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1、第二章 氣相色譜法,南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心,余定華 博士，副教授,1.萱烯2.芳樟醇3.乙酸乙酯4.乙酸卞酯5.香茅醇6.苯乙醇7.甲基芷香酮8.Carvocrol和geraniol香葉醇9.水楊酸異戊酯10.水楊酸正戊酯11.Commamylacetate12.乙酰雪松烯13.鄰苯二甲酸二甲酯14.1,2,2,3,3,5-a七甲莖茚滿-6-甲基酮15.香豆素16.麝香二甲苯17.苯甲酸卞酯18.水楊酸卞酯19.麝香酮,你知道蘭寇香水的秘密嗎?,白酒為什么有不同的風(fēng)味?,室內(nèi)空氣危害健康,元兇何在?,主要內(nèi)容,色譜法概述 氣相色譜儀 色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語(yǔ) 氣

2、相色譜分離原理 氣相色譜定性定量分析 氣相色譜固定相 氣相色譜檢測(cè)器,一、色譜法的由來(lái),色譜法是1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特創(chuàng)立的。他在研究植物葉子的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃柱內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成不同顏色的譜帶。這種方法因此得名色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無(wú)色物質(zhì)的分離，“色譜”二字已失去原來(lái)的意義，但仍被人們沿用至今。,色譜柱：玻璃管； 固定相：碳酸鈣； 流動(dòng)相：石油醚； 色譜分析法是用來(lái)進(jìn)行混合物中各組分 的分離與分析的一種物理化學(xué)方法。它是 根據(jù)混合物中各組分在互不相溶的兩相 (固定相和流動(dòng)相)中的吸附能力或分配系 數(shù)

3、或其他親和作用性能的差異作為分離 依據(jù)的。,二、色譜法的分類, 按流動(dòng)相和固定相的狀態(tài)分類, 按固定相形狀分類,按分離的原理分類,1.吸附色譜：利用組分在吸附劑上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得 以分離的方法；,2. 分配色譜：利用組分在固定液中溶解度不同而達(dá)到分離的方法；,3. 離子交換色譜：利用組分在離子交換劑上的離子交換能力大小不同而達(dá)到分離的方法；,4. 凝膠色譜：利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇性滲透而達(dá)到分離的方法。,三、氣相色譜法的特點(diǎn) 1、分離效能高。例如用60m長(zhǎng)的毛細(xì)管柱，可將汽油10碳以內(nèi)的組分分離出240個(gè)色譜峰。 2、選擇性高。氣相色譜法可以分離化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相近的化合物。

4、例如二甲苯三個(gè)同分異構(gòu)體，用其他方法分離相當(dāng)困難，但用氣相色譜法則比較容易。 3、高靈敏度。與氣相色譜儀配套的高靈敏檢測(cè)器最小檢測(cè)量可達(dá)10-1110-13g物質(zhì)或更少。因而適合于微量有機(jī)物分析。,4、分析速度快。一次色譜分析短者幾秒鐘，長(zhǎng)者幾分鐘到幾十分鐘完成。 5、樣品用量少。由于氣相色譜靈敏度高，需要的樣品少，一般進(jìn)樣幾微升既能完成多項(xiàng)目的分析。 6、分離和檢測(cè)能一次完成，這也是氣相色譜的特點(diǎn)。其他的分析方法如紫外、紅外、質(zhì)譜等均需純品，如是混合物需要分布進(jìn)行分離和檢測(cè)。,第二節(jié) 氣相色譜儀,SP-6890型氣相色譜儀,島津 GC-2010,安捷倫 7890A氣-質(zhì)聯(lián)用儀,一、氣相色譜流

5、程,1-載氣鋼瓶；2-減壓閥； 3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì)；6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-分離柱；9-檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制裝置；12-記錄儀；,二、氣相色譜儀的結(jié)構(gòu),1. 載氣系統(tǒng) 包括氣源、凈化干燥管和載氣 流速控制裝置；,常用的載氣有：氫氣、氮?dú)狻⒑猓?凈化干燥管：去除載氣中的水、有機(jī)物等雜質(zhì)（依次通 過(guò)分子篩、活性炭等）； 載氣流速控制：壓力表、流量計(jì)、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。,2. 進(jìn)樣系統(tǒng),包括：進(jìn)樣器+氣化室； 六通閥： 試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試 樣進(jìn)入分離柱；,微量注射器： 體積150L不等的注射器,氣化室： 液體樣品瞬間

6、氣化。無(wú)催化作用,3.分離系統(tǒng)（色譜柱）,色譜柱：由柱管和填裝在其中的固定相組成。 柱材質(zhì)：不銹鋼管或玻璃管，內(nèi)徑2-4毫米。長(zhǎng)度可根據(jù)需要 確定。 柱填料：粒度為60-100目的色譜固定相。 色譜柱的分離效果除與柱長(zhǎng)、柱徑和柱形有關(guān)外，還與所選 用的固定相和柱的制備技術(shù)以及操作 條件等許多因素有關(guān)。,4.檢測(cè)記錄系統(tǒng),色譜儀的眼睛， 通常由檢測(cè)元件、放大器、顯示記錄三部分組成； 被色譜柱分離后的組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，按其濃度或質(zhì)量 隨時(shí)間的變化，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)電信號(hào)，經(jīng)放大后記錄和顯示，給出色譜圖； 檢測(cè)器： 濃度型測(cè)量的是載氣中某組分濃度瞬間的變化，即檢測(cè)器的響應(yīng)值和組分的濃度成正比

7、，如熱導(dǎo)檢測(cè)器和電子捕獲檢測(cè)器； 質(zhì)量型測(cè)量的是載氣中某組分進(jìn)入檢測(cè)器的速度變化，即檢測(cè)器的響應(yīng)值和單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器某組分的量成正比，如火焰離子化檢測(cè)器和火焰光度檢測(cè)器等。,5.溫度控制裝置,溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)，它直接影響色譜柱的 選擇分離、檢測(cè)器的靈敏度和穩(wěn)定性； 氣化室、分離柱、檢測(cè)器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫 度； 氣化室：保證液體試樣瞬間氣化； 檢測(cè)器：保證被分離后的組分通過(guò)時(shí)不在此冷凝； 分離柱：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。,第三節(jié) 色譜流出曲線及 有關(guān)術(shù)語(yǔ),一、色譜流出曲線和色譜峰 由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線(

8、如圖)。曲線上突起的部分就是色譜峰。,二、基線,在實(shí)驗(yàn)條件下，色譜柱后僅有純流動(dòng)相進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)的流 出曲線稱為基線(如圖O-t)，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。 三、峰高 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖中BA,三、保留值 1死時(shí)間tM 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，如圖中 OA。 因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流 動(dòng)相的流動(dòng)速度相近測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用柱長(zhǎng)L 與tM的比值計(jì)算。,2保留時(shí)間tR 試樣從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖OB它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢

9、測(cè)器所需的時(shí)間,3調(diào)整保留時(shí)間tR某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保留 時(shí)間，即 tR = tR-tM 由于組份在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組份隨流動(dòng)相通 過(guò)柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以 tR 實(shí)際上是組份在固定相中停留的總時(shí)間保留時(shí)間可用 時(shí)間單位（如s）或距離單位（如cm）表示。 保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組份的保留時(shí) 間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體 積等參數(shù)進(jìn)行定性檢定,4死體積 VM 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、 色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總 和。當(dāng)后兩項(xiàng)很小而

10、可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流 動(dòng)相體積流速F0（Lmin）計(jì)算： VM = tMF0,5保留體積 VR 指從進(jìn)樣開(kāi)始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通 過(guò)的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間t。的關(guān)系如下： VR = tRF0 6調(diào)整保留體積VR 某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體 積，即 VR = VR- VM,7相對(duì)保留值2.1 某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱為相 對(duì)保留值： 由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、 柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中， 特別是氣相色譜法中，廣泛使用的

11、定性數(shù)據(jù)。 必須注意，相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留 體積之比。,四、區(qū)域?qū)挾?色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它 反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧?常有三種方法： 1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖中EF距離的一半。 2. 半峰寬W1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖中GH間的距離。它與標(biāo) 準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W1/2 = 2.354,3. 基線寬度W 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如圖中 IJ的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W = 4,從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息： (l)

12、根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個(gè)數(shù) (2)根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析 (3) 根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析 (4) 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的 依據(jù) (5) 色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否 合適的依據(jù),第四節(jié) 氣相色譜分離原理,色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離。組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開(kāi)。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行

13、為決定的，即與色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。,一、分配系數(shù)K和分配比k,1分配系數(shù)K 如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流 動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配過(guò)程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù) 多次地吸附一脫附過(guò)程。這種分離過(guò)程經(jīng)常用樣品分子在兩相 間的分配來(lái)描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)。它是 指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平 衡時(shí)的濃度之比值，即 CL：組分在固定相中的濃度，g/mL CM:組分在載氣中的濃度， g/mL,當(dāng)K=1時(shí)，組分在固定相和流動(dòng)相中濃度相等； 當(dāng)K1時(shí)，組分在固定相中的濃度大于在流動(dòng)相中的濃度

14、； 當(dāng)K<1時(shí)，組分在固定相中的濃度小于在流動(dòng)相中的濃度。 不同物質(zhì)的分配系數(shù)相同時(shí)，它們不能分離。 色譜柱中不同組分能夠分離的先決條件是其分配系數(shù)不等。 分配系數(shù)K小的組分：在氣相中停留時(shí)間短，較早流出色譜柱。 分配系數(shù)大的組分：在氣相中的濃度較小，移動(dòng)速度慢，在柱中停留時(shí)間長(zhǎng)，較遲流出色譜柱。 兩組分分配系數(shù)相差越大，兩峰分離的就越好。,物理意義：組分保留程度的量度: K 值小，先出柱子 K 值大，后出柱子 影響因素：K 只與固定相和溫度有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無(wú)關(guān)。,圖 不同K 值對(duì)兩組份分離的影響,K 值比較小

15、溫度較高,K 值比較大 溫度較低,2.分配比k,分配比又稱容量因子或容量比，它是指在一定溫度和 壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng) 相中的質(zhì)量比。即,分配系數(shù)與分配比之間的關(guān)系為,K與k的共同點(diǎn)是：它們都與組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，并隨柱溫、柱壓的變化而改變。它們的不同點(diǎn)是：K值與氣相、液相的體積無(wú)關(guān)，而k值與兩相體積有關(guān)。,滯留因子Rs,分配比k值可直接從色譜圖測(cè)得。設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度 為u，組分在柱內(nèi)移動(dòng)的線速度為us，由于固定相對(duì)組分有保 留作用，所以u(píng)su此兩速度之比稱為滯留因子Rs。,組分在柱內(nèi)移動(dòng)的速度,流動(dòng)相在柱內(nèi)線速度,Rs若用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，即,對(duì)組分

16、和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的色譜柱，其所需時(shí)間分別為,整理以上3式，可得,由此可知，組分在柱內(nèi)的保留時(shí)間與柱長(zhǎng)L成正比，與載氣線速度成反比。式4-9將保留值與分配比聯(lián)系起來(lái)，稱之為色譜過(guò)程基本方程式。 將式4-9變?yōu)閠R+tM=tM(1+k),通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得校正保留時(shí)間(體積)及死時(shí)間(體積)，就可求得分配比。,（4-9）,3、相對(duì)保留值 一個(gè)混合物能否被分離，首先決定于色譜柱的選擇性。當(dāng) 色譜柱內(nèi)固定相對(duì)樣品中各組分的分配系數(shù)有差異時(shí)，各組 分才能有可能被分離，該柱子的選擇性就好。色譜柱的選擇 性一般用相對(duì)保留值來(lái)表示，被定義為在相同條件下，i、 s兩組分的相對(duì)保留值之比，即,值說(shuō)明色譜柱對(duì)兩個(gè)

17、待分離組分的選擇保留作用的大 小，它標(biāo)志著兩峰在色譜圖上的相對(duì)位置。越大，說(shuō)明兩 組份分離得越好，在色譜圖上的兩峰相距越遠(yuǎn)，色譜柱的選 擇性就越好。當(dāng)兩組分的1.2時(shí)，就可用一般填充柱把它 們分開(kāi)。 是一個(gè)無(wú)因次量，僅隨固定液及柱溫變化而變化，而與 柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑、流動(dòng)相等因素?zé)o關(guān)。提高色譜柱的選擇性， 主要從選擇固定相入手。,,二、塔板理論 最早由Martin等人提出塔板理 論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔， 沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述 組分在兩相間的分配行為，同時(shí) 引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率 的指標(biāo)。,該理論假定： （i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平 衡。這一小段柱長(zhǎng)稱

18、為理論塔板高度H。 （ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的， 而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（Vm）。 （iii）所有組分開(kāi)始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸 （縱）向擴(kuò)散可忽略。,（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔 板上的量無(wú)關(guān)。 為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，設(shè)色譜往由5塊塔板（n5，n為柱子的 塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2，nl； 某組分的分配比k=1. 根據(jù)上述假定，在色譜分離過(guò)程中，該組分的分布可計(jì)算如下：,,開(kāi)始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1g）的該組 分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故 nm=ns=0.5。當(dāng)一個(gè)

19、板體積（lV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0 號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上， 此時(shí)0號(hào)板液相（或固相）中ns部分組分及1號(hào)板氣相中的nm 部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總 量為0.5，其中氣液（或氣固）兩相各為0.25而1號(hào)板上所 含總量同樣為0.5氣液（或氣固）相亦各為0.25。以后每 當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過(guò)程就 重復(fù)一次(見(jiàn)下表)。,按上述分配過(guò)程，對(duì)于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動(dòng)進(jìn)入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣液兩相中的總質(zhì)量）見(jiàn)表：1-2由塔板理論可建流出曲線方程：,m為組分質(zhì)量，Vr為

20、保留體積，n為理論塔板數(shù)。 當(dāng)V=Vr 時(shí)，C值最大，即,由流出曲線方程可推出：,而理論塔板高度（H）即：,,從上兩式可以看出，色譜峰W越小，n就越大，而H就越 小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。 通常填充色譜柱的n103，H1mm。而毛細(xì)管柱 n=105 106，H0.5mm 由于死時(shí)tm包括在tr中，而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)分配，所 計(jì)算的n值盡大,H很小,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn)。所以,提出 把tm扣除，采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評(píng)價(jià)柱 效能。,塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的 分配平衡和分離過(guò)程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地 解釋了

21、流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算 和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。但由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合 柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分離過(guò)程，例如，縱向擴(kuò)能解釋造成譜帶擴(kuò) 張的原因和影響板高的各種因素，也不能說(shuō)明為什么在不同 流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。,塔板理論的特點(diǎn)和不足：,(1)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù) n 越大(塔板高度 H 越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。 (2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。 (3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù) K 相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無(wú)法分離。 (4)塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,下節(jié)課內(nèi)容,氣相色譜分離理論（續(xù)） 氣相色譜的定性與定量分析,謝謝大家 未完待續(xù),