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1、β3 .AR激動劑BRL35135、氯沙坦和二甲雙胍對肥胖大鼠心肌UCP.2mR 　　前列腺癌細胞　　Abstract:Objective To detect multidrug resistance in bladder tumor，thus to select sensitive drugs to treat invasive bladder tumor.Method In10cases of bladder tumors，P-gp，GST-p and TopoⅡwere detected by immunohistochemistry technique before

2、 intra-arterial chemotherapy.Results Before intra-arterial chemotherapy the expression rate of P-gp was30%，GST-p was10%，TopoⅡwas50%.Chemotherapy drug were THP，DDP and HCPT.After intra-arterial chemothera-py，the expression rate of P-gp was50%，GST-p was20%，TopoⅡwas40%，respectively.Conclusion Detection

3、 of P-gp，GST-p and TopoⅡplay a role in selection of drug in invasive bladder tumor.　　Key words:bladder tumor;multidrug resistance;immunohistochemistry;chemotherapy［摘要］目的: 探討過氧化物還原酶1（Prx1）表達增加對人腫瘤細胞抗過氧化氫毒性作用的影響。 方法: 構建Prx1真核表達質粒，穩(wěn)定轉染培養(yǎng)的人PC3前列腺癌細胞，用Western blot檢測Prx1在穩(wěn)定轉染PC3細胞中的表達，用MTT法觀察細胞的存活率。 結果: W

4、estern blot分析表明，Prx1真核表達質粒穩(wěn)定轉染的PC3細胞表達Prx1顯著增加;MTT分析表明，在過氧化氫濃度為0.25、0.5、1和2mmolL-1 時，Prx1穩(wěn)定轉染的PC3細胞存活率顯著增加。 結論: Prx1高表達顯著增強人PC3前列腺癌細胞抗過氧化氫毒性作用?！　。坳P鍵詞］ 過氧化物還原酶1;前列腺癌細胞;過氧化氫;穩(wěn)定轉染 　　在正常細胞代謝和對外部刺激的反應過程中，細胞可產生活性氧，包括氧自由基和過氧化氫（H2 O2 ）等等。低濃度活性氧可促進多種細胞生長、增殖［1］ ;相反，活性氧異常增加導致細胞損傷、死亡［2，3］ 。為了對抗高濃度活性氧的毒性作用，經過

5、漫長的生物進化，需氧生物特別是人類細胞都有一整套抗氧化防御機制，包括過氧化氫酶（catalase，Cat）、超氧化物歧化酶（su-peroxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，Glu）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、硫代還原物（thioredoxin，Trx）、硫代還原物還原酶（thioredoxin reductase，TR）和過氧化物還原酶（peroxiredoxin，Prx）［4］ 等等?！　rx是一類新定義的抗氧化物，在生物進化中高度保守，從低等原核生物細菌到高等生物人類，均有Prx表達。迄今，這個家族

6、已有數(shù)百個成員。在人類組織細胞中發(fā)現(xiàn)了6種Prx［5］ ，其中，Prx1、Prx2、Prx3和Prx4含有兩個保守的以半胱氨酸為中心的活性區(qū)域，稱為2.Cys Prx;而Prx5羧基端半胱氨酸不在保守區(qū)域，稱為非典型的2.Cys Prx;Prx6缺乏羧基端半胱氨酸，稱為1.Cys Prx。在這些Prx中，Prx1、2和6位于細胞漿內，Prx3特異性位于線粒體內，Prx4為分泌型，Prx5既位于過氧化物酶體，又位于線粒體內。已有資料表明，許多Prx能夠降低H2 O2 和其他過氧化物對細胞的損害。Prx1轉染能提高人內皮細胞抗H2 O2 毒性作用［6］ ;Prx1或Prx2轉染能降低H2 O2 誘

7、導的大鼠甲狀腺細胞FRTL.5的凋亡［7］ 。與相應的周圍組織比較，胰腺癌［8］ 和間皮瘤［9］ 組織表達Prx1增多;乳腺癌［10］ 、肝細胞癌［11］ 和間皮瘤［9］ 組織表達Prx3增多。本研究將觀察Prx1穩(wěn)定高表達是否影響人PC3前列腺癌細胞對H2 O2 的敏感性。 　　1 材料與方法　　1.1 試驗材料　　限制性內切酶購自NEB公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）和抗微管蛋白抗體購自Sigma公司?？筆rx1多克隆抗體和pT7Prx1質粒參見文獻［5］。 　　1.2 質粒構建　　用限制性內切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切pT7Prx1生成人Prx1cDNA完整開放讀碼框架（ope

8、n reading frame，ORF），與經同樣酶切的真核表達載體pcDNA3連接，生成質粒pcDNA.Prx1。 　　1.3 細胞培養(yǎng)　　人PC3前列腺癌細胞（美國ATCC公司）被置于含10%胎牛血清、2mmolL-1 谷氨酰胺、100kUL-1 青霉素和100mgL-1 鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞于2～3d基本融合，用0.125%胰蛋白酶.0.5%EDTA混合液消化，按1∶3～1∶4傳代培養(yǎng)。 　　1.4 穩(wěn)定轉染　　PC3細胞接種在培養(yǎng)皿中于體積分數(shù)為0.05的CO2 中37℃培養(yǎng)16～20h后，以pcDNA3空載

9、體為陰性對照，用lipofectamineTM 2000（Invitrogen）將pcDNA.Prx1轉染細胞24h。然后1∶10傳代，并用400mgL-1 G418篩選穩(wěn)定轉染細胞。 　　1.5 Western blot分析　　用冰冷PBS溶液洗上述穩(wěn)定轉染PC3細胞2遍后，加入RIPA細胞裂解液。收集細胞裂解物，置冰浴孵育10min，然后4℃、14000rmin-1 離心10min，取上清液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜。分別用抗Prx1抗體和抗微管蛋白抗體及相應的HRP標記的二抗（Amersham）檢測Prx1和微管蛋白（作為對照），然后與增強型化學發(fā)光底物（Amersham）

10、反應1min。將膜用保鮮膜包好，置暗盒中。在暗室內壓上X光片，曝光適當?shù)臅r間。取出X光片，進行適當?shù)娘@影和定影，以顯示各蛋白條帶。 　　1.6 MTT分析 　　以每孔4103 密度接種pcDNA3載體或pcDNA3.Prx1穩(wěn)定轉染的PC3細胞于96孔培養(yǎng)板各孔中，于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。以未加H2 O2 的完全培養(yǎng)基為對照，用含0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2和4mmolL-1 H2 O2 的完全培養(yǎng)基分別處理細胞24h后，每孔加入10μl MTT.PBS（5gL-1 ）。4h后加入100μl異丙醇.0.05μmolL-1 鹽酸，測定各孔OD570 的值，計算各孔細胞存活率。 　　1.7 統(tǒng)計學處理　　數(shù)據(jù)以ˉxs表示，并用ANOVA和Kruskal-Wallis分析進行顯著性差異檢驗。