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1、第七章,自動分析技術(shù)/微型全分析系統(tǒng),7.1導(dǎo)言 7.2流動注射分析 7.3微型全分析系統(tǒng) 7.4微流控分析芯片加工技術(shù) 7.5微流控分析芯片的應(yīng)用,微流控分析芯片，方肇倫 等編著， 科學(xué)出版社， 2003,7.1導(dǎo)言,傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法是手工分析，至今仍被廣泛應(yīng)用。 手工分析的缺點是手續(xù)繁雜、速度慢，分析結(jié)果與分析 人員的技術(shù)水平和熟練程度有關(guān)，還不可避免地使分析 人員長時間接觸化學(xué)藥品，嚴(yán)重影響健康。 為了克服這些缺點，幾十年來，人們根據(jù)不同的分析要 求，模擬手工分析的程序設(shè)計了各種各樣的機械程序分 析裝置，用機械操作代替手工操作，給分析工作者減輕 了許多負(fù)擔(dān)，分析速度、準(zhǔn)確度、精度也有了

2、一定的提 高。但這類程序分析器一般只適于分析一兩種特定組分， 通用性差。,1950s，“連續(xù)流動分析”技術(shù)發(fā)展起來了。它的基本思路是把 各種化學(xué)分析所要用的試劑和試樣按一定的順序和比例用管道 和泵輸送到一定的反應(yīng)區(qū)域，進行混合，完成化學(xué)反應(yīng)，最后 經(jīng)檢測器檢測并由記錄儀顯示分析結(jié)果，實現(xiàn)了管道化的自動 連續(xù)分析。但這些分析仍建立在化學(xué)平衡的基礎(chǔ)上，速度受到 限制。 丹麥技術(shù)大學(xué)的J.Ruzicka 和E.H.Hansen于1975年提出了流動注 射分析(Flow Injection Analysis，F(xiàn)IA)的新概念。把試樣溶液直 接以“試樣塞”的形式注入到管道的試劑載流中，不需反應(yīng)進行 完全

3、，就可以進行檢測。擺脫了傳統(tǒng)的必須在穩(wěn)態(tài)條件下操作的 觀念，提出化學(xué)分析可在非平衡的動態(tài)條件下進行，從而大大提 高了分析速度。一般可達每小時進樣100300次。從樣品注入到 檢測器響應(yīng)的時間間隔一般小于1 min。設(shè)備較簡單并靈活，操 作簡便，啟動和關(guān)機時間僅需幾分鐘，因此FIA技術(shù)不僅適于大 批量的常規(guī)分析，也適于少量非常規(guī)樣品的自動測定。,FIA是一種良好的微量分析技術(shù)，一般每次測定僅需25100 L樣品溶液。由于樣品與試劑用量甚微，又在封閉系統(tǒng)中完 成測定，因此極大地降低了對人體的毒害和對環(huán)境的污染。 現(xiàn)代分析化學(xué)的發(fā)展趨勢是向現(xiàn)場、實時、動態(tài)、 高靈敏度、高選擇性、高通量的方向發(fā)展！

4、1990s初期發(fā)展起來的微全分析系統(tǒng)(微流控芯片、生 物芯片和芯片實驗室)為實現(xiàn)上述目標(biāo)提供了可能性。,7.2流動注射分析,7.2.1 流動注射分析的基本原理 7.2.1.1 受控擴散和定時重現(xiàn) 樣品被注入到試劑載流后，式樣塞有矩形濃度輪廓。當(dāng)樣品在載流載帶下通過管道移動時，就發(fā)生帶展寬或擴散。展寬區(qū)帶的形狀由兩種作用決定：對流和擴散（徑向和軸向）。,圖7.1 對流和擴散作用 (a)無分散；(b)對流引起的分散；(c)對流和徑向擴散引起 的分散；(d)徑向擴散引起的分散,7.2.1.1 受控擴散和定時重現(xiàn) 流動注射分析常在對流和徑向擴散兩種分散共存 的情況下進行。當(dāng)樣品通過流通池時，檢測器所

5、記錄的是連續(xù)變化的信號，可以是吸光度，電極 電勢或其他物理參數(shù)，因而不需要達到化學(xué)平 衡。,例如，以分光光度法測定Cl-，所基于的反應(yīng)是：,,,圖7.2 流動注射測定Cl- (a)流路設(shè)計圖；(b)5-75 gmL-1的平行測定；(c) 30 gmL-1和75 gmL-1樣品的快速掃描。,這些實驗清楚地顯示了FIA的基本特點：在樣品通過分析 流路時，以完全相同的方法順序處理所有的樣品。即對一 個樣品如何處理，對其他任何樣品也以完全相同的方法進 行處理。流動注射體系中準(zhǔn)確體積樣品的注入、重現(xiàn)和精 確的定時進樣以及從注入點到檢測點體系的完全相同的操 作（所謂控制或可控分散），形成注入樣品的濃度梯度

6、， 從而產(chǎn)生瞬間的、但可精確重現(xiàn)的記錄信號，使得流路中 的任何一點都能像穩(wěn)態(tài)一樣準(zhǔn)確測量。一般用峰值作為分 析信號，可以獲得較高的靈敏度。 受控擴散和定時重現(xiàn)是流動注射分析(FIA)的基本特點！,7.2.1.2 分散系數(shù) 為了合理地設(shè)計FIA體系，需要知道原始樣品溶液在它流到檢測 器的途中稀釋的程度，以及從樣品注入到讀數(shù)消耗了多長時間。 定義分散系數(shù)(dispersion coefficient, D)為 D c0/c (D 0)(7.1) 式中c0為注入樣品中分析物的濃度， c為檢測器中分析物的濃度。 這里D僅考慮了分散的物理過程；但應(yīng)該強調(diào)的是：任何FIA峰 都是兩種過程同時發(fā)生的結(jié)果：區(qū)

7、帶分散的物理過程與樣品和試 劑間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)過程。,分散系數(shù)主要受三種相互作用且可以控制的變量的影響， 即樣品體積、管的長度和流動速度。 可用染料來測定D。 設(shè)計FIA體系時，需根據(jù)實驗?zāi)康木C合考慮各種因素的影 響，以確定最佳流路。例如，建立的FIA系統(tǒng)是用于常規(guī) 大批量分析的，那么提高分析速度、增加進樣頻率就是 要考慮的主要方面，就應(yīng)當(dāng)減少進樣體積，縮短管長， 提高流速。,分散系數(shù)大致可分為4種情況：有限的（D=13）、中度的 （D=310）、高度的（D10）以及減小的（D<1）。相應(yīng) 設(shè)計的FIA體系已被用于各種各樣的分析任務(wù)。當(dāng)注入的樣 品以未被稀釋的形式被運載到檢測器時，采用的是有限分

8、 散，也就是將FIA體系用作將樣品嚴(yán)格而準(zhǔn)確地運載到檢測 裝置（如離子選擇電極、原子吸收分光光度計等）的工具。 當(dāng)待測物必須與載液混合并發(fā)生反應(yīng)，以形成要檢測的產(chǎn)物 時采用中度分散。只有當(dāng)樣品必須被稀釋到測量范圍內(nèi)時才 應(yīng)用高度分散。減小的分散意味著檢測的樣品濃度高于注入 的樣品濃度，即發(fā)生了在線預(yù)濃縮（例如通過離子交換柱或 經(jīng)過共沉淀等）。,7.2.2 流動注射分析儀的基本組成 FIA儀一般由流體驅(qū)動單元、進樣閥、 反應(yīng)管道和檢測器組成。,在流動注射體系中，最常見的是用蠕動泵驅(qū)動溶液。圖7.3表明 了蠕動泵的操作原理。 蠕動泵一般都有810個排列成圓圈的滾軸，通過轉(zhuǎn)動的滾軸將 液體壓進塑料或

9、橡膠管。流速由馬達的轉(zhuǎn)速和管子的內(nèi)徑控制。 若固定蠕動泵的旋轉(zhuǎn)速度, 流速就由每個管子的內(nèi)徑?jīng)Q定。商品 化的管子具有0.254mm的內(nèi)徑，允許流速最小為0.0005 mL/min， 最大為40 mL/min。蠕動泵可以進行幾個管子的同時操作，特別 適于應(yīng)用多種試劑但又不能預(yù)先混合的情況。FIA也可以用活塞 泵，但價格較貴，且只允許單流路傳送，對于多路管線，則需 幾個單獨的泵。,7.2.2.1 流體驅(qū)動單元,圖7.3 單管路蠕動泵示意圖,7.2.2.2 進樣閥 進樣閥(valve for injection)又稱采樣閥、注入閥或注射閥。用 得最多、且效果最令人滿意的是類似于高效液相色譜（HPLC

10、） 中所用的旋轉(zhuǎn)式六通閥。注入樣品的體積可以為5 200 L，典 型的是1030 L，用具有適當(dāng)長度和內(nèi)徑的外部環(huán)管計量。這 種“塞式”注入的進樣方式對載流流動干擾很小，取樣和注入過 程均可精確重復(fù)。,7.2.2.3 反應(yīng)管道 在FIA管線中所用的導(dǎo)管多數(shù)是由細孔徑的聚乙烯管和聚四氟乙 烯管組成，典型的內(nèi)徑為0.50.8 mm。反應(yīng)管道(reaction pipeline) 通常是盤繞著的，可以增強徑向擴散、減小軸向擴散，減弱試樣塞 增寬的程度而導(dǎo)致更對稱的峰，獲得較高的靈敏度，而且可以提高 進樣頻率。如果在反應(yīng)管道內(nèi)填充直徑為管道內(nèi)徑60%的玻璃球， 則稱為單珠串反應(yīng)器，用這種管道可以得到十

11、分對稱的峰形，而分 散程度比同規(guī)格內(nèi)徑的敞口直管反應(yīng)器的分散度小10倍。 為了連接管道，并使液流按需要分支或集合，經(jīng)常使用被稱為“化 學(xué)塊”或“功能組合塊”的裝置。在“化學(xué)塊”的管道連接處可以產(chǎn)生 “徑向效應(yīng)”，使試樣與試劑有效地混合，因而提高進樣頻率和分析 靈敏度。,7.2.2.4 檢測器 FIA實際上可以與任何類型的檢測器(probe unit)相匹配, 這也是 FIA取得很大成功的原因之一。例如AAS、AES、分光光度計、 熒光光度計、電化學(xué)系統(tǒng)、折射儀等。 帶流通式液槽的分光光度計檢測器是FIA中用得最多的。流通池 和一般吸收池的區(qū)別在于：流通池是動態(tài)測定，吸收池是靜態(tài)測 定。除了為獲

12、得一定的靈敏度而要求有足夠的光程外，還要求流 通池體積盡可能小，以便減少載流量、試劑量、試樣量，并提高 分析速度。在液體流通的區(qū)域內(nèi)要避免死角，以避免試樣殘余液 滯留于死角區(qū)影響重現(xiàn)性，或截留氣泡而干擾測定。 下圖為兩種常用的玻璃或石英流通池。然而，用泵輸送載流通 過分光光度計的做法遠不如把光束從分光光度計引入流動注射 分析系統(tǒng)，然后再返回光度計更為合理。因而在最近的設(shè)計中， 廣泛地使用了光導(dǎo)纖維。這樣，可以將流通池和微管道結(jié)合在一 起，進行吸光度測定或熒光檢測。,圖7.4 發(fā)光光度法中的流通池 (a)固定在多數(shù)商品光度計上的Hellma池； (b)Z型池，其中A為透明窗，并為聚四氟 乙烯池體

13、，C為池套，CH為入口通道。,圖7.5 離子選擇性電極流通池 (a)射流壁式結(jié)構(gòu)流通池； (b)梯流式結(jié)構(gòu) 流通池,7.2.3 FIA技術(shù)與應(yīng)用 7.2.3.1 用于重復(fù)的和精確的樣品傳送（有限分散的應(yīng)用） 由于FIA固有的嚴(yán)格定時性，可以用此項技術(shù)將給定的樣品精確 而重復(fù)地傳遞到檢測器，從而保證每一個測量循環(huán)過程中所有的 條件嚴(yán)格保持一致。 例如，當(dāng)火焰原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜或電感耦合等離子體 原子發(fā)射光譜與FIA結(jié)合時，樣品的等分試樣被直接吸入火焰或 等離子體, 這些分析儀器的性能就會獲得改善，且在某些情況下 被大大加強。與傳統(tǒng)的樣品溶液吸入法相比，可以提高進樣頻率， 進樣速率可達30

14、0樣/h。更重要的是，在一般吸入一個樣品的時間 內(nèi)可以分別注入兩份樣品，這意味著FIA法不僅能提高精度，也能 改善準(zhǔn)確度。另一個優(yōu)點是樣品與檢測器接觸的時間非常短，其余 的時間可以用載液清洗檢測器。這意味著有高的清洗-進樣比，因 此可以大大地減少或消除由高濃度鹽造成的燃燒器堵塞的機會。,7.2.3.2 FIA轉(zhuǎn)換技術(shù)（中度分散的應(yīng)用） FIA轉(zhuǎn)換技術(shù)(conversion techniques)可以被定義為：借助適當(dāng) 的樣品預(yù)處理、試劑生成或基體改性，通過動力學(xué)控制的化學(xué) 反應(yīng)使不能被檢測的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可被檢測的成分的過程。 在這類FIA體系中，分散應(yīng)當(dāng)足夠快，以使樣品和試劑部分混 合，發(fā)生反應(yīng)

15、，但又不過度分散，以免不必要的稀釋待測物， 使檢測靈敏度降低。多數(shù)FIA步驟是基于中度分散，因為待測 物必須經(jīng)歷某種形式的智能“轉(zhuǎn)化”。,說明此方法應(yīng)用的例子是在臨床化學(xué)中有意義的硫氰酸鹽的測定。 除了吸煙者外，存在于人體的硫氰酸鹽濃度是極低的。硫氰酸鹽 在人體中的半衰期大約是14天，因此通過體液（唾液、血液和尿 液）分析就很容易區(qū)別吸煙者和非吸煙者。一個測定硫氰酸鹽的 快速而簡便的FIA方法是基于以下的反應(yīng)： 產(chǎn)物生成迅速，摩爾吸光系數(shù)很高，但隨后就褪色，壽命約10s。 因此在生色最大的那一刻讀數(shù)很重要。所用的FIA系統(tǒng)示于圖7.6。 樣品（50 L唾液）被注入到水載流中，隨后與試劑5-B

16、r-PADAP 2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚合并，再和氧化劑重鉻酸鉀合 并，最終的混合體系中酸的濃度約為2mol/L。由于FIA可重現(xiàn)的 定時性，故可定量檢測亞穩(wěn)態(tài)的有色產(chǎn)物。,圖7.6 用于測定亞穩(wěn)態(tài)反應(yīng)產(chǎn)物的FIA流程圖,圖7.7 用圖7.6所示的FIA系統(tǒng)獲得到硫氰酸鹽信號,在FIA系統(tǒng)中可以通過多相轉(zhuǎn)換技術(shù)提高分析測定的 選擇性。例如把氣體擴散、滲析、溶劑萃取、離子交 換或固定化酶等操作與管線步驟結(jié)合，以便將樣品成 分轉(zhuǎn)變成可檢測的物質(zhì)。 自從1975年第一篇FIA論文發(fā)表以來，流動注射分析 這一新穎而獨特的分析方法在環(huán)境監(jiān)測、地質(zhì)冶金、 臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)等諸領(lǐng)域得

17、到了廣泛的應(yīng)用。 它的精確控制幾乎適于任何分析領(lǐng)域，它的靈活設(shè)計 組裝使其功能可以無止境地發(fā)展。,作業(yè) 7： 如何定義FIA中的分散系數(shù)D，對于給定的FIA體系如 何測定D?,7.3微型全分析系統(tǒng),7.3.1 導(dǎo)言 科學(xué)儀器在人類的整個科技發(fā)展過程中都起到極其重要的作用， 這在近代科技發(fā)展中反映得尤其突出。 分析儀器的發(fā)展趨勢就是微型化/集成化與便攜化。當(dāng)前，主要為 了適應(yīng)生命科學(xué)發(fā)展的需要，分析儀器的發(fā)展正在出現(xiàn)一個以微 型化為主要特征的，帶有革命性的重要轉(zhuǎn)折時期。 自從Manz和Widmer于1990首次提出微型全分析系統(tǒng)(TAS, miniaturized total analysis

18、system或micro total analysis system) 的概念以來，經(jīng)歷了發(fā)展初期的冷落和彷徨，在短短的十幾年中 已發(fā)展為當(dāng)今世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一。 2001年，英國RSC創(chuàng)刊Lab-on-a-chip（芯片實驗室）。 2002年，美國Anal.Chem.將TAS列入每兩年一次的綜述中，標(biāo) 志著它作為分析化學(xué)的一個獨立領(lǐng)域，已被學(xué)術(shù)界承認(rèn)。并將微 流控芯片系統(tǒng)作為其主要發(fā)展方向。,TAS的目的是通過化學(xué)分析設(shè)備的微型化與集成化，最大限 度地把分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，甚至集成 到方寸大小的芯片上。由于這種特征，本領(lǐng)域的一個更為通俗 的名稱“芯片實驗室”(La

19、b-on-a-chip, LOC)已經(jīng)被日益地接受。 在分析系統(tǒng)微型化與集成化的基礎(chǔ)上， TAS的最終目標(biāo)是實現(xiàn) 分析實驗室的“個人化”，“家用化”，從而使分析科學(xué)及分析儀 器從化學(xué)實驗室解放出來，進入千家萬戶。 微流控芯片(microfluidic chips)是TAS中目前最活躍的領(lǐng)域和 發(fā)展前沿，它最集中地體現(xiàn)了將分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到芯片 上的思想，其未來的發(fā)展將對上述目標(biāo)的實現(xiàn)起到非常重要的 作用。,Microfluidic chip,Sample preparation Mass transport Mixing Reaction Sample injection Separati

20、on Detection,作為分析化學(xué)的前沿技術(shù)，TAS的迅速發(fā)展不僅是該領(lǐng)域科學(xué) 工作者不懈努力的結(jié)果，而且得益于微機電加工(MEMS)、生物 化學(xué)、材料學(xué)、微光學(xué)機械等多門學(xué)科的最新成果的利用。 然而， TAS的實際應(yīng)用目前尚處于初級階段，對分析系統(tǒng)來講 要求達到既“微”又“全”，從總體上看，還僅僅是目標(biāo)，離真正實 現(xiàn)還有相當(dāng)大的距離。 這些目標(biāo)的實現(xiàn)必須靠大力發(fā)展微流控技術(shù)；生物(陣列)芯片雖 然是很重要的生物檢測手段，但難以在實際分析系統(tǒng)的“微、全” 方面發(fā)揮優(yōu)勢。 一個新學(xué)科的發(fā)展既需要強大先進的技術(shù)支撐，更需要先進的理 論指導(dǎo)， TAS在發(fā)展中還需要更多的基礎(chǔ)理論來更深入地理解 和

21、掌握物質(zhì)在微米尺度流動狀態(tài)下的行為，例如微米通道中的傳 質(zhì)、導(dǎo)熱、吸附及微區(qū)反應(yīng)規(guī)律等。這些都對相關(guān)的理論研究提 出了新的挑戰(zhàn)！,7.3.2 微型全分析系統(tǒng)及微流控分析芯片發(fā)展簡史 微流控分析芯片的出現(xiàn)在現(xiàn)代分析科學(xué)與分析儀器的發(fā)展中有其 歷史的必然性?；仡櫧?0余年發(fā)展歷史會看到分析系統(tǒng)的自動化 微型化趨勢早在1950s和1960s即已出現(xiàn)，其發(fā)展動力主要來自于 環(huán)境及材料科學(xué)的發(fā)展中對更多更準(zhǔn)更快地獲取物質(zhì)成分信息的 需要。 Skeggs創(chuàng)始的間隔式連續(xù)流動分析(segmented continuous flow analysis, SCFA)是這一時期發(fā)展的有代表性的成功范例。其成功 之

22、處在于首次突破了延續(xù)了200年的分析化學(xué)傳統(tǒng)操作中以玻璃 器皿和量器為主要工具的操作模式，把分析化學(xué)轉(zhuǎn)移到有流體連 續(xù)流動的管道中，數(shù)毫米內(nèi)徑數(shù)米長的玻璃或聚合物管道不僅是 化學(xué)反應(yīng)的新容器，而且也成為分析操作實現(xiàn)連續(xù)化自動化的“ 傳送帶”。 液體連續(xù)驅(qū)動手段蠕動泵！,圖7.8 SCFA系統(tǒng)示意圖(a)和FIA系統(tǒng)示意圖(b) S 試樣；A空氣；R試劑；CR載液,SCFA雖然在溶液分析自動化方面取得了成功，在分析操作所 需面積的減少方面也有所貢獻，但在設(shè)備和試樣、試劑消耗及 微型化方面卻進展不大，分析速度比傳統(tǒng)的手工操作也無顯著 提高。后者是因為限制分析速度的因素是化學(xué)反應(yīng)本身，而非 溶液操作

23、過程。 Ruzicka和Hansen于1975年提出了FIA。他們在繼承連續(xù)流動觀 念的同時，徹底拋棄了SCFA中要求在流動中必須實現(xiàn)物理平衡 (完全混合)與化學(xué)平衡(反應(yīng)完全)的觀念，去除了管道中同時起 間隔與攪拌作用的氣泡，提出了在非平衡(不完全混合、不完全 反應(yīng))條件下實現(xiàn)重現(xiàn)性定量分析的技術(shù)條件。他們利用了細管 道(<1 mm內(nèi)徑)中液體層流狀態(tài)的可控性與重現(xiàn)性，加上準(zhǔn)確的 時間(即流速)控制，實現(xiàn)了重現(xiàn)、但非完全的混合狀態(tài)，并在此 基礎(chǔ)上來實現(xiàn)重現(xiàn)、而未必完全的化學(xué)反應(yīng)。,這一觀念的提出大大地提高了分析速度，使每小時測定上百種試 樣成為可能，同時也促進了分析系統(tǒng)的微型化。試樣與試劑消

24、耗 從<10 mL水平降低到10200L水平。分析操作也從簡單的自動 進樣-檢測發(fā)展到包括溶劑萃取、柱分離、沉淀、共沉淀、氣-液 分離、滲吸等在內(nèi)的試樣多種前處理自動化。 經(jīng)過30年的發(fā)展，F(xiàn)IA已經(jīng)滲透到涉及溶液分析的幾乎所有分析 化學(xué)領(lǐng)域，不僅促進了分析化學(xué)自動化和微型化的發(fā)展，同時也 為TAS的提出鋪平了道路。 Ruzicka和Hansen早在1984年就提出了集成化微管道系統(tǒng)( Integrated microconduit systems, IMCS)的概念，并取得了一定 的成功。但由于當(dāng)時科學(xué)技術(shù)整體水平的局限性，至少他們當(dāng)時 并未清楚地意識到需要通過多學(xué)科交叉來進一步發(fā)展他們的學(xué)

25、術(shù) 思想，從而錯過了一次重要的發(fā)展機遇！,Manz和Widmer則在發(fā)展TAS方面要顯得更為幸運和富有遠見。 他們最初的嘗試是首先把FIA轉(zhuǎn)移到微加工芯片上。所構(gòu)建的流 動注射光度測定TAS裝置為多層芯片結(jié)構(gòu)，主要是采用了單晶 硅材料加工。裝置的復(fù)雜性使人們對其未來發(fā)展前景不敢過于樂 觀。 然而當(dāng)時分析化學(xué)另一學(xué)科的迅速崛起為TAS提供了一個重要 的發(fā)展機遇毛細管電泳分離！一方面，毛細管電泳為TAS提 供了方便靈活的，在微尺度下電滲驅(qū)動手段；另一方面，在芯片 上加工的毛細管電泳- TAS又顯示出比傳統(tǒng)毛細管電泳更優(yōu)良的 性能。 Manz與Harrison于1992年合作發(fā)表了首篇微加工芯片上完

26、成的毛 細管分離的論文，展示了TAS的發(fā)展?jié)摿?。隨后，科學(xué)家們迅速 把TAS的發(fā)展重點定位在基于MEMS技術(shù)的平板玻璃或石英芯片 上的電滲驅(qū)動的毛細管電泳分離微流控系統(tǒng)。,1994年以后，美國一些著名大學(xué)研究組的介入使該領(lǐng)域的發(fā)展 迅速出現(xiàn)高潮。 1994年Ramsey group 1995年Mathies group 1995年 Caliper Technologies 公司 1995年Whitesides group 1999年惠普公司研制出第一臺微流控芯片商品化儀器開始銷售 2001年 Lab-on-a-chip學(xué)術(shù)季刊創(chuàng)建 2001年中國自然科學(xué)基金委啟動第一個重大研究計劃,7.3.3

27、 微型全分析系統(tǒng)的分類 TAS可分為芯片式與非芯片式兩大類。芯片式是發(fā)展重點。 在芯片式TAS中，依據(jù)芯片結(jié)構(gòu)及工作機理又可分為微流控 芯片和微陣列(生物)芯片。它們均依托于MEMS技術(shù)，目前又 都主要服務(wù)于生命科學(xué)，但前者以微通道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，后 者以微探針陣列為結(jié)構(gòu)特征。 微陣列芯片目前的主要應(yīng)用對象是DNA分析，所以也稱為DNA 或基因芯片。其發(fā)展要稍微早于微流控芯片，始于1980s，主要 是在生物遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的。 微流控芯片主要是在分析化學(xué)的學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展起來的。,表7.1,圖7.9 (a)典型的微流控芯片 (b)典型的微陣列(生物)芯片,Microarray (Bio) Chi

28、ps,Sample preparation Mass transport Mixing Reaction Sample injection Separation Detection,Microfluidic chips,Structure：microchannel network functions： all functions of an analytical Lab,Microfluidic chip,Main functions:,7.3.4 流控分析芯片特點 微流控芯片的優(yōu)點 (1)微流控芯片具有極高的效率，可在數(shù)秒至數(shù)十秒時間內(nèi)自動 完成分離、測定或其他更復(fù)雜的操作。分離和分析速度常

29、高于 相對應(yīng)當(dāng)宏觀分析方法一至二個數(shù)量級。其高分析或處理速度 即來源于微米級通道中的高導(dǎo)熱和傳質(zhì)速率，也直接來源于結(jié) 構(gòu)尺寸的縮小。 (2)微流控分析的試樣與試劑消耗已降低到數(shù)微升水平，并隨著 技術(shù)的提高，還可能進一步減少。降低了分析費用戶貴重生物 試樣的消耗，也減少了環(huán)境的污染。 (3)用微加工技術(shù)制作的微流控芯片部件的微小尺寸使多個部件 與功能可能集成在數(shù)平方厘米的芯片上，在此基礎(chǔ)上易制備功 能齊全的便攜式儀器，用于各類現(xiàn)場分析。 (4)微流控芯片的微小尺寸使材料消耗甚微。當(dāng)實現(xiàn)批量生產(chǎn)后， 芯片成本可望大幅度降低，有利于普及。,微流控芯片的局限性 (1)作為TAS的主要發(fā)展前沿，當(dāng)前的微

30、流控芯片系統(tǒng)總體 上既不夠“微”，分析功能也遠達不到“全”。主要原因是集成 度不夠高，多數(shù)檢測器的體積過大，實現(xiàn)集成化還有很長的 路要走。 (2)在目前加工條件下微流控分析制作成本還難以滿足有關(guān)成 果推廣應(yīng)用的要求。一塊供研究用的標(biāo)準(zhǔn)玻璃芯片價值100多 美元。一塊供分析12個試樣的一次性專用芯片價值10美元。 (3)目前報道的大部分微流控芯片分析系統(tǒng)不包括試樣的前處 理功能，即功能不夠全，為了解決實際試樣的分析，這方面 的研究需要在應(yīng)用領(lǐng)域的實用過程中大大加強。,7.3.5 微流控芯片的分類 根據(jù)芯片材料的不同可分為： 硅芯片 玻璃芯片 石英芯片 高聚物芯片 硅-玻璃、硅-石英、玻璃-高聚物

31、等復(fù)合材料芯片。 根據(jù)功能不同可分為： 高分辨分離芯片； 微采樣(進樣)芯片； 微檢測(傳感器)芯片； 細胞分析芯片； 前處理芯片； 化學(xué)合成芯片； 多功能集成芯片。,7.3.6 微型全分析系統(tǒng)的發(fā)展趨勢與展望 (1)繼微陣列(生物)芯片后，微流控分析芯片已成為TAS當(dāng)前的發(fā) 展前沿。例如，近期TAS的會議論文中微流控分析芯片占87%， 微陣列芯片占4%。 (2) TAS與微流控芯片已經(jīng)從以毛細管電泳分離為核心分析技術(shù) 發(fā)展到液-液萃取，過濾，無膜擴散等多種分離手段。 (3) TAS從以電滲流為主要驅(qū)動手段發(fā)展到包括流體動力，氣壓 重力，離心力，剪切力等多種分離手段。 (4)微流控分析系統(tǒng)從單

32、道檢測發(fā)展到多重平行檢測。陣列通道數(shù) 在2003年最多已達384道。 (5) TAS已從以激光誘導(dǎo)熒光為主要檢測器發(fā)展到多種檢測手段， 如光度法，電化學(xué)，質(zhì)譜，原子光譜，化學(xué)發(fā)光等。 (6) TAS已開始從單純的毛細管電泳分離檢測發(fā)展到包括復(fù)雜試 樣前處理的高功能全分析系統(tǒng)。 (7) TAS已開始從成分分析工具發(fā)展到包括在線檢測的微型化學(xué) 反應(yīng)與合成手段，在新藥篩選中顯示出強大的生命力。,(8)微流控芯片已開始從進行一般成分分析發(fā)展為單分子單細胞分 析。 (9) 微流控芯片已開始從主要為玻璃基質(zhì)發(fā)展玻璃與高分子聚合物 材料并重，尤其在芯片的產(chǎn)業(yè)化方面，后者因易于實現(xiàn)批量生產(chǎn) 而將更具備優(yōu)勢。

33、(10) 微流控理論研究日益受到重視，通道及結(jié)構(gòu)長度的縮小對傳 統(tǒng)流體力學(xué)提出了新的挑戰(zhàn)。通過數(shù)學(xué)模型的建立及計算機模擬 手段可望大大簡化微流控系統(tǒng)的設(shè)計。 (11)微流控系統(tǒng)在細胞分類、分析，甚至微生物的培養(yǎng)中，都正 在顯示出其獨特的優(yōu)越性，而吸引了眾多研究力量的投入。 (12) TAS已開始從基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段進入產(chǎn)業(yè)化及市場開 發(fā)階段。商業(yè)領(lǐng)域的競爭將日趨激化。 10年？20年？,7.4微流控分析芯片加工技術(shù),7.4.1微流控分析芯片的結(jié)構(gòu)和加工特點 微流控分析芯片是通過微加工技術(shù)將微管道、微泵、微閥、微 儲液器、微電極、微檢測元件，窗口和連接器等功能元件像集成 電路一樣，使它們集成

34、在芯片材料(基片)上的微全分析系統(tǒng)。 其結(jié)構(gòu)和加工特點如下： (1)以微管道為網(wǎng)絡(luò)，將微泵、微閥、微儲液器、微電極、微檢測 元件等連接在一起，對加入微通道中的流體進行控制與分離測定， 以完成多種分析功能，如采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢 測等。 (2)微流控分析芯片的面積為幾個平方厘米。 (3)微管道寬度和深度為微米級。 (4)芯片材料已從硅片發(fā)展到玻璃，石英，有機聚合物等，因此也 發(fā)展了有機聚合物材料的加工技術(shù)。在傳統(tǒng)的光刻和蝕刻的基礎(chǔ) 上發(fā)展了模塑法，熱壓法，激光燒蝕法，LIGA技術(shù)和軟光刻等新 方法。,Microfluidic chip,silicon、glass and quart

35、z polymers,microlithography chemical etching modling procedure microcontact printing thermopress soft lithography (DRIP,SFB,ECR),,,,,,,Materials,Fabrication tech,7.4.2微流控分析芯片的材料 用于制作微流控分析芯片的材料有單晶硅、無定形硅、玻璃、石 英、金屬和有機聚合物，如環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚碳酸酯(PC)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。 PDMS：（1）能可逆和重復(fù)變形而不發(fā)生永久性破壞；（2）能用 模塑

36、法高保真地復(fù)制微流控芯片；（3）能透過300nm以上的紫外 和可見光；（4）耐用且有一定的化學(xué)惰性；（5）無毒、價廉。,7.4.3光刻和蝕刻技術(shù) 微細加工技術(shù)是微流控分析系統(tǒng)發(fā)展的前提條件。 微流控分析芯片上微通道的制作，起源于制作半 導(dǎo)體及集成芯片所廣泛使用的光刻(lithography) 和蝕刻技術(shù)(etching)。它是用光膠、掩模和紫外 光進行微制造，工藝成熟，已廣泛地用于硅，玻 璃和石英基片上制作微結(jié)構(gòu)。,圖7.10 光刻和蝕刻的基本工序,光刻和蝕刻技術(shù)是由薄膜沉積、光刻和蝕刻三個工序組成。,薄膜沉積：光刻前先要在基片上覆蓋一層薄膜，厚度為數(shù)埃到幾十微米，這一工藝工程稱為薄膜沉積（氧

37、化、化學(xué)氣相沉積蒸發(fā)和濺射等）。 在薄膜表面用甩膠機均勻地覆蓋上一層光膠。 光刻：將掩膜上微流控芯片設(shè)計圖案通過曝光成像的原理轉(zhuǎn)移到光膠層上的工藝工程稱為光刻（涂覆光膠、光刻機通過曝光將掩模上光膠轉(zhuǎn)移到光膠層、顯影液溶解）。 蝕刻：將光膠層上的平面二維圖形轉(zhuǎn)移到薄膜上并進而在基片上加工成一定深度微結(jié)構(gòu)的工藝（濕法蝕刻和干法蝕刻）。 通過選用適當(dāng)?shù)目涛g劑，使它對光膠、薄膜和基片材料的腐蝕速度不同，可以在薄膜或基片上產(chǎn)生所需要的微結(jié)構(gòu)。復(fù)雜的微結(jié)構(gòu)可通過多次重復(fù)薄膜沉積-光刻-蝕刻這三個工序來完成。,光刻掩膜的制備 光刻掩膜的基本功能是當(dāng)光線照射其上時，圖形區(qū)和 非圖形區(qū)對光線的吸收和透射能力不同

38、。如下圖所示。,7.4.4高分子聚合物微流控芯片的加工技術(shù) 高分子聚合物基片上制作微通道的技術(shù)有模塑法，熱壓法， LIGA技術(shù)，激光燒蝕法和軟光刻等。 軟光刻是相對于微制造領(lǐng)域中占主導(dǎo)地位的光刻而言的微 圖形轉(zhuǎn)移和微制造的新方法。因光刻不但需要昂貴的設(shè)備 和超凈實驗室，也不能在曲面上加工微結(jié)構(gòu)。 從1995年開始，G.Whitesides等以自組裝單分子層(self- Assembled monolayer, SAMs)，彈性印章(elastomeric stamp )和高聚物膜塑技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)展了一種新的低成本的微細 加工新技術(shù)“軟光刻”（soft lithography）。軟光刻技術(shù)的 核

39、心是圖形轉(zhuǎn)移元件-彈性印章。方法有微接觸印刷法，毛 細微模塑法，轉(zhuǎn)移微模塑法和微復(fù)制模塑法等。它不僅可 在高聚物等材料上制造復(fù)雜的三維微通道，而且可以改變 材料表面的化學(xué)性質(zhì)，有可能成為低成本的微流控分析芯 片的新方法。,圖7.11 模塑法復(fù)制彈性印章,制作彈性印章的最佳材料 是PDMS。采用光刻等技術(shù) 先制得有關(guān)微結(jié)構(gòu)的母模， 用模塑法在其上澆注PDMS， 固化剝離得到表面精細圖形 的彈性印章。 表面自由能低，化學(xué)性質(zhì) 穩(wěn)定，與其他材料不黏連； 與基片正交接觸嚴(yán)密，容易 取模；柔軟，易變形，彈性 好，可在曲面上復(fù)制微圖 形。,7.4.5微流控分析系統(tǒng)中微流體的驅(qū)動和控制 微流控芯片分析系統(tǒng)在

40、結(jié)構(gòu)上的主要特征是各種構(gòu)型的 微通道網(wǎng)絡(luò)，通過對通道內(nèi)流體的操控，完成芯片系統(tǒng) 的分離分析功能。而研究與微通道相適應(yīng)的微流體驅(qū)動 技術(shù)是實現(xiàn)微流體控制的前提和基礎(chǔ)。 根據(jù)實現(xiàn)微流體控制時使用方法的不同，基本微流控技 術(shù)可分為：驅(qū)動（微泵）控制、微閥控制、芯片微通道 構(gòu)型控制和通道表面性質(zhì)控制。,7.5微流控分析芯片的應(yīng)用,圖7.12 芯片毛細管電泳的基本示意圖,兩種芯片毛細管電泳芯片結(jié)構(gòu),圖7.13（A）細胞分析實驗所采用的微流控裝置的圖像。（B）A中所示 的微流控裝置中乳化和溶胞交點的示意圖。實線表示本體流體流動的方向， 虛線是溶胞后標(biāo)記組分的電泳遷移方向。,圖7.14細胞溶胞的CCD圖像。

41、（A）標(biāo)記過Calcein AM的Jurkat細胞（在 白色橢圓形內(nèi)）正被流體動力傳輸?shù)饺馨帯＜毎膱D像有些變形，原因 是CCD攝相機的積分（曝光）時間與細胞流動的時間相比太長。箭頭表示流 體在通道中的流動方向。細胞上不清楚的線和點是由于照相機讀出時象素刺 目的閃光所引起的。（B）細胞遇到電場被溶胞熒光標(biāo)記的組分被注射到分離 通道中，向正極遷移。箭頭所指的方向為溶胞產(chǎn)物在通道中遷移的方向。 （C）所觀察到的是分離兩種熒光標(biāo)記組分（用星號標(biāo)出）的情況。,Mathies 集成芯片研究歷史變化,目前正以此研究單細胞快速鑒定、蛋白組高速分離、宇宙空間生命研究,簡單芯片,高密度集成,,,,96-cha

42、nnel radial capillary array electrophoresis microplate,Y. Shi et al. Anal. Chem., 1999, 71, 5354,Reactions in droplets in microfluidic channels,Reactions in droplets in microfluidic channels,Ismagilov et al., Angew. Chem. 2006,Quake, Science, 2005.,Radiolabeled Imaging Probe Synthesizer,Quake, Scien

43、ce, 2005,作業(yè) 8： 簡單闡述為什么微全分析系統(tǒng)是分析化學(xué)的發(fā)展趨勢？ 軟光刻技術(shù)的優(yōu)點是什么？,第八章,Case Study,8.1導(dǎo)言 8.2定量分析的流程 8.3Two cases studies,8.1 導(dǎo)言,雜亂無章、無從下手 典型的定量分析流程 七個步驟,8.2定量分析的流程,步驟一： 選擇方法 （1）分析精確度（精度確與時間、投入的綜合考慮） （2）樣品的數(shù)量（多與少的關(guān)系） （3）樣品的復(fù)雜程度等（組分?jǐn)?shù)等） 步驟二： 獲取樣品 代表性（特別是非均勻的樣品及生物樣品），分析測定 的可靠性很大程度上與取樣有關(guān) 步驟三： 樣品制備 不同的樣品有不同的方法（大多數(shù)

44、情況下，需要進行 樣品制備（哪些分析化學(xué)技術(shù)不需要樣品制備？）,步驟四： 消除干擾 步驟五： 校正和測量濃度 步驟六： 計算結(jié)果 步驟七： 估算結(jié)果的可靠性,8.3.1 A case study,Deer Kill: A case study illustrating the use of analytical chemistry To solve a problem in toxicology,問題,問題的提出 在Kentucky西部的國家野生動物保護區(qū)，一護林員在 一個小池塘邊發(fā)現(xiàn)了一只死的白尾巴鹿！ 他將該發(fā)現(xiàn)上報，州動物診斷實驗室的一名化學(xué)家與 他一起調(diào)查鹿的死因；隨后幾天他們又發(fā)現(xiàn)

45、兩只死鹿。 他們注意到附近的草變色了，懷疑是附近用了農(nóng)藥，可 能是含有砷的農(nóng)藥。 他們將死鹿運回實驗室，并采集了附近的草樣品。 目的：通過分析樣品，確定砷的存在及其形態(tài)和濃度。 從而查明鹿死亡的原因，保護其他的鹿或動物。,選擇方法： 查閱Offical Methods of Analysis (Association of Offical Analytical Chemists, AOAC)，發(fā)現(xiàn)生物樣品中砷的 分析方法：通過蒸餾將三氧化二砷轉(zhuǎn)化為氫化砷（AsH3）， 采用光度法進行測定。 獲取樣品： 他們在實驗室中將死鹿進行解剖，取腎（被懷疑 的毒素砷主要存在于腎）。 樣品制備： 將腎切碎、

46、高速攪拌機中打碎、混合均勻；制 備實驗室分析樣品（10克，從每個死鹿）及重復(fù)測定樣品。 將樣品放入坩鍋中加熱，使有機組織轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳。 剩余的干灰中可能含有As2O5，加入HCl后，轉(zhuǎn)化為可溶解 的H3AsO4。,消除干擾：將H3AsO4轉(zhuǎn)化為AsH3 ，可以消除干擾。 測定濃度：采用光度法進行測定。,計算結(jié)果： 16和22ppm(10 ppm)； 600ppm （草含有砷） 估算數(shù)據(jù)的可靠性：進行三次 以上測定。,8.3.2. Case study II - DNA 測序,1953Waston and Crick 報到了DNA的結(jié)構(gòu)，闡明了其作為 儲存遺傳信息的中心作用。,Jam

47、es D. Watson and Francis Crick who, using x-ray data collected by Rosalind Franklin, proposed the double helix structure of the DNA molecule in 1953. Their article, Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid, is celebrated for its treatment of the B form of DNA (B

48、-DNA), and as the source of Watson-Crick base pairing of nucleotides. They were, with Maurice Wilkins, awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1962. According to legend, as they walked into the Eagle pub in Cambridge Crick announced, We have found the secret of Life.,8.3.2.1 DNA測序技術(shù)-測序目

49、的 測定未知序列確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)對突變進行定位和鑒定比較研究 人類基因組計劃（HGP,1990年提出，到2005年完成?。?參考文獻： How Capillary Electrohporesis Sequenced the Human Genome N.Dovichi and J.Zhang, Angew.CHem.Int.Ed., 2000, 39, 443 Human Genome Project: How Analytical Chemists Savedor at least gave a helping hand. Analytical Chemistry, Jan.1,

50、2002,8.3.2.2 DNA測序技術(shù)-發(fā)展歷史 DNA sequencing technology，在分子生物學(xué)研究中，DNA的 序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測 序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止 法和Maxam和 Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種 方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點 開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A，T，C，G 四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上 電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。 Sanger 與Gilbert 于1980年因發(fā)展DNA測序的分析方法而

51、獲得 化學(xué)Nobel獎。,70年代末，Walter Gilbert發(fā)明化學(xué)法、Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧終止法手動測序，同位素標(biāo)記 80年代中期，出現(xiàn)自動測序儀 （應(yīng)用雙脫氧終止法原理）、 熒光代替同位素，計算機圖象識別90年代中期，測序儀重大改進、集成化的毛細管電泳 代替凝膠電泳2001年完成人類基因組框架圖 2003年完成人類基因組圖(?),8.3.2.3 分析化學(xué)的貢獻 如何在15年內(nèi)完成人類30億堿基對的測序，在當(dāng)時對于誰來講， 都是頭疼和棘手的事！ 關(guān)鍵問題是速度！ 人類基因組計劃（HGP）的提前完成是分析化學(xué)在解決生命 科學(xué)重大問題應(yīng)用的一個非常典型的例子。 199

52、0年所提出的HGP計劃目標(biāo)是準(zhǔn)備花費30億美元，在2005年 完成人類30億堿基對的序列測定。事實上，1986年就已經(jīng)有自 動化的DNA測序儀，但其速度無法使HGP計劃在2005年完成。 如何提高速度，發(fā)展高通量的DNA測序儀器就成為該計劃的重 中之重。,分析化學(xué)家們抓住了機會，在1999年研制出商品化的 高通量DNA測序儀（Applied Biosystems公司的 Model 3700 DNA sequencer），從而使該計劃在2001年 提前完成。 該高通量DNA測序儀是各種分析化學(xué)方法 和技術(shù)聯(lián)用的結(jié)晶，它集合了毛細管電泳（CE）、 陣列CE、激光誘導(dǎo)熒光、DNA熒光標(biāo)記、多通道熒光 檢測、可更新CE柱材料等分析化學(xué)方法與技術(shù)，這些 方法與技術(shù)大部分是在上世紀(jì)80與90年代所發(fā)展起來 的?？梢娚鐣枨罄瓌恿朔治龌瘜W(xué)的發(fā)展，同時分析 化學(xué)也為重大科學(xué)計劃的解決做出了至關(guān)重要的貢獻。,國家人類基因組南方研究中心,3700 DNA測序儀,,,Happy New Year!,考試時間：1月12日下午24 考試地點：二教105教室 預(yù)祝同學(xué)們考出好的成績！,答疑時間： 上午7：30-11 下午：2：30-4：30 B301/B307,