狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷:重慶狂犬抗體檢測(cè)指南
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1、泓域健康/重慶狂犬抗體檢測(cè) 狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷 一、 狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷 病人發(fā)病后(死亡前)可采集其唾液(間隔3-6小時(shí),至少采集3份)、腦脊液、血清及頸后帶毛囊的小塊皮膚;病人死后最好采集其腦組織標(biāo)本(小腦和腦干)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。 直接免疫熒光法是狂犬病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),可以快速、敏感、特異地檢測(cè)人和動(dòng)物腦組織中的病毒抗原。臨床病例活體組織標(biāo)本(如頸后部皮膚毛囊)亦可進(jìn)行DFA檢測(cè)。直接快速免疫組化法及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法亦可特異檢測(cè)狂犬病病毒抗原。 病毒核酸檢測(cè)可用于早期診斷,以逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)體液(唾液、血清等)和腦組織等標(biāo)本,但需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。腦組織及唾液等病
2、毒含量高的樣本還可進(jìn)行病毒分離。細(xì)胞培養(yǎng)分離所需時(shí)間(1-2天)遠(yuǎn)少于小鼠顱內(nèi)接種分離法所需時(shí)間(10-21天),且前者的生物安全風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)小于后者。 未接種過疫苗的患者,發(fā)病早期幾乎沒有中和抗體產(chǎn)生,到發(fā)病晚期(通常在臨床癥狀出現(xiàn)后7-8天),病毒在腦內(nèi)大量增殖后突破血腦屏障進(jìn)入血液,刺激機(jī)體產(chǎn)生低水平的中和抗體。通過病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)病人血清或腦脊液中的中和抗體,可作為狂犬病診斷的依據(jù)之一。 世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的抗狂犬病病毒中和抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法包括快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)和小鼠腦內(nèi)中和試驗(yàn)(MNT)。由于RFFIT法無需使用小鼠,所用時(shí)間短(24小時(shí)),目前已被廣泛采用。RF
3、FIT方法也是我國現(xiàn)行藥典規(guī)定的檢測(cè)狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。此外,常用的狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)方法還有熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVNT)。用ELISA法測(cè)定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗體滴度與用病毒中和試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果有一定的相關(guān)性(約80%符合率),但相應(yīng)試劑盒尚未普及。 此外,還可以通過檢測(cè)中和抗體,監(jiān)測(cè)暴露前抗體背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。WHO狂犬病專家咨詢委員會(huì)認(rèn)為:中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml時(shí),接種者才具備了有效的保護(hù)能力;如果發(fā)現(xiàn)中和抗體水平低于0.5IU/ml,應(yīng)進(jìn)行加強(qiáng)免疫,至達(dá)到有效保護(hù)水平為止。 二、 常用狂犬疫苗對(duì)比 狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸
4、共患急性傳染病,多見于犬、狼、貓等食肉動(dòng)物,人多因被病獸咬傷而感染。人患狂犬病后的病死率幾近100%,目前對(duì)于狂犬病尚無有效治療手段,因此暴露后接種狂犬疫苗是預(yù)防狂犬病的關(guān)鍵。 我國常用狂犬疫苗可分為動(dòng)物細(xì)胞狂犬疫苗和人源細(xì)胞狂疫苗兩大類,其中動(dòng)物細(xì)胞狂犬疫苗常用地鼠腎、雞胚、非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞,人源細(xì)胞狂犬疫苗則使用人二倍體細(xì)胞。 三、 當(dāng)前狂犬疫苗發(fā)展面臨的問題與困境 疫苗的質(zhì)量直接關(guān)系到國家公共衛(wèi)生健康與安全,下一代人類疫苗通常是為了減少不良事件或提高現(xiàn)有疫苗的功效而開發(fā)的。目前上市的幾款狂犬疫苗在預(yù)防狂犬病方面已經(jīng)取得了巨大的成功,但仍然存在一定的局限性,因此仍然需要利用
5、現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)完善。 疫苗本身開發(fā)模式具有特殊性:研發(fā)即生產(chǎn)。車間產(chǎn)能的持續(xù)迭代背后存在大量時(shí)間成本、審批成本,產(chǎn)量決定了臨床規(guī)模及商業(yè)化規(guī)模。 血清問題:無血清培養(yǎng)是狂犬疫苗研制中世界性的技術(shù)難題,疫苗生產(chǎn)均使用動(dòng)物來源的牛血清和豬胰酶,產(chǎn)品存在外源病毒因子污染風(fēng)險(xiǎn),給后續(xù)產(chǎn)品生產(chǎn)帶來挑戰(zhàn)。降血清至無血清是國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)共同的研究趨勢(shì)。 二倍體狂犬疫苗安全性強(qiáng),為狂犬疫苗未來主要發(fā)展趨勢(shì)之一。但存在成本高、制備困難、產(chǎn)量低、大規(guī)模培養(yǎng)難度較大等技術(shù)問題。 免疫程序的選擇:世衛(wèi)組織已經(jīng)批準(zhǔn)了不同的方案,例如兩點(diǎn)皮內(nèi)注射(0,3和7天);單點(diǎn)肌肉注射(0,3,7天和第14-28
6、天之間)和3周肌肉注射(0天x2,7天x1和21天x1)疫苗接種。目前國內(nèi)狂犬病疫苗接種程序所采用的是肌內(nèi)接種,即五針法(0,3,7,14,28天)和2-1-1法(0天x2,7天x1和21天x1)。選擇最佳的免疫接種程序可有效降低成本和劑量。 中國的犬?dāng)?shù)超過1億只,其中大部分在農(nóng)村散養(yǎng)。消除狂犬病必須免疫動(dòng)物,而與歐洲等發(fā)達(dá)國家的動(dòng)物普遍免疫不同,中國接種疫苗的動(dòng)物比例較少。因此,人用狂犬病疫苗屬于剛性需求。隨著人均可支配收入的增加,國內(nèi)民眾將愈發(fā)重視對(duì)疾病的預(yù)防和管理。隨著中國人均可支配收入快速增長,人們付費(fèi)接種疫苗的意愿和能力也將隨之提高。此外,教育程度的提升會(huì)提高狂犬病疫苗接種率,這將
7、促進(jìn)人用狂犬病疫苗的銷量增長。 未來隨著國內(nèi)企業(yè)在疫苗領(lǐng)域研發(fā)投入的加大,優(yōu)質(zhì)的技術(shù)+充足的產(chǎn)能,將助力患者的可及性持續(xù)提升,推動(dòng)狂犬疫苗長期可持續(xù)發(fā)展。 狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病。幾乎所有溫血?jiǎng)游锒紝?duì)狂犬病毒易感,其中犬類是主要宿主??袢≈饕ㄟ^動(dòng)物咬傷后,唾液中的狂犬病毒經(jīng)破損皮膚侵入體內(nèi)傳播。狂犬病是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病,一旦發(fā)病死亡率接近100%,即使治愈也會(huì)留下嚴(yán)重后遺癥。目前對(duì)狂犬病缺乏有效的治療手段,因此使用狂犬疫苗預(yù)防是關(guān)鍵。 隨著我國狂犬病預(yù)防的加強(qiáng),發(fā)病人數(shù)及病死人數(shù)逐年下降。從發(fā)病病例來看,自2007年起,我國狂犬病發(fā)病病例逐步下降,目
8、前,據(jù)國家衛(wèi)健委數(shù)據(jù),2021年我國狂犬病發(fā)病病例降至157例。 四、 狂犬疫苗行業(yè)前景展望 由于人二倍體疫苗產(chǎn)量低、大體積生物反應(yīng)器培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞難度較大等因素,二代狂犬疫苗仍為國內(nèi)使用的主流狂犬疫苗。不過,康華生物正在進(jìn)行產(chǎn)能擴(kuò)建,隨著三代狂犬疫苗獲批企業(yè)數(shù)量的增加以及產(chǎn)能的不斷釋放,三代疫苗將逐步替代二代疫苗。 中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)告顯示,我國狂犬病疫情主要分布在人口稠密的華中、華南、西南、華東地區(qū)。人群分布上呈三多特征:農(nóng)村地區(qū)病例較多、15歲以下兒童和50歲以上人群發(fā)病較多。中國的犬?dāng)?shù)超過1億只,其中大部分在農(nóng)村散養(yǎng)。消除狂犬病必須免疫動(dòng)物,而與歐洲等發(fā)達(dá)國家的動(dòng)物普遍免疫
9、不同,中國接種疫苗的動(dòng)物比例較少。因此,人用狂犬病疫苗屬于剛性需求。 狂犬疫苗是我國主要出口的疫苗之一,預(yù)計(jì)到2023年,中國狂犬病疫苗主要出口國泰國、埃及、孟加拉國和印度的市場(chǎng)將達(dá)6.8億美元,年均復(fù)合增長率為22.2%。僅遼寧成大一家,2019年狂犬疫苗的出口銷售額就達(dá)到2538.7萬美元,出口份額占比超過30%。 業(yè)內(nèi)人士分析,由于公眾對(duì)狂犬病疫苗的接種意識(shí)仍然相對(duì)淡薄,一些國家和地區(qū)正在不斷推進(jìn)狂犬病疫苗接種,受政策利好影響,未來市場(chǎng)的接種率有可能提高,這也將為中國疫苗企業(yè)拓展海外市場(chǎng)提供機(jī)會(huì)。此外,由于狂犬病高發(fā)市場(chǎng)嚴(yán)重缺乏人用狂犬病疫苗生產(chǎn)商,中國狂犬病疫苗生產(chǎn)商有機(jī)會(huì)抓住該等
10、市場(chǎng)內(nèi)當(dāng)?shù)毓?yīng)商未獲滿足的日益增長的需求,從而帶動(dòng)出口市場(chǎng)的增長。 一旦出現(xiàn)臨床癥狀,病死率幾乎為100%!中國每年都有數(shù)百人因狂犬病而死亡,消除狂犬病仍存在一定的現(xiàn)實(shí)問題,包含傳染源數(shù)量多、分布廣、動(dòng)物免疫率低等。農(nóng)村地區(qū)尤其是貧困地區(qū)狂犬病流行造成的影響更為嚴(yán)重,面臨群眾文明養(yǎng)犬意識(shí)淡薄,動(dòng)物狂犬病監(jiān)測(cè)能力不足等困難與挑戰(zhàn)。 日前,在2021年中國小動(dòng)物醫(yī)學(xué)大會(huì)暨第一屆貓病大會(huì)的康華動(dòng)保狂犬病論壇上,來自全國各地的小動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)<摇W(xué)者相聚一堂,共同探討未來行業(yè)發(fā)展。與此同時(shí),啟動(dòng)中國寵物狂犬病免疫現(xiàn)狀調(diào)研項(xiàng)目,旨在了解狂犬病疫苗現(xiàn)狀及發(fā)展空間、關(guān)注寵主使用疫苗的喜好度、洞察未來市場(chǎng)
11、發(fā)展趨勢(shì)。 狂犬病是一種嚴(yán)重危害公共健康的人畜共患傳染病,也是世界上病死率最高的動(dòng)物傳染病。WHO數(shù)據(jù)顯示,狂犬病在全球150多個(gè)國家和地區(qū)流行。據(jù)估計(jì),每年狂犬病會(huì)導(dǎo)致全球約5.9萬人死亡,相當(dāng)于每10分鐘世界上就有1人死于狂犬病。 2015年,世界衛(wèi)生組織(WHO)與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和全球狂犬病控制聯(lián)盟(GARC)一起,在瑞士日內(nèi)瓦召開的全球狂犬病會(huì)議上,提出2030年前在全球消除犬引起的人類狂犬病死亡(簡(jiǎn)稱Zeroby30)戰(zhàn)略目標(biāo),此計(jì)劃以國家為中心,建立聯(lián)合抗擊狂犬病合作平臺(tái)。 五、 多家企業(yè)先后布局狂犬病疫苗的研發(fā)與生產(chǎn) 基于產(chǎn)量、
12、研發(fā)進(jìn)展、價(jià)格等多重因素,Vero細(xì)胞狂犬病疫苗與人二倍體狂犬疫苗分別具有差異化優(yōu)勢(shì),將推動(dòng)其未來在狂犬疫苗市場(chǎng)的市占率不斷提升。隨著居民健康意識(shí)和支付能力的持續(xù)提升,上述兩種研究路線將成為下一代狂犬疫苗的主流方向。 為降低外源病毒帶來的疫苗安全風(fēng)險(xiǎn),無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、有血清合成培養(yǎng)基之后研制的一類既能滿足細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖又無需添加血清避免外源物質(zhì)污染的合成培養(yǎng)基,是目前及未來生物工程領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無血清培養(yǎng)技術(shù)可適當(dāng)降低生產(chǎn)成本,增加目的產(chǎn)物表達(dá)并簡(jiǎn)化分離純化步驟,避免外源病毒污染。 目前,我國我國狂犬病疫苗在研企業(yè)已完成III期臨床試驗(yàn)的企業(yè)共有4家,正開展I
13、II期臨床試驗(yàn)的企業(yè)共有14家,正開展I期臨床試驗(yàn)的企業(yè)共有2家。其中,上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司、天津津斯特疫苗有限責(zé)任公司及成都柏奧特克生物科技股份有限公司,為國內(nèi)僅有的三家針對(duì)無血清Vero細(xì)胞狂犬病疫苗率先推進(jìn)至三期臨床試驗(yàn)的企業(yè)。 六、 狂犬病防制措施 1、免疫接種 被狂犬咬傷的人或動(dòng)物應(yīng)對(duì)傷口進(jìn)行徹底消毒,并及時(shí)到專業(yè)機(jī)構(gòu)注射狂犬病免疫血清或狂犬病疫苗。目前世界上,狂犬病尚無有效的治療手段,做好狂犬疫苗的緊急免疫接種是防制本病發(fā)生最行之有效的重要措施。即使做過狂犬疫苗預(yù)防免疫接種的人或動(dòng)物一旦被咬傷或抓傷,安全起見,仍然要再次接種狂犬疫苗,這樣會(huì)形成更快、更強(qiáng)大的保護(hù)力。
14、 2、疫病監(jiān)測(cè) 可用RT-PCR或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法對(duì)老疫區(qū)和城市重點(diǎn)區(qū)域的犬、貓進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。對(duì)病毒檢測(cè)結(jié)果為陽性的犬、貓要采取果斷措施,及時(shí)予以捕殺,并對(duì)飼養(yǎng)場(chǎng)所進(jìn)行全面消毒。 3、科普宣傳 要充分利用各種宣傳工具,如報(bào)紙、電視廣播、張貼掛圖等,大力宣傳狂犬病的危害性和預(yù)防知識(shí),尤其要加強(qiáng)農(nóng)村地區(qū)狂犬病防制宣傳工作力度,提高全社會(huì)對(duì)狂犬病防制工作的重視,提高公民被犬、貓咬傷、抓傷后主動(dòng)及時(shí)就醫(yī)的自覺性,提高人民群眾的自我防護(hù)意識(shí)。 4、加強(qiáng)管理 相關(guān)職能部門要做好犬只管理工作,特別是做好城區(qū)寵物犬的管理工作,動(dòng)員群眾養(yǎng)犬要注射疫苗,遛狗要拴繩。發(fā)現(xiàn)狂犬要立即撲
15、殺,尸體焚化或深埋。 七、 國內(nèi)狂犬疫苗市場(chǎng)持續(xù)增長 近年來,隨著我國狂犬病預(yù)防教育普及、人用狂犬病疫苗接種數(shù)量增加,我國狂犬病預(yù)防工作取得了重大進(jìn)展,在控制狂犬病發(fā)病率方面起到了重要作用。2018年,中國人用狂犬疫苗市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到28.4億元,預(yù)計(jì)2022年將達(dá)到38.7億元的市場(chǎng)規(guī)模。 Vero細(xì)胞人用狂犬病疫苗是狂犬病疫苗市場(chǎng)的主導(dǎo)者,占據(jù)75.0%的市場(chǎng)份額;人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗和原代細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗(包括地鼠腎細(xì)胞人用狂犬病疫苗和雞胚細(xì)胞人用狂犬病疫苗)分別占據(jù)18.2%和6.8%的市場(chǎng)份額。 中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)告顯示,我國狂犬病疫情主要分布在人口稠密的華中、華南、
16、西南、華東地區(qū)。人群分布上呈三多特征:農(nóng)村地區(qū)病例較多、15歲以下兒童和50歲以上人群發(fā)病較多。中國的犬?dāng)?shù)超過1億只,其中大部分在農(nóng)村散養(yǎng)。消除狂犬病必須免疫動(dòng)物,而與歐洲等發(fā)達(dá)國家的動(dòng)物普遍免疫不同,中國接種疫苗的動(dòng)物比例較少。因此,人用狂犬病疫苗屬于剛性需求。隨著人均可支配收入的增加,國內(nèi)民眾將愈發(fā)重視對(duì)疾病的預(yù)防和管理。隨著中國人均可支配收入快速增長,人們付費(fèi)接種疫苗的意愿和能力也將隨之提高。此外,教育程度的提升會(huì)提高狂犬病疫苗接種率,這將促進(jìn)人用狂犬病疫苗的銷量增長。 八、 中國RABV的動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化分析 科研人員從177個(gè)陽性腦組織樣本中總共擴(kuò)增到了108個(gè)完整的N基因。在
17、這些樣本中,科研人員分析并選擇了代表不同年份,動(dòng)物種類,疫情程度和地點(diǎn)的78種,連同來自中國以及鄰國和其他國家的222種參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育特征分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),中國動(dòng)物RABV分布在4個(gè)主要的進(jìn)化枝中:亞洲(Asian),世界性(Cosmospolitan),北極相關(guān)(Arctic-related)和印度次大陸(IndianSubcontinent),以及這些進(jìn)化分枝中不同的子分枝。其中,亞洲進(jìn)化枝是最普遍的進(jìn)化枝,廣泛分布于中國和東南亞國家,具有豐富的遺傳多樣性,主要通過狗傳播。通過查閱文獻(xiàn)研究人員發(fā)現(xiàn),雪貂獾(ferrtebadger)RABV具有豐富的遺傳多樣性,但這僅在中國有報(bào)道。印度
18、次大陸的進(jìn)化枝在中國還沒有被發(fā)現(xiàn),直到2017年在靠近尼泊爾的西藏邊境地區(qū)發(fā)現(xiàn)了由一只當(dāng)?shù)亓骼斯芬娜祟惒±?,仍然是迄今為止在中國確認(rèn)的唯一的印度次大陸分支RABV。 緊接著,研究人員利用對(duì)于不同亞類的時(shí)間排序,重新定位了1969-2018年期間分離的具有代表性的1,118個(gè)中國毒株。其中55個(gè)中國RABV序列在1969年(最早提交)至2003年分離。自2004年開始進(jìn)行官方狂犬病監(jiān)測(cè)后,提交給GenBank的基因序列表明,大多數(shù)狂犬病爆發(fā)是由亞洲毒株(93.3%)引起的,其他3種毒株的參與有限。在亞洲類群中,SEA1亞類群在中國狂犬病毒株中占主導(dǎo)地位(70.1%),其次是SEA2(16.
19、7%)。 此外,緬甸、泰國、老撾和越南的許多SEA3毒株在遺傳上接近中國云南和廣西流通的一些毒株,這表明SEA3毒株可能由中國傳播至接壤的國家和地區(qū)。在中國與哈薩克斯坦、俄羅斯、蒙古和韓國之間的邊境地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了同樣的傳播跡象。這種相似性令人擔(dān)憂,因?yàn)橹袊車?4個(gè)毗鄰的國家,所有這些國家都有狂犬病流行,在這些國家中,人們尚未對(duì)狂犬病的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育特征進(jìn)行充分研究。 在中國,狂犬病是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題,2015-2018年更是導(dǎo)致每年幾百人死亡。超過95%的人類狂犬病病例來源于患狂犬病的狗。相比之下,中國報(bào)告的動(dòng)物狂犬病病例數(shù)卻遠(yuǎn)低于人類狂犬病病例數(shù);僅有幾個(gè)省、自治區(qū)或直轄市的動(dòng)物狂犬病病例報(bào)告給國家獸醫(yī)當(dāng)局,且報(bào)告中國動(dòng)物傳染病月度信息的唯一官方雜志是《獸醫(yī)通報(bào)(VeterinaryBulletin)》。即便如此,這類零星的研究仍表明野生動(dòng)物狂犬病在赤狐(VulpesVulpes),貉(Nyctereutesprocyonoides)和鼬獾中都有增加。
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