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1、第4章 菌種保藏的原理和方法,菌種保藏的重要意義在于如何保持優(yōu)良菌種其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定，滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。 菌種的保藏的基本原理都是根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑，生長繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。 一般可以通過降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、低溫、干燥和缺氧等方法，達(dá)到防止突變、保持純種的目的。,斜面保藏法 45冰箱中保藏，保藏期36月 穿刺保藏法 45冰箱中保藏，保藏期612月 沙土管干燥保藏法 密封45冰箱中保藏，保藏期12年 真空冷凍干燥保藏法 安瓿管45冰箱中保藏，保藏期510年 液氮保藏法 安瓿管保藏在150或196的液氮中，保藏期23年 懸液保藏

2、法 密封在10或室溫（1820）保藏，保藏一年或更長 低溫保藏法 密封20以下的低溫中保藏，保藏期約在一年左右,保藏方法,第5章 微生物的代謝調(diào)節(jié),在實(shí)際生產(chǎn)中，要達(dá)到超量積累產(chǎn)物，提高生產(chǎn)效率，必須打破微生物原有的代謝調(diào)控系統(tǒng)，在適當(dāng)?shù)臈l件下，讓微生物建立新的代謝方式，高濃度地積累人們所期望的產(chǎn)物。 為達(dá)到這一目的，可以采用兩種方式： 一種就是通過各種育種方法，選育基因突變株，從根本上改變微生物的代謝； 另一種是控制微生物的各種培養(yǎng)條件，影響其代謝過程。,5.1 微生物的代謝類型和自我調(diào)節(jié),1. 代謝類型 微生物的生長繁殖主要是依賴于兩種代謝途徑，即分解代謝和合成代謝。 微生物的分解代謝和合

3、成代謝是相互關(guān)聯(lián)、相互制約的，成為其生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。 1）微生物通過分解代謝將從環(huán)境中吸收的各種碳源、氮源等物質(zhì)降解，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能源和小分子中間體。 2）微生物的合成代謝是利用分解代謝的能量和中間體合成氨基酸、核酸等單體物質(zhì)，及蛋白質(zhì)、核酸、多糖等多聚物。,2. 微生物自我調(diào)節(jié)的部位 許多化合物代謝的部位是受到控制的，有三種控制方式： 1）細(xì)胞膜對大多數(shù)親水分子起一種屏障作用，但又存在著某些輸送通道。 2）調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶量和改變酶分子的活性。對酶量的調(diào)節(jié)可以通過增加或減少關(guān)鍵酶的合成或降解速率進(jìn)行。 3）限制基質(zhì)的有形接近。 微生物自我調(diào)節(jié)的三個(gè)部位實(shí)際上也就是三個(gè)類型，但都涉及到酶促反

4、應(yīng)調(diào)節(jié)。 酶促調(diào)節(jié)的方式包括酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩大類。從調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)上看，酶活性調(diào)節(jié)的效果是即時(shí)而又迅速的；而酶量調(diào)節(jié)涉及到酶蛋白合成，所以調(diào)節(jié)的效果較慢。這兩種調(diào)節(jié)方式往往同時(shí)存在于同一個(gè)代謝途徑中，而使有機(jī)體能夠迅速、準(zhǔn)確和有效地控制代謝過程。,5.2 酶活性調(diào)節(jié),1. 酶的激活作用和酶的抑制作用 酶活性調(diào)節(jié)包括兩個(gè)方面，即酶的激活作用和酶的抑制作用。 酶的激活作用是指在某個(gè)酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，某種低分子質(zhì)量的物質(zhì)加入后，導(dǎo)致原來無活性或活性很低的酶轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚曰蚧钚蕴岣撸姑复俜磻?yīng)速率提高的過程。能引起酶的活力提高（或獲得）的物質(zhì)稱為酶的激活劑。 酶的抑制作用是指在某個(gè)酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，

5、某種低分子質(zhì)量的物質(zhì)加入后，導(dǎo)致酶活力降低的過程。能引起酶的活力降低（或喪失）的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 激活劑和抑制劑可以是外源物質(zhì)，也可以是機(jī)體自身代謝過程中產(chǎn)生與積累的代謝產(chǎn)物。,2. 酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制 酶活性調(diào)節(jié)的機(jī)制包括酶的變構(gòu)理論和酶分子的化學(xué)修飾調(diào)節(jié)理論。 1 ）變構(gòu)調(diào)節(jié)理論 變構(gòu)調(diào)節(jié)是通過條件的變化，使酶分子空間構(gòu)型上的變化來引起酶活性的改變。變構(gòu)酶一般具有相當(dāng)高的分子質(zhì)量，并由多個(gè)亞基組成，這些亞基多是相同的。每個(gè)亞基都具有催化和變構(gòu)調(diào)節(jié)的位點(diǎn)。 2）變構(gòu)分子內(nèi)部的化學(xué)修飾作用 有的變構(gòu)酶可以通過修飾酶作用與某種物質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合，導(dǎo)致酶的化學(xué)組成發(fā)生變化，從而提高或降低酶的活性。

6、當(dāng)酶不與這種特定的物質(zhì)結(jié)合時(shí)，該酶的活性就喪失（或降低），或者獲得活性（或提高活性）。,5.3 酶合成的調(diào)節(jié),酶量調(diào)節(jié)的方式包括誘導(dǎo)和阻遏兩種類型。 1)誘導(dǎo)作用指在某種化合物（包括外加的和內(nèi)源性的積累）作用下，導(dǎo)致某種酶合成或合成速率提高的現(xiàn)象。 誘導(dǎo)酶又稱為適應(yīng)性酶，是依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。能夠誘導(dǎo)某種酶合成的化合物稱為該酶的誘導(dǎo)劑。 誘導(dǎo)劑可以是誘導(dǎo)酶的底物，也可以是底物的結(jié)構(gòu)類似物。 一種誘導(dǎo)酶的合成可以有一種以上的誘導(dǎo)劑，但不同的誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)能力不同。并且誘導(dǎo)能力還與誘導(dǎo)劑的濃度有關(guān)。 當(dāng)某種物質(zhì)加入后，引起細(xì)胞代謝速率提高可以是激活，亦可以是誘導(dǎo)，這可用

7、酶的定量分析方法來確定。,5.3 酶合成的調(diào)節(jié),2)阻遏作用是指在某種化合物作用下，導(dǎo)致某種酶合成停止或合成速率降低的現(xiàn)象。 如果代謝產(chǎn)物是某種合成途徑的終產(chǎn)物，這種阻遏稱為末端產(chǎn)物阻遏；如果代謝產(chǎn)物是某種化合物分解的中間產(chǎn)物，這種阻遏稱為分解代謝產(chǎn)物阻遏。,5.4 分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),許多生物合成途徑具有兩個(gè)以上的末端產(chǎn)物，這種分支合成途徑的調(diào)節(jié)方式比直鏈?zhǔn)酱x途徑要復(fù)雜得多。調(diào)節(jié)機(jī)理包括： 同工酶調(diào)節(jié) 協(xié)同反饋調(diào)節(jié) 累加反饋調(diào)節(jié) 增效反饋調(diào)節(jié) 順序反饋調(diào)節(jié) 激活和抑制聯(lián)合調(diào)節(jié) 酶的共價(jià)修飾等方式,5.5 能荷調(diào)節(jié),能荷是指細(xì)胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的

8、量度。細(xì)胞的能荷可由下式計(jì)算： 當(dāng)細(xì)胞中全部是ATP時(shí)，能荷最大，為100；若全部是AMP時(shí)，能荷最小，為 0；而當(dāng)全部為 ADP時(shí)，能荷為 50。 能荷調(diào)節(jié)也稱腺苷酸調(diào)節(jié)，指細(xì)胞通過改變 ATP、ADP、AMP三者比例來調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)。它們所含能荷依次遞減。上述三者在細(xì)胞中的含量不同，表明細(xì)胞的能量狀態(tài)不同。 能荷不僅調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類的活性，也調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類的活性。,5.6 代謝調(diào)控,在人為控制的條件下，可以使微生物過量產(chǎn)生各種初級代謝產(chǎn)物、中間代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。 1. 發(fā)酵條件的控制 1）改變各種發(fā)酵條件 2）使用誘導(dǎo)物 3）添加生物合成的前體 4）培養(yǎng)基成

9、分和濃度的控制 2. 改變細(xì)胞透性 加入某種物質(zhì)改變細(xì)胞的通透性。 3. 菌種遺傳特性的改變 改變微生物的遺傳特性，即改變酶的活性或酶的合成系統(tǒng)，使之對反饋調(diào)節(jié)不敏感，也能夠達(dá)到過量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的目的。如利用各種突變株。,5.7 初級代謝和次級代謝,5.7.1初級代謝和次級代謝 初級代謝是一類普遍存在于生物中的代謝類型，是與生物生存有關(guān)的，涉及能量產(chǎn)生和能量消耗的代謝類型。初級代謝過程自始至終都存在于一切生活細(xì)胞之中，并與機(jī)體的生長過程呈平行關(guān)系。初級代謝產(chǎn)物，都是有機(jī)體生存必不可少的物質(zhì)，這些物質(zhì)的合成中的任何環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，有可能引起生長停止，甚至導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生突變或死亡。 次級代謝是某些微生

10、物為了避免代謝過程中，某種代謝產(chǎn)物的積累造成的不利作用，而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型，通常是在生長后期合成。通過次級代謝合成的產(chǎn)物稱為次級代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物并不是微生物生長所必需的，即使在這些代謝的某個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)生障礙，也不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體生長停止或死亡，僅僅是影響了機(jī)體合成次級代謝產(chǎn)物的能力。次級代謝則僅在機(jī)體生長的某一個(gè)時(shí)期產(chǎn)生，或在微生物的對數(shù)生長期后期或在穩(wěn)定期，與微生物的生長不呈平行關(guān)系。,5.7 初級代謝和次級代謝,在不同的微生物中，初級代謝產(chǎn)物基本相同，而次級代謝產(chǎn)物是非常不同的。 初級代謝對環(huán)境變化的敏感性比較小，即遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，而次級代謝對環(huán)境條件的變化很敏感，其產(chǎn)物的合成往

11、往會(huì)因環(huán)境條件的變化而停止。 催化初級代謝產(chǎn)物合成的酶專一性強(qiáng)，而催化次級代謝產(chǎn)物合成的某些酶專一性不強(qiáng)。,5.7.2 次級代謝的調(diào)節(jié)類型,次級代謝產(chǎn)物的種類在不同的微生物中非常不同，所以次級代謝途徑遠(yuǎn)比初級代謝復(fù)雜。已知抗生素等次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控類型包括誘導(dǎo)調(diào)節(jié)、碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)、磷酸鹽調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、生長速度調(diào)節(jié)等。,5.8 代謝工程,代謝工程是指利用基因工程技術(shù)，定向地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，以改變微生物的代謝特性，并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)領(lǐng)域。 1.改變代謝途徑 改變代謝途徑是指改變分支代謝途

12、徑的流向，阻斷其它代謝產(chǎn)物的合成，以達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的。改變代謝途徑有各種方法，如加速限速反應(yīng)、改變分支代謝途徑流向、構(gòu)建代謝旁路、改變能量代謝途徑等不同方法。,5.8 代謝工程,2.擴(kuò)展代謝途徑 擴(kuò)展代謝途徑是指在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端產(chǎn)物。或使原來的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝產(chǎn)物。 3.轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑 轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑系指將催化一系列生物反應(yīng)的多個(gè)酶基因，克隆到不能產(chǎn)生某種新的化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物的微生物中，使之獲得產(chǎn)生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少數(shù)基因，使細(xì)胞中原來無關(guān)的兩條代謝途徑聯(lián)結(jié)起來，形成新的代謝途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物；或?qū)⒋呋骋淮x途徑的基因組克隆到另一微生物中，使之發(fā)生代謝轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物。,,,