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1、實驗三：PCR擴增檢測乙肝病毒,乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我國發(fā)病率很高 ，HBV的檢測極其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動機 。,PCR技術(shù)可以檢測出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)已成為公認的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。,,一、實驗?zāi)康?1.掌握PCR技術(shù)擴增的原理 2.熟悉PCR擴增檢測乙肝病毒的基本操作過程。,二、實驗原理 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction) 簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引

2、物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴增技術(shù)，它包括三個基本過程：,,,1.變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?2.退火：急速降溫使引物和互補模板 在局部形成雜交鏈 3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物為起始點的 延伸反應(yīng),,,,模板DNA,,高溫變性,,,,,,,,低溫退火,,,,引物,,適溫延伸,,,,,,經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴增2n倍,兩條子代DNA,,一 次 循 環(huán),,,,Tap酶,5,3,3,5,,3,5,5,3,5,3,三、主要器材及試劑 1.主要器材：,9700型PCR儀,電泳槽、電泳儀,,紫外分析儀,臺式高速離心機,2.主要試劑：,四

3、、操作步驟 1.標本處理：取患者血清40l，加入DNA提取液40l，沸水浴10分鐘，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液4l做PCR反應(yīng)。,2.加樣： 加入提取好的標本4l，6000轉(zhuǎn)離心10秒。,,三個擴增步驟溫度及時間,循環(huán)次數(shù)：25次,,3.PCR儀上擴增：,,,PCR儀上擴增,,,加入標本,離心,6000轉(zhuǎn)離心10秒,4.電泳檢測： 制備2%瓊脂糖凝膠,2%瓊脂糖的制備：,電泳槽的準備：,,,,稱取 0.8g瓊 脂糖,,40mlTBE 電泳緩沖液 （PH8.0) 煮沸溶解,,加入,冷卻,60左右,加入 溴乙啶 EB20l,,,,倒膠,,加樣：取擴增后的產(chǎn)物10 ul點樣于凝膠孔,,取樣,點樣,電泳：點樣端接“-”，穩(wěn)壓，50V，電泳30分鐘。 五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性,,HBV陽性,,HBV陰性,,,,HBV陽性對照,,HBV陰性對照,正極,負極,,點樣孔,,五、注意事項 1. 試劑盒內(nèi)陽性標本及DNA提取液使用前需充分融化離心。 2. 反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時從反應(yīng)管底部吸液。 3. EB為強致癌物，操作過程應(yīng)注意防護。 4. 注意無菌操作，以免出現(xiàn)假陽性。,Thank you!,