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氧合型肌紅蛋白氧化反應(yīng)及機(jī)理

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1、氧合型肌紅蛋白氧化反應(yīng)及機(jī)理 氧合型肌紅蛋白氧化反應(yīng)及機(jī)理 2016/05/09 《物理化學(xué)學(xué)報(bào)》2016年第四期 摘要: 肌紅蛋白通常在無光條件下可進(jìn)行輸氧、儲(chǔ)氧等重要功能,實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)紫外光照射可促進(jìn)氧合肌紅蛋白(MbO2)的氧化反應(yīng),證實(shí)其在光照時(shí)部分生理功能會(huì)發(fā)生變化。紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜數(shù)據(jù)顯示,光照射時(shí)MbO2的Soret帶最大吸收波長藍(lán)移、Q吸收帶544和580nm處還原峰強(qiáng)度下降,說明紫外光光照促進(jìn)O2

2、解離,MbFe(II)可被氧化至MbFe(III)。四種波長光對光照氧化的影響程度為254nm>280nm>430nm>409nm;通入CO氣體時(shí)氧合肌紅蛋白較難發(fā)生光照氧化反應(yīng),即Fe的第六配位強(qiáng)度影響反應(yīng)程度;溶液中的H+或OH-對光照氧化反應(yīng)有促進(jìn)作用;254、280nm波長光照射時(shí),苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)三種游離氨基酸均促進(jìn)光照氧化反應(yīng)的進(jìn)行,而409、430nm波長光照射時(shí)三種游離氨基酸對光照氧化反應(yīng)的影響較小。以上數(shù)據(jù)表明體內(nèi)光誘導(dǎo)MbO2氧化反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)內(nèi)的Fe(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價(jià)鐵被氧化的關(guān)鍵。

3、 關(guān)鍵詞: 氧合肌紅蛋白;紫外光;游離氨基酸;光照氧化;光譜法 1引言 生物進(jìn)程中,血紅素蛋白具有輸氧、儲(chǔ)氧或電子傳遞等重要的功能1,2,其結(jié)構(gòu)及配體結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程成為當(dāng)前研究重點(diǎn)3-6。血紅素輔基具有特殊的共軛和金屬配位結(jié)構(gòu),可吸收特定波長的光,改變血紅素電子激發(fā)態(tài),并進(jìn)一步影響蛋白功能,目前光照射血紅素類蛋白的研究也逐漸受到關(guān)注7-12。Mb在肌肉組織中扮演著重要的生理角色,如細(xì)胞內(nèi)氧氣的供應(yīng),促進(jìn)O2從細(xì)胞外圍到線粒體末端的運(yùn)輸?shù)?3,14。Mb軸向配體的光解離反應(yīng)動(dòng)力學(xué)同樣引起了相當(dāng)多的關(guān)注,Nollmann和Etchegoin

4、15及Etchegoin等16曾分別用共振拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼譜對光誘導(dǎo)的血紅蛋白的去氧進(jìn)行了研究,F(xiàn)ranzen等17曾報(bào)道Mb激發(fā)態(tài)弛豫過程涉及兩個(gè)中間體MbI*和MbII*,MbI*是MLCT血紅素的激發(fā)態(tài),MbII*是LMCT血紅素的激發(fā)態(tài)。熒光技術(shù)研究了光誘導(dǎo)肌紅蛋白去氧的過程,結(jié)果表明光照量增強(qiáng)時(shí),去氧量增大,光照時(shí)溫度越高,去氧速率越快18,整個(gè)光解過程受到溫度、溶劑粘性、激發(fā)光強(qiáng)度和激發(fā)波長的影響19;利用紫外-可見光可以誘導(dǎo)高鐵肌紅蛋白、細(xì)胞色素C的還原反應(yīng)20-22,反應(yīng)會(huì)受試劑、pH值、溫度、時(shí)間、氣體、氨基酸等因素的影響23。但根據(jù)我們目前所查閱的文獻(xiàn)情況,肌紅蛋白紫

5、外-可見光照射下可引發(fā)的氧化反應(yīng)尚缺乏實(shí)驗(yàn)報(bào)道和機(jī)理闡釋,體液中的游離氨基酸是否影響光照肌紅蛋白氧化還原反應(yīng)?因此本實(shí)驗(yàn)利用UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜(CD)方法研究了溶液中不同紫外定波長、pH值、氨基酸以及不同氣體等對光誘導(dǎo)氧化的影響,通過檢測血紅素中心鐵原子價(jià)態(tài)、蛋白構(gòu)象的變化,來闡明MbO2光照氧化的潛在機(jī)制。 2實(shí)驗(yàn)部分 2.1試劑與儀器儀器:紫外可見分光光度計(jì)(V-560,日本Jas-co公司),熒光分光光度計(jì)(FP-5600,日本Jasco公司),圓二色分光光度計(jì)(J-810,日本Jasco公司),制冷和加熱循環(huán)器(F-12,德國Jul

6、abo公司,實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(PHSJ-4A,上海雷磁分析儀器廠),實(shí)驗(yàn)用光源為熒光分光光度計(jì)氙燈。試劑:馬心肌紅蛋白樣品(購自美國Sigma公司),UV-Vis吸收光譜特征表明全部為高鐵肌紅蛋白,將其溶解在pH=7.4的PB緩沖溶液(0.05molL-1)中,用過量的連二亞硫酸(0.1molL-1)將其還原,過量的連二亞硫酸鈉通過透析的方法除去,用紫外吸收法測定其濃度。酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸分別溶解在0.05molL-1的PB緩沖溶液中配置成濃度均為0.01molL-1的氨基酸溶液,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。 2.2實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1UV-Vis吸收光譜將已經(jīng)處理好

7、的樣品置于1cm石英比色池中進(jìn)行測定,測定條件為:狹縫寬度為2nm,掃描波長范圍為220-700nm,掃描速率為200nmmin-1,響應(yīng)時(shí)間中等。 2.2.2CD光譜將已經(jīng)處理好的樣品置于1mm石英比色池中進(jìn)行CD光譜測定,測定條件為:狹縫寬度1nm,掃描波長范圍為190-50nm,掃描速率為50nmmin-1,響應(yīng)時(shí)間為2s,累計(jì)次數(shù)3次。 3結(jié)果與討論 3.1MbO2的化學(xué)氧化與光照氧化圖1A是MbO2的紫外-可見吸收光譜變化曲線,曲線a→f是氧化劑鐵氰化鉀對MbO2紫外-可見吸收光譜的影響,在MbO2溶液中加入鐵氰化鉀(MbO2與鐵氰化鉀

8、的摩爾比為1.5:1)時(shí),其Q帶544、580nm處吸收峰消失,Soret帶416nm處吸收峰藍(lán)移至409nm處,505、630nm處出現(xiàn)新的吸收峰,即MbO2被完全氧化為氧化態(tài)。通入恒定N2氣流、避光90min后MbO2的特征吸收峰強(qiáng)度有輕微的變化(圖S1見SupportingInfor-mation),但經(jīng)254nm波長紫外光照射1.5h后(圖1B),隨著光照時(shí)間的增加,MbO2蛋白的Soret帶特征吸收416nm處,吸收峰強(qiáng)度升高并藍(lán)移至409nm處;Q帶544和580nm處吸收峰強(qiáng)度有一定的降低,而在503和630nm附近處出現(xiàn)兩個(gè)新峰,并且吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),與未光照時(shí)相比發(fā)生了明顯

9、的變化,說明氙燈254nm光誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)與加入氧化劑鐵氰化鉀的效果相同。 3.2光照氧化的波長選擇為研究紫外波段光源照射MbO2的氧化情況,我們選用FP-6500型熒光光譜儀上氙燈的不同定波長來光照MbO2蛋白溶液。MbO2樣品在不同定波長(254,280,409和430nm)氙燈光照后,其Soret帶416nm處吸收峰強(qiáng)度增大并發(fā)生藍(lán)移,在Q帶544和580nm處吸收峰強(qiáng)度降低,503和630nm處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng),隨著光照時(shí)間增加,503nm處峰面積在不斷增大(見圖2)。在不同定波長的光照射下,Q帶的峰面積變化也不相同,其中在254nm光照射下544和580nm處吸收峰面積

10、降低的趨勢最大,即氧化產(chǎn)物MbFe(III)最多。由于metMb三價(jià)鐵結(jié)合水的吸收峰在409nm處,二價(jià)鐵離子還原態(tài)在430nm處,且430nm波長光為MbO2的最佳激發(fā)波長19,O2解離后五配位的二價(jià)鐵易于吸收430nm波長光。由此可見,四種波長光對光照氧化的影響程度為254nm>280nm>430nm>409nm。鐵卟啉可吸收上述四種波長的光,但吸收后,鐵卟啉被激發(fā)后所處的激發(fā)態(tài)不同,后期過程的能量轉(zhuǎn)移途徑不同,因此對氧化還原的影響程度不同,高能量的254和280nm波長光使卟啉處于激發(fā)態(tài),能量和電子在卟啉內(nèi)轉(zhuǎn)移,會(huì)促使鐵氧化過程發(fā)生,雖然430和409nm波長光處于卟啉的強(qiáng)吸收帶Sore

11、t帶,但由于吸收后電子轉(zhuǎn)移能力較差,鐵不易被氧化。 3.3氨基酸對光照氧化的影響芳香族游離氨基酸的紫外吸收在200-300nm波長區(qū)域,為此我們選取300-650nm光譜范圍來研究光照射時(shí)氧合肌紅蛋白的變化,從而排除游離氨基酸的光吸收對所測得MbO2光譜產(chǎn)生光譜疊加的干擾。避光條件下,游離氨基酸與MbO2作用1h后的紫外-可見吸收光譜,相較于未加入氨基酸的MbO2,五條譜線完全重合(圖S3),這表明未光照時(shí)游離的氨基酸與MbO2的化學(xué)反應(yīng)基本不存在。在相同定波長光照射下,由于不同種類的游離氨基酸所含原子基團(tuán)、表面電荷以及對光的選擇吸收的不同,會(huì)對MbO2的光誘導(dǎo)氧化產(chǎn)生不同影響

12、。圖3(A,B)分別為254、280nm波長光照射加入Trp、Tyr和Phe的MbO2的紫外-可見吸收光譜。254nm波長光照射加入三種氨基酸的MbO2蛋白溶液1h后,Soret帶416nm處吸收峰藍(lán)移程度變大,Q帶544和580nm處吸收峰強(qiáng)度下降十分明顯,且在Phe和Tyr存在下,MbFe(II)已被完全氧化為MbFe(III);280nm波長光照射時(shí),加入Phe、Tyr和Trp的MbO2蛋白溶液,其MbFe(II)均已被完全氧化為MbFe(III);而在409nm(圖S4)、430nm(圖S4)波長光照射時(shí),氨基酸對光照氧化反應(yīng)幾乎沒影響。在有色游離氨基酸存在時(shí),254和280nm波長光

13、激發(fā)致使氧化程度增強(qiáng)可能有兩個(gè)途徑:途徑一是光激發(fā)有色氨基酸,氨基酸進(jìn)行能量傳遞至鐵卟啉;途徑二是氨基酸被光激發(fā)后產(chǎn)生氨基酸自由基形式,進(jìn)一步激發(fā)卟啉形成自由基。芳香族氨基酸在409、430nm波長處無紫外吸收,在此波長光照射下氨基酸不被激發(fā),因而對光照氧化反應(yīng)進(jìn)程無影響。氨基酸實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明,較低能量激發(fā)卟啉,卟啉自由基電子能量較低難以激發(fā)Fe的電子致激發(fā)態(tài),F(xiàn)e(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價(jià)鐵被氧化的關(guān)鍵。 3.4氣體、pH值對光照氧化過程的影響處于還原態(tài)的MbO2蛋白溶液不穩(wěn)定,易被空氣中的氧化物緩慢氧化,CO可以與還原態(tài)肌紅蛋白結(jié)合,不

14、與高鐵肌紅蛋白結(jié)合。圖4是不同氣體存在條件下光照引起MbO2氧化的結(jié)果,通入N2和O2均可促進(jìn)光照氧化,且O2>N2>空氣。通入CO后,促使O2離去之后,不發(fā)生光照氧化反應(yīng),而是CO與空位Fe(II)發(fā)生配位反應(yīng)20,使得Soret帶發(fā)生紅移,是因?yàn)镕e的第六配位強(qiáng)度影響反應(yīng)程度,促使反應(yīng)向配位反應(yīng)進(jìn)行,而不發(fā)生二價(jià)鐵的氧化反應(yīng)。metMb在低pH時(shí)是水合的,即aqua-形式,在pH5.5→4.0時(shí),蛋白質(zhì)隨著pH值繼續(xù)降低,氨基酸基團(tuán)質(zhì)子化造成了血紅素結(jié)合位點(diǎn)的改變,并使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了巨大的改變24;但在pH達(dá)到9.0時(shí)溶液中氫氧根濃度足夠大,從而取代了原來血紅素中第六配位的水進(jìn)行配位,即

15、hydroxide-形式,pH值大于9.0時(shí),肌紅蛋白還易形成二聚體,為此我們考查了pH值為5.5、6、7.4、8.0的緩沖溶液中MbO2光照氧化情況。MbO2蛋白溶液在恒定N2氣流下避光靜置1.5h后(圖S2),pH值為7.4、8.0時(shí)其特征吸收峰強(qiáng)度無變化,pH為6.0時(shí)其特征吸收峰強(qiáng)度相對于另外兩種pH值有微小變化,但總體來講避光條件下pH對MbO2蛋白溶液無影響。圖5為不同pH值下MbO2蛋白在254nm波長氙燈照射下,544和580nm處吸收峰面積隨照射時(shí)間變化圖。光照1.5h后544和580nm處吸收峰強(qiáng)度降低,pH為7.4時(shí)兩處吸收峰面積均比pH為5.5、6.0或8.0時(shí)下降程度

16、小,說明偏酸、偏堿性條件均有利于光照氧化的發(fā)生。 3.5MbO2光照氧化二級結(jié)構(gòu)的變化蛋白質(zhì)是由氨基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子,在蛋白質(zhì)或多肽中,主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香族氨基酸殘基及二硫橋鍵。遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜反應(yīng)肽鍵的圓二色性,因此,根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD光譜,能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息25。如圖6A所示,在靠近192nm有一正的譜帶,在222和208nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶,這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的CD光譜特征。隨著光照時(shí)間增加,192nm正吸收峰與208和222nm處表現(xiàn)出的兩個(gè)負(fù)吸收峰的強(qiáng)度減小,但形

17、狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變,這說明光照氧化MbO2引起其二級結(jié)構(gòu)的變化。圖6B為加入氨基酸并光照1h后的遠(yuǎn)紫外CD光譜,MbO2的結(jié)構(gòu)變化不是很大,和未加氨基酸光照1h后的CD曲線基本重合,這說明在整個(gè)光照氧化過程中MbO2結(jié)構(gòu)的改變是由光照引起的,而不是和氨基酸直接作用發(fā)生的,這也說明氨基酸在MbO2的光照氧化過程中是間接影響光照氧化的。 3.6光誘導(dǎo)MbO2氧化反應(yīng)機(jī)制通過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析我們可推出MbO2的光照氧化的可能機(jī)理,F(xiàn)e(II)的d電子組成為d6,未光照時(shí),F(xiàn)e(II)電子組態(tài)處于強(qiáng)場,可以提供d軌道與O2的孤電子對形成配位鍵,以攜帶儲(chǔ)存氧氣;光照使鐵卟啉至激

18、發(fā)態(tài),F(xiàn)e(II)電子組態(tài)處于弱場,成對電子被激發(fā)后Fe上d軌道電子處于自旋多重態(tài),F(xiàn)e電子占據(jù)鐵的空軌道,空軌道減少,配位鍵減弱,氧氣離去。處于多重態(tài)的五配位的Fe(II)電子轉(zhuǎn)移至卟啉,形成卟啉自由基,F(xiàn)e(II)被氧化為Fe(III)。通入CO后,F(xiàn)e(II)與CO配位能力較強(qiáng),且CO因含有π鍵,F(xiàn)e被激發(fā)后的電子可能轉(zhuǎn)移到CO的LUMO軌道,因此CO較難離去,F(xiàn)e無法將電子轉(zhuǎn)移至卟啉,從而光照氧化還原反應(yīng)難以進(jìn)行,證實(shí)了步驟(I)的推測(如圖7所示)。409和430nm波長光照射氧化能力不如254和280nm,說明409和430nm波長光雖然是卟啉環(huán)Soret帶最大吸收峰波長,但卟啉吸

19、收致激發(fā)態(tài)后總能量較低,難以使Fe(II)達(dá)到高自旋狀態(tài),因而Fe(II)難以被氧化,而254和280nm波長光被卟啉吸收后可以發(fā)生配體-金屬電荷轉(zhuǎn)移(LMCT),使Fe至激發(fā)態(tài)。卟啉自由基不穩(wěn)定,進(jìn)一步激發(fā)溶液中的H2O產(chǎn)生H和OH-,在偏酸或偏堿性條件下,H和OH-分別被溶液中的OH-和H+破壞,光照反應(yīng)右移氧化程度增大,我們的pH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此步驟機(jī)理(II)的推測(見圖7)。光照后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化,隨著光照氧化時(shí)間增加,MbFe(III)含量升高。這是因?yàn)镸bFe(II)是六配位結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,蛋白α-螺旋含量較高,而MbFe(III)是五配位結(jié)構(gòu),F(xiàn)e與四個(gè)N原子不在同一平面

20、上,光照致使卟啉環(huán)平面變化,進(jìn)而影響了蛋白的二級結(jié)構(gòu),同時(shí)CD數(shù)據(jù)表明,MbO2蛋白溶液在光照氧化過程中并未變性,說明整個(gè)過程中蛋白三維結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化,協(xié)助O2離去、Fe被氧化過程,并適應(yīng)以上過程中鐵卟啉的結(jié)構(gòu)變化。 4結(jié)論 通過光譜法研究光誘導(dǎo)氧合型肌紅蛋白的氧化反應(yīng),結(jié)果表明不同定波長、pH值以及氣體、游離有色氨基酸等外界因素對光氧化MbO2均有影響。254、280nm波長光能量較高,照射較易激發(fā)鐵卟啉進(jìn)而進(jìn)行光照氧化過程,卟啉Soret帶最大吸收波長光被吸收后較難激發(fā)鐵卟啉;pH在偏酸性或偏堿性條件下均對MbO2的光照氧化較有利;加入游離有色氨基酸對光照氧

21、化反應(yīng)的影響程度取決于紫外光的波長;通入N2、O2均可促進(jìn)光照氧化,通入CO后,不發(fā)生光照氧化反應(yīng),而是CO與Fe(II)發(fā)生配位反應(yīng),CO不易離去,致使光照氧化反應(yīng)難以進(jìn)行。通過CD光譜分析發(fā)現(xiàn),光誘導(dǎo)促進(jìn)MbO2氧化反應(yīng)進(jìn)行后,蛋白肽鏈伸展結(jié)構(gòu)增加,色氨酸所處的微環(huán)境極性增加,α-螺旋含量降低,蛋白在結(jié)構(gòu)上也適應(yīng)光照氧化反應(yīng)的過程。數(shù)據(jù)表明體內(nèi)光誘導(dǎo)MbO2氧化反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)內(nèi)的Fe(II)能否被光照激發(fā)形成未成對電子處于激發(fā)態(tài)是O2離去和二價(jià)鐵被氧化的關(guān)鍵。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方法將有助于深入的了解光照射對生物體內(nèi)血紅素蛋白結(jié)構(gòu)及功能的影響,在生理學(xué)和醫(yī)學(xué)上具有重要的價(jià)值。

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