(yǎng)期（一）原代（初代）培養(yǎng)期 n指從體內(nèi)指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個階段，培養(yǎng)這個階段，一般持續(xù)一般持續(xù)1-4周。在這個階段，細胞比較活躍，有細胞分周。在這個階段，細胞比較活躍，有細胞分裂，但不旺盛。裂，但不旺盛。n組織和細胞剛離體，生物學(xué)特性變化不大，具有二倍體遺組織和細胞剛離體，生物學(xué)特性變化不大，具有二倍體遺傳特性，最接近和反

24、映體內(nèi)生長特性，很適合做藥物測試，傳特性，最接近和反映體內(nèi)生長特性，很適合做藥物測試，細胞分化等實驗研究。細胞分化等實驗研究。（二）傳代期（二）傳代期 n原代培養(yǎng)細胞原代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代一經(jīng)傳代后便稱為細胞系，在全生后便稱為細胞系，在全生命期中該階段的持續(xù)時間最長。一般情況下，當(dāng)命期中該階段的持續(xù)時間最長。一般情況下，當(dāng)傳代傳代10-5010-50次后，細胞增殖逐漸緩慢，以致完全次后，細胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。停止。（三）衰退期（三）衰退期 n該階段細胞仍然生存，但是增殖很慢或不該階段細胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細胞形態(tài)輪廓增強，最后開始衰退增殖。細胞形態(tài)輪廓增強，最后開始衰退凋

25、亡凋亡。動物細胞培養(yǎng)過程生長曲線Kinetics of growth phaseLogarithmic scale!Cells reach confluence(cover all available surface)每代細胞的生長曲線：潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）每代貼附生長細胞的生長過程每代貼附生長細胞的生長過程分為以下幾個時期n游離期n貼壁期n潛伏期n對數(shù)生長期n停止期（平臺期）n游離期：游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時n貼壁期：貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、

26、塑料、其它細胞等n 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團）n潛伏期潛伏期:此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為624小時。對數(shù)生長期：對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。n停止期（平臺期）停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂n 機制：接觸抑制、密度依賴性小結(jié)小結(jié)n動物細胞培養(yǎng)的特點n無血清培養(yǎng)基在實驗研究中的特殊意義n細胞類型及生長特點n細胞系生長階段和各階段特點n細

27、胞系生長曲線及各期特點動物細胞培養(yǎng)技術(shù)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)2常用的培養(yǎng)方法常用的培養(yǎng)方法n懸滴培養(yǎng)Hangingdrop cultivationn培養(yǎng)瓶培養(yǎng)n旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)Rotate tube cultivationn克隆培養(yǎng)法Cloning culture techniquen細胞同步化培養(yǎng)n動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) 分批式batch，流加式fedbatch，半連續(xù)式semicontinuous，連續(xù)式，灌流式perfusion 三三 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 1取材取材TrypsinEDTAcollagenase取材部位是否準確組織是否保持活性材料處理是否恰當(dāng)2 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)

28、組織塊培養(yǎng)3 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)消化法消化法一般傳代培養(yǎng)的步驟一般傳代培養(yǎng)的步驟 n(1)(1)吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。n(2)(2)加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混合液蓋滿瓶底?；旌弦荷w滿瓶底。n(3)(3)2 25 5分鐘后檢查，如有細胞間隙變大，細分鐘后檢查，如有細胞間隙變大，細 胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化。n(4)(4)吸出消化液，加入吸出消化液，加入PBSPBS液，輕輕轉(zhuǎn)動以液，輕輕轉(zhuǎn)動以 免細胞流失，洗去殘留的消化液。如果單免細胞流失，洗去殘留的消化液。如果單 用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。n(5)(

29、5)用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落制成懸用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落制成懸 液，計數(shù)后記錄其濃度。液，計數(shù)后記錄其濃度。（6 6）重新接種培養(yǎng)。）重新接種培養(yǎng)。四四 建立細胞系過程建立細胞系過程腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程n以人上皮型食管癌以人上皮型食管癌109細胞系的建立細胞系的建立為為例介紹一下具體的建系過程：例介紹一下具體的建系過程：（1）取材）取材n食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本（2）原代培養(yǎng)）原代培養(yǎng)n1）食管腫物組織放入含青霉素和鏈霉素的食管腫物組織放入含青霉素和鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，于培養(yǎng)液內(nèi)，于4下靜置下靜置2小小 時。時

30、。n2）然后將組織剪切成然后將組織剪切成1-2mm3的小塊。用含的小塊。用含 青霉素和鏈霉素的青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液洗培養(yǎng)液洗 滌后，接種于預(yù)先涂有鼠尾膠原的玻璃培滌后，接種于預(yù)先涂有鼠尾膠原的玻璃培 養(yǎng)瓶中。養(yǎng)瓶中。n3）于于37、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時后，再小時后，再 補加含補加含20%的小牛血清的的小牛血清的RPMI 1640培培 養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（3）建系過程）建系過程n組織塊在接種組織塊在接種1 1周后，周后，上皮細胞上皮細胞從組織塊周圍向外從組織塊周圍向外迅速遷移和生長，相互連接成片。迅速遷移和生長，相互連接成片。2 2周后，可以見周

31、后，可以見到到成纖維細胞成纖維細胞生長。生長。8 8周后，上皮細胞生長開始明周后，上皮細胞生長開始明顯加快，并向周圍延伸。顯加快，并向周圍延伸。n用胰蛋白酶消化法和刮脫法等手段除掉成纖維細用胰蛋白酶消化法和刮脫法等手段除掉成纖維細胞胞。這樣處理后的細胞在傳代三次后，貼壁生長。這樣處理后的細胞在傳代三次后，貼壁生長的細胞呈現(xiàn)上皮狀，核清晰可見核仁。的細胞呈現(xiàn)上皮狀，核清晰可見核仁。2 2周后細胞周后細胞形成群落。第形成群落。第4 4代后細胞開始呈單層生長，命名為代后細胞開始呈單層生長，命名為ECA109ECA109。ECA109 ECA109 經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細胞經(jīng)生物學(xué)特性分析后確定細胞

32、系建立成功系建立成功建立細胞系的要求建立細胞系的要求n國際上對Certified cell的確定尚無統(tǒng)一標(biāo)準n1 組織來源n2 細胞生物學(xué)檢測：形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細胞生長曲線，分裂指數(shù)，接種率，特異性如腺細胞，腫瘤細胞n3 培養(yǎng)條件和方法細胞系和細胞株鑒定n鑒定指標(biāo)：純度，細胞學(xué)特性，穩(wěn)定性，污染情況n鑒定方法：細胞形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長曲線，計算分裂指數(shù)，染色體組型和帶型分析，同工酶酶譜檢測n檔案資料及管理使用：美國標(biāo)準細胞庫ATCC,人遺傳突變細胞庫HGMR,細胞衰老細胞庫CAR細胞計數(shù)細胞計數(shù)n四角大方格內(nèi)細胞數(shù)平均，若壓中線者，只計算壓左線和上線邊的細胞。n細胞密度個/ml平均細胞數(shù)x10

33、3x稀釋倍數(shù)培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。細胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的?；罴毎抢щy的。1 細胞克隆形成率實驗細胞克隆形成率實驗 單個細胞在體外增殖單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆。見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰?克隆形成率比克隆形成率比克隆形成克隆形成數(shù)接種細胞

34、數(shù)數(shù)接種細胞數(shù) 缺點：操作繁瑣缺點：操作繁瑣 優(yōu)點：精確、可靠優(yōu)點：精確、可靠2.臺盼藍法臺盼藍法n活細胞不被染色，死細胞染成藍色，活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力胞活力 3 四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）商品名為噻唑藍，）商品名為噻唑藍，原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)formazan)，并沉淀在細胞，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜

35、（DMSODMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的深淺與所含的formazanformazan量成正比。再用酶標(biāo)儀量成正比。再用酶標(biāo)儀測定測定ODOD值值 MTTMTT法簡單快速準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩法簡單快速準確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。n （1 1）單細胞懸液接種于）單細胞懸液接種于9696孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；10103 3-10-104 4 細胞細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量孔，每孔培養(yǎng)基總量200ul200ul（9696孔培養(yǎng)板每孔培養(yǎng)板每孔容積孔容積370u

36、l370ul），），3737、5 5COCO2 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）n （2 2）加入）加入2mg2mgmlml的的MTTMTT液（液（50ul50ul孔）；孔）；繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)3 3小時。小時。n （3 3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSODMSO液液（150ul150ul孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩振蕩1010分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。n （4 4）酶標(biāo)儀檢測各孔）酶標(biāo)儀檢測各孔ODOD值（檢測波長值（檢測波長570nm570nm），記

37、錄結(jié)果，繪制生長曲線。），記錄結(jié)果，繪制生長曲線。操作步驟操作步驟:細胞凍存和復(fù)蘇細胞凍存和復(fù)蘇n細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學(xué)特性變化。減少細胞生物學(xué)特性變化。液氮罐CryopreservationHow does freezing induce damage?cool too fast formation of ice crystals inside the cell cool too slow hypertonic ext

38、racellular solution dehydration transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth Thawing rate is also important(thaw rapidly)最適度以下的最適度以上的慢凍程序慢凍程序n標(biāo)準程序：標(biāo)準程序：n 當(dāng)溫度在當(dāng)溫度在-25 以上時，以上時，12/minn 當(dāng)溫度達當(dāng)溫度達-25 以下時，以下時，510/minn 當(dāng)溫度達當(dāng)溫度達-100時，可迅速放入液氮中細胞凍存器時，可迅速放入液氮中細胞凍存器n

39、簡易程序：簡易程序：n 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以系以線繩，通過線繩將線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降分鐘溫度下降12 的速度，在的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表分鐘內(nèi)降至液氮表面，停面，停30分鐘后，直接投人液氮中。分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護劑的應(yīng)用低溫保護劑的應(yīng)用n在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。效果。n常用的低溫保護劑是常用的低溫保護劑是DMSODMSO，它是一種滲透性保，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜

40、對水的通透護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存方法細胞凍存方法n1 預(yù)先配制凍存液：預(yù)先配制凍存液：含含20%血清培養(yǎng)基血清培養(yǎng)基 10%DMSO n2 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入 適量凍存液適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液用吸管吹打制成細胞懸液 （1106 5 106細胞細胞/ml)n3 加入加入1m

41、l細胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷細胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷 凍細胞名凍細胞名稱和冷凍日期。稱和冷凍日期。n4 存活率可達存活率可達80一一90。DMSO液用培液用培 養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害 細胞。細胞。細胞復(fù)蘇方法細胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 38 水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1分鐘左右）。分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍倍 以上。以上。（3）低速離心）低速離心10分鐘。分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培

42、養(yǎng)剛復(fù)蘇的細 胞。胞。五五 動動物細胞物細胞大規(guī)模大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)1 基本基本流程流程2 生物反應(yīng)器系統(tǒng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)（1）生物反應(yīng)器）生物反應(yīng)器設(shè)計依據(jù)n除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計原則應(yīng)該物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計原則應(yīng)該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。由于動物細胞生長的特殊性，如貼壁、脆由于動物細胞生長的特殊性，如貼壁、脆弱等，與微生物細胞培養(yǎng)不同，需要特別弱等，與微生物細胞培養(yǎng)不同，需要特別注意反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計以及特殊載體的選擇。注意反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計以及特殊載體的選擇。（2）

43、分類）分類n一般有微載體式、中空纖維式、一般有微載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等幾種新灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等幾種新型的反應(yīng)器等型的反應(yīng)器等。（3）動物細胞培養(yǎng)的載體動物細胞培養(yǎng)的載體實現(xiàn)規(guī)模化急需解決的問題實現(xiàn)規(guī)?；毙杞鉀Q的問題 問題一問題一 細胞貼壁生長的載體細胞貼壁生長的載體微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)技術(shù)n1967年，年，Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細胞。養(yǎng)貼壁細胞。n微載體是直徑微載體是直徑60-250m的微珠。多用帶不的微珠。多用帶不同基團的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其同基團的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細胞的貼壁帶有

44、適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細胞的貼壁及生長。及生長。*貼壁培養(yǎng)的載體材料貼壁培養(yǎng)的載體材料 與生物反應(yīng)器系統(tǒng)與生物反應(yīng)器系統(tǒng)n主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體微載體系統(tǒng)系統(tǒng)等。等。n后者是一重要技術(shù)，包括微載體、多空載后者是一重要技術(shù)，包括微載體、多空載體、微囊體、微囊*一種微載體產(chǎn)品及孔狀的顯微結(jié)構(gòu)一種微載體產(chǎn)品及孔狀的顯微結(jié)構(gòu)材料：生物相容性，機械穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性（4）生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與）生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝工藝問題二問題二 系統(tǒng)構(gòu)建系統(tǒng)構(gòu)建問題三問題三 傳代技術(shù)傳代技術(shù)問題四問題四 培養(yǎng)工藝培養(yǎng)工藝與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)

45、（5）培養(yǎng)工藝）培養(yǎng)工藝連續(xù)灌注培養(yǎng)連續(xù)灌注培養(yǎng)新 鮮 培 養(yǎng) 液流 處 的 培 養(yǎng) 液懸 浮 的 微 載 體生 物 反 應(yīng) 器生長在載體上的動物細胞生長在載體上的動物細胞n收獲細胞一個問題：一個問題：怎樣實現(xiàn)接種傳代培養(yǎng)？怎樣實現(xiàn)接種傳代培養(yǎng)？球傳球技術(shù)球傳球技術(shù)（5）應(yīng)用舉例）應(yīng)用舉例生物反應(yīng)器培養(yǎng)非洲綠猴腎細生物反應(yīng)器培養(yǎng)非洲綠猴腎細胞胞vero和狂犬病毒和狂犬病毒1 材料與方法材料與方法n（1 1）細胞：非洲綠猴腎細胞）細胞：非洲綠猴腎細胞VeroVero細胞細胞(ATCC):(ATCC):150-180 150-180代。代。n（2 2）培養(yǎng)基：）培養(yǎng)基：DMEM(Dulbecco

46、Modified Eagle DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium GIBCOL)Medium GIBCOL)，5%5%10%10%小牛血清和硫酸慶大小牛血清和硫酸慶大 霉素，用碳酸氫鈉或鹽酸調(diào)至霉素，用碳酸氫鈉或鹽酸調(diào)至pH7.2pH7.2。n（3 3）微載體：微載體：CT-3CT-3微載體微載體n（4 4）反應(yīng)器：）反應(yīng)器：5LCellGen細胞培養(yǎng)反應(yīng)器細胞培養(yǎng)反應(yīng)器 (NBS.CO.U.S.A.)，50LCellCul-50A細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器2 培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程n以以CelliGen5L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器作為種子罐培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)反應(yīng)器作

47、為種子罐培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長到一定密度時，將細胞和新的微載體當(dāng)細胞生長到一定密度時，將細胞和新的微載體一起移入一起移入CellCul-50A細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中。自動控自動控制：溫度制：溫度37370.10.1、溶解氧為、溶解氧為50%50%空氣飽和度、空氣飽和度、轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速為202032rpm32rpm。n細胞培養(yǎng)到一定密度后，接種狂犬病毒。第細胞培養(yǎng)到一定密度后，接種狂犬病毒。第2 2天停天停止攪拌，抽出培養(yǎng)基，加病毒培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。止攪拌，抽出培養(yǎng)基，加病毒培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)條件為病毒培養(yǎng)條件為pH7.4pH7.4pH7.8pH7.8、溶解氧為、溶解氧為40%40%60%6

48、0%空氣飽和度、溫度為空氣飽和度、溫度為37.037.0。加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其它成分錐形瓶逐級放大培養(yǎng)收獲病毒3 培養(yǎng)結(jié)果n培養(yǎng)培養(yǎng)8天，細胞密度達天，細胞密度達1.1107cells/ml。細胞。細胞貼附在微載體上生長的貼附在微載體上生長的電鏡照片見圖。在整個電鏡照片見圖。在整個培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)飽培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)飽滿光滑、長較快，細胞滿光滑、長較快，細胞在較短的時間內(nèi)達到高在較短的時間內(nèi)達到高密度，且可多層生長。密度，且可多層生長。接種病毒后接種病毒后10天，能產(chǎn)天，能產(chǎn)生較高的病毒量

49、。生較高的病毒量。六六 動物細胞體外培養(yǎng)動物細胞體外培養(yǎng) 現(xiàn)狀與展望現(xiàn)狀與展望 存在的問題存在的問題 n（一）（一）細胞密度低細胞密度低，產(chǎn)物濃度低。，產(chǎn)物濃度低。n（二）（二）細胞群體在大規(guī)模、長時間細胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分培養(yǎng)過程中分 泌產(chǎn)物能力易丟失，或泌產(chǎn)物能力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低。產(chǎn)物活性易降低。n（三）（三）動物細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微動物細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微 載體很載體很昂貴昂貴。因此大多僅能在小規(guī)模范。因此大多僅能在小規(guī)模范 圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。n（四）（四）目前對細胞目前對細胞代謝和生長動力學(xué)代謝和生長動

50、力學(xué)的研究比較的研究比較 欠缺。欠缺。n（五）（五）在線監(jiān)測水平技術(shù)不完善在線監(jiān)測水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培，限制了優(yōu)良培 養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。今后今后應(yīng)重點開展的工作應(yīng)重點開展的工作 n（一）（一）細胞培養(yǎng)過程代謝和產(chǎn)物形成機制等方面細胞培養(yǎng)過程代謝和產(chǎn)物形成機制等方面 的理論研究。的理論研究。n（二）（二）開發(fā)能高密度生長、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的開發(fā)能高密度生長、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的 細胞系。細胞系。n（三）（三）開發(fā)細胞生長性能優(yōu)良、細胞解離容易，開發(fā)細胞生長性能優(yōu)良、細胞解離容易，并能重復(fù)使用的新型廉價的微載體。并能重復(fù)使用的新型廉價的微載體。n（四）（四）研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的 無菌生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進的無菌生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進的 在線檢測、分析與自動控制技術(shù)等。在線檢測、分析與自動控制技術(shù)等。n（五）相關(guān)基因工程與細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研（五）相關(guān)基因工程與細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研 究。究。思考題思考題n1 原代培養(yǎng)取材時應(yīng)注意的問題，有哪些培養(yǎng)方法？各自適應(yīng)范圍是什麼？n2 貼壁細胞傳代采用什麼方法？其技術(shù)關(guān)鍵是什麼？n3 大規(guī)模細胞培養(yǎng)有哪些操作模式？各有哪些優(yōu)缺點？你認為如何來改進和發(fā)展？