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1、乙肝病毒大蛋白研究---HBV large surface protein-----北京地壇醫(yī)院 魏紅山教授,病毒血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo),直接指標(biāo)：外膜蛋白(表面抗原）、降解或代謝產(chǎn)物蛋白、病毒核酸DNA或RNA 間接指標(biāo)：各種抗體IgG、IgM等,目前乙肝實(shí)驗(yàn)血清學(xué)檢測(cè)的需要,狀況：指標(biāo)不少，但是缺少以下關(guān)鍵指標(biāo) 1,什么是e-CHB肝炎（e抗原陰性肝炎）血清學(xué)指標(biāo)？ 、抗病毒治療沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室終點(diǎn)指標(biāo)，臨床肝炎治療合理用藥指導(dǎo)，避免過(guò)度用藥特別是陰性后應(yīng)該持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間用藥？,目前臨床乙肝病毒檢測(cè)的缺陷,、HBeAg陰性肝炎(小三陽(yáng)肝炎)的血清學(xué)診斷指標(biāo)缺乏 過(guò)去認(rèn)為大三陽(yáng)轉(zhuǎn)小三陽(yáng)即HBeAg的陰轉(zhuǎn)意

2、味著乙肝病毒復(fù)制降低，傳染性減弱，但是近年國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)部分小三陽(yáng)在血清轉(zhuǎn)化（或變異）后病毒仍然復(fù)制，而且預(yù)后更嚴(yán)重。 但是目前沒(méi)有血清免疫學(xué)指標(biāo)可以檢測(cè)小三陽(yáng)病毒攜帶者是否病毒復(fù)制！ 、藥物治療效果評(píng)價(jià)血清學(xué)指標(biāo)缺乏 由于HBsAg非常難轉(zhuǎn)陰，而HBV DNA轉(zhuǎn)陰停藥容易反彈，抗病毒治療缺乏終點(diǎn)指標(biāo)！,抗病毒治療效果監(jiān)測(cè),臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。 以HBV DNA陰轉(zhuǎn)作為治療的終點(diǎn)不恰當(dāng)，此時(shí)停藥病情易反復(fù)。,小三陽(yáng)兩種預(yù)后,,,病毒休眠不復(fù)制預(yù)后好,病毒保持復(fù)制水平肝硬化肝癌,,,什么指標(biāo)能夠分辨開(kāi)?,抗病毒治療過(guò)程中病毒顆粒消退順序,,,,,,,,,,,最先消失,其次

3、消失,最后消失,,,DNA 陽(yáng)性 大蛋白陽(yáng)性,,DNA陰性 大蛋白陽(yáng)性,DNA陰性 大蛋白陰性,抗病毒治療效果監(jiān)測(cè),臨床上缺乏評(píng)估抗病毒治療效果的指標(biāo)。 以HBV DNA陰轉(zhuǎn)作為治療的終點(diǎn)不恰當(dāng)，此時(shí)停藥病情易反復(fù)。,沒(méi)有指標(biāo)預(yù)示治療終點(diǎn),期望HBsAg轉(zhuǎn)陰，帶來(lái)過(guò)高期待，導(dǎo)致過(guò)度用藥，增加患者負(fù)擔(dān)以及浪費(fèi)資源；據(jù)估計(jì)每年20-40左右的治療是“多余”的。 陰轉(zhuǎn)就停藥，導(dǎo)致過(guò)早停藥，引起病情反彈,尋找比外周血DNA檢測(cè)更合適的指標(biāo),大部分人熟悉的“乙肝兩對(duì)半”檢測(cè)，其實(shí)并非乙肝病毒的傳染物質(zhì)和致病物，乙肝兩對(duì)半”只能反映一個(gè)人是否感染過(guò)乙肝，卻不能直接深入地揭示乙肝病毒在人體內(nèi)的復(fù)制和致病情況

4、，也就不能更好地指導(dǎo)臨床用藥和制訂治療方案。 有效的辦法乙肝病毒DNA定量試驗(yàn)，但是外周血中DNA陰轉(zhuǎn)已經(jīng)不能作為治療終點(diǎn) 還有比DNA更好的標(biāo)志物嗎,HBeAg陰性活動(dòng)期肝炎,HBeAg 陰性活動(dòng)期肝炎臨床診斷現(xiàn)狀： (1) 傳統(tǒng)“兩對(duì)半”指標(biāo)不能反映此類患者HBV復(fù)制程度； (2) 缺乏指導(dǎo)合理治療的指標(biāo)； (3) HBV DNA檢測(cè)不易于各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開(kāi)展； (4) 臨床上急需能夠反映HBV復(fù)制程度及指導(dǎo)治療的血清學(xué)指標(biāo)。,解決方案,通過(guò)研制針對(duì)復(fù)雜構(gòu)象結(jié)構(gòu)的大蛋白的單抗直接檢測(cè)大蛋白反式激活域 大蛋白是外周血中唯一可以檢測(cè)的病毒反式激活因子 大蛋白與肝內(nèi)病毒復(fù)制密切相關(guān)，和病情反彈密

5、切相關(guān)，是抗病毒治療的輔助終點(diǎn)指標(biāo),大蛋白檢測(cè)可以彌補(bǔ)目前項(xiàng)目的不足 -----檢測(cè)Dane顆粒、管狀病毒顆粒,大蛋白與肝內(nèi)病毒復(fù)制（不是外周血）密切相關(guān) 用于e抗原檢測(cè)的補(bǔ)充 大蛋白晚于血液內(nèi)消退，早于HBsAg消退 大蛋白直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，直接毒性作用 大蛋白具有反式激活增強(qiáng)病毒復(fù)制作用,HBV-LHBs臨床使用的意義 -----e抗原的補(bǔ)充,、 病毒攜帶者體內(nèi)病毒復(fù)制的確切血清學(xué)指標(biāo)，特別是e抗原變異或轉(zhuǎn)化后可作為e抗原的補(bǔ)充。 2、 大蛋白具有反式激活病毒復(fù)制的能力，大蛋白存在與否可預(yù)測(cè)病情反彈，大蛋白轉(zhuǎn)陰是病毒清除的最早跡象，可以作為抗病毒治療終點(diǎn)輔助指標(biāo)。,HBV的表面抗原的

6、組成,,不存在單獨(dú)前蛋白，前是大蛋白一部分,乙肝病毒包膜蛋白研究進(jìn)展,1995-2004年 發(fā)現(xiàn)大蛋白前S區(qū)有復(fù)雜構(gòu)象結(jié)構(gòu)，是被發(fā)現(xiàn)具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的第一個(gè)病毒外膜蛋白 1996年 發(fā)現(xiàn)大蛋白具有反式激活病毒復(fù)制的作用 2002年 發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肝細(xì)胞病變及凋亡的主要原因是大蛋白（致病性蛋白） 2003年Nature發(fā)表文章總結(jié)其反式激活機(jī)理 2004年 國(guó)際上進(jìn)行大蛋白特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究 2004年 成功構(gòu)建針對(duì)構(gòu)象型表位的單克隆抗體,反式激活蛋白,在同一條核酸鏈上起調(diào)控基因表達(dá)作用的核酸序列稱為順式作用元件； 反式激活（transactivation）,既某一基因的編碼蛋白轉(zhuǎn)而激活同一基因的遠(yuǎn)離部位，

7、或另一基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒的一些組成蛋白具有反式激活作用。,,,,蛋白質(zhì),DNA,反式激活作用,大蛋白試劑臨床研究,1、HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本中HBVLP的陽(yáng)性符合率,注：1 阿德福韋抗病毒治療患者43例，共檢出HBV DNA陽(yáng)性152次； 2 拉米夫定抗病毒治療患者51例，共檢出HBV DNA陽(yáng)性133次。,,2、不同HBV DNA拷貝數(shù)中HBVLP陽(yáng)性率以及OD值比較,大蛋白試劑臨床研究,,注：解放軍傳染病研究所，HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBVLP OD值的相關(guān)系數(shù),r=0.945,大蛋白試劑臨床研究,注：北京地壇醫(yī)院與沈陽(yáng)傳染病醫(yī)院匯總，其中北京地壇醫(yī)院為阿德福韋抗病毒治療患者標(biāo)本。HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與HBVLP含量（ng）的相關(guān)系數(shù),3、不同HBV DNA拷貝數(shù)中HBVLP陽(yáng)性率以及含量比較,,r=0.935,大蛋白試劑臨床研究,大蛋白試劑臨床研究,,,5、HBV DNA、HBeAg與HBVLP三者在乙肝患者中的比較,浙江湖州中心醫(yī)院拉米夫定治療監(jiān)測(cè),HBVLP可以作為一個(gè)評(píng)估抗病毒治療效果以及判定治療終點(diǎn)的指標(biāo)，能夠合理的指導(dǎo)患者的用藥，避免過(guò)早停藥導(dǎo)致的病情反復(fù)。,