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1、第七章 放射免疫分析試劑盒的制備,一、概要 二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術(shù) 三、典型放射免疫分析試劑盒的制備 四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展,一、 概要,放射免疫分析技術(shù)（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測生物體內(nèi)成百上千種活性物質(zhì)，是現(xiàn)代生物、醫(yī)學(xué)和臨床診斷的重要手段。,1 概念與原理,以放射性核素（主要為125I, 57Co, 3H, 14C等）標(biāo)記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經(jīng)過不同的結(jié)合反應(yīng)（競爭或非競爭性的），再將結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記物分開，測量其放射性活度，從而計算各種生物活性物質(zhì)的含量。,基本原理,抗原(Anti

2、gen)：能刺激動物機(jī)體的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與其發(fā)生特異性反應(yīng)（結(jié)合）的物質(zhì)。一般為異種或異體物質(zhì)（即機(jī)體的免疫活性細(xì)胞從未接觸過的異物）。 完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，又能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合生成抗原-抗體復(fù)合物。大多為大分子量的蛋白質(zhì)。 半抗原(Half Antigen, Hapten)：單獨不能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞起特異性結(jié)合反應(yīng)生成抗原-抗體復(fù)合物的物質(zhì)。與載體結(jié)合后注入動物體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體形成，即成為完全抗原。,抗體(Antibody)：由抗原誘導(dǎo)形成的一種

3、血清球蛋白，與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。,特異性(Specificity)：抗體抗原反應(yīng)具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合，不能與其它無關(guān)的抗原（抗體）結(jié)合。,主要的放射免疫分析方法,放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA） 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 受體放射性配體結(jié)合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay, PRLBA） 放射受體分析（Radio-Receptor Assay, RRA）,,2 主要的放射標(biāo)記免疫分析方法,1958-1960年由Yalow

4、RS and Breson SA創(chuàng)建，為最早的放射標(biāo)記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎）。 原理：用放射性核素標(biāo)記抗原，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原同時競爭結(jié)合物（如抗體）上有限的結(jié)合位點。然后將結(jié)合與未結(jié)合的游離抗原分離，測定其放射性分布，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中待測物的含量。,1) 放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）,Ag* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab,游離物（F） 復(fù)合物（B）,,,對于RIA，應(yīng)滿足以下條件：, 抗原是純一的，只由一種化學(xué)成分組成； 抗體也僅由一種化學(xué)成分組成； 抗原與抗體均為單價，即一分子抗原只能和一分子抗體

5、反應(yīng)； 標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原具有相同的物理-化學(xué)性質(zhì)； 抗原-抗體反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律； 反應(yīng)達(dá)到平衡； 結(jié)合抗原和未結(jié)合的游離抗原能完全分開，且不破壞反應(yīng)平衡； 能準(zhǔn)確測量結(jié)合抗原和游離抗原之比，或結(jié)合抗原與總抗原之比。,,,,,,,,K1,Ag + Ab AgAb k-1,K（親和常數(shù)）= =(AgAb）/ Ag Ab k-1,b/f =（AgAb）/ ( Ag)=K(Ab) b/f=K(AbT-B),K1,,放射免疫分析的Scatchard圖,2) 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA）,在RIA基礎(chǔ)上建立

6、起來的標(biāo)記免疫分析方法。 原理：用放射性核素標(biāo)記抗體，以過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合建立的方法.,免疫放射量度分析原理示意圖,,,,IRMA劑量反映曲線,RIA反映曲線,RIA與IRMA反應(yīng)式比較,,,,,,,RIA與IRMA的工作原理主要區(qū)別,3 放射標(biāo)記免疫分析方法的特點,二、放射標(biāo)記免疫試劑盒主要組分的制備技術(shù),（一）標(biāo)記物的制備技術(shù),可用于放射免疫分析的放射性核素,,Bolton-Hunter（BH）方法 其它間接標(biāo)記法,1 125I的標(biāo)記,,,2 標(biāo)記物的分離純化,3 標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定,4 標(biāo)記物的穩(wěn)定性及貯存條件,多肽類標(biāo)記物通常采用冷凍干燥方法貯存; 小分子化合物及單抗標(biāo)記物可以液體

7、狀態(tài)貯存; 標(biāo)記物通常在2-8條件下保存，有效期約周。,（二）抗原和抗體的制備技術(shù),免疫原（抗原）的制備,免疫原的制備,采用生化技術(shù)提取(人體器官或體液） 采用偶聯(lián)技術(shù)制備,,2 抗體制備, 動物種屬選擇, 免疫增強(qiáng)劑,凡可增強(qiáng)被免疫動物免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為免疫增強(qiáng)劑， 其種類眾多。, 免疫,抗血清的質(zhì)量鑒定,抗體貯存,抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50貯存。,（三）單克隆抗體的制備,1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術(shù)第一次獲得。 基本原理：利用動物脾細(xì)胞即淋巴細(xì)胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠在體外連續(xù)培養(yǎng)的性質(zhì)，將兩種細(xì)胞在融合劑（通常

8、為PEG）的作用下進(jìn)行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體。,單克隆抗體是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。,制備過程,與多克隆抗體比較,（四）分離劑,分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結(jié)合部分進(jìn)行有效的分離，直接影響RIA測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。,（五）標(biāo)準(zhǔn)品與參考血清的制備,1 標(biāo)準(zhǔn)品,2 參考血清,一般含一個或幾個分析物，是免疫分析中用來比較和評價不同測定系統(tǒng)的偏倚和重復(fù)性的血清，也是用于內(nèi)部或外部質(zhì)量評價的主要試劑。,（六）數(shù)據(jù)處理與分析方

9、法的有效性評估,三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備,（一）甲狀腺素放射免疫分析試劑盒的制備,（二）游離甲狀腺素FT4試劑盒的制備,（三）人血清促甲狀腺激素免疫放射分析試劑盒的制備,四、免疫分析技術(shù)進(jìn)展,國際市場 市場規(guī)模接近300億美元，近期每年增長率在7-9%左右。,特點 檢測品種多，達(dá)近千種，并且還在持續(xù)增加； 同一公司有多個產(chǎn)品技術(shù)平臺； 多種免疫分析方法并存，相互競爭，相互補(bǔ)充； 大公司產(chǎn)品系列全，小公司產(chǎn)品有特色； 高度集成、自動化的儀器診斷與簡單、快速便于普及的快速診斷。,國 內(nèi) 200余廠家； 北京北方生物技術(shù)研究所 濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司 北京科美東雅生物技術(shù)有限

10、公司 原子高科股份有限公司 100余種系列產(chǎn)品； 市場規(guī)模40億元（國內(nèi)與國外各占一半）； 年增長率10-16%；,面臨的挑戰(zhàn), 酶免疫分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 時間分辨熒光免疫分析 (Time-resolved Fluoroimmunoassay, TRF) 化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminesent immunoassay, CLIA）,放射免疫分析和非放射免疫分析技術(shù)性能比較,傳統(tǒng)的RIA使用市場可能會逐漸縮?。?預(yù)計在未來十年中，體外診斷技術(shù)將會快速發(fā)展，并出現(xiàn)放免、酶免、化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光以及金標(biāo)試紙條、生物芯片等多種體外診斷試劑優(yōu)勢互補(bǔ)，各自在不同領(lǐng)域廣泛應(yīng)用共存，國內(nèi)和國外廠家紛爭的競爭局面。,