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1、第八章 發(fā)酵工程下游加工工程 (downstream processing) 第一節(jié) 概 述 一 . 重要性 1. 產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié) 2. 發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng) 2. 生物產(chǎn)物的特殊特點(diǎn)：濃度、穩(wěn)定性等 幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度 產(chǎn)品 典型濃度（ g/L） 抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有機(jī)酸 100 酶 20 蛋白質(zhì) 10 4. 投資費(fèi)用高 抗生素、乙醇、檸檬酸占 60% 純化蛋白質(zhì) 8090% 5. 分離純化技術(shù)落后會(huì)阻礙發(fā)酵工程技術(shù)的 發(fā)展 5. 上游要為下游創(chuàng)造條件 選育不產(chǎn)生雜質(zhì)的菌種 胞內(nèi)產(chǎn)物變?yōu)榘猱a(chǎn)物 在細(xì)胞內(nèi)形成包含體 給目的產(chǎn)物接上特殊“

2、物質(zhì)” 二 . 基本原理 根據(jù)混合物中不同組分分配率的差異將其 分配于幾個(gè)物相中，如溶劑提取、鹽析、 結(jié)晶等 或?qū)⒒旌衔镏糜谀骋晃锵嘀校ㄒ合啵?，?各組分分配于不同區(qū)域，如電泳、超離心、 超濾等 三 . 一般程序 1. 預(yù)處理和固液分離：加速固液相分離 2. 細(xì)胞破碎分離胞內(nèi)產(chǎn)物 3. 初步純化（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性 質(zhì)差異很大的雜質(zhì) 4. 高度純化（精致）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相 似的雜質(zhì) 5. 產(chǎn)品加工 第二節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離 一 . 預(yù)處理 分離菌體和其它懸浮顆粒 去除部分可溶性雜質(zhì) 改變?yōu)V液的性質(zhì) （一）過(guò)濾特性的改變 產(chǎn)物濃度低 110% 懸浮顆粒小 液相粘度大 性質(zhì)不穩(wěn)定

3、1. 降低液體粘度 稀釋 升高溫度 2. 調(diào)節(jié) pH 改變某些物質(zhì)電荷特性 3. 凝聚與絮凝 改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì) 的分散狀態(tài) 4. 加入助濾劑 不可壓縮的多孔顆粒 硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠粉、白土、 炭粒、淀粉等 5. 加入反應(yīng)劑 消除雜質(zhì)對(duì)過(guò)濾的影響 新霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉 磷酸鈣：助濾劑，使某些蛋白質(zhì)凝固 （二）去除高價(jià)無(wú)機(jī)離子 1. Ca2+、 Mg2+、 Fe2+等影響樹(shù)脂的交換容量 2. 用草酸去除鈣離子，草酸鈣還能促進(jìn)蛋 白質(zhì)凝固 3. 三聚磷酸鈉與鎂形成可溶性絡(luò)合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ 4. 黃血鹽與鐵離子形

4、成普魯土鹽沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+ （三）去除可溶性雜蛋白 1. 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀 兩性物質(zhì)，穩(wěn)定性與所帶電荷有關(guān) 酸性溶液中帶正電荷，堿性中帶負(fù)電荷 2. 酸性溶液中與陰離子物質(zhì)結(jié)合形成沉淀 三氯醋酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味 酸鹽、鞣酸鹽、過(guò)氯酸鹽等 3. 堿性溶液中與陽(yáng)離子形成沉淀 Ag+、 Cu2+、 Zn2+、 Fe3+、 Pb2+等 4. 鹽析 親水膠體，加入堿金屬中性鹽，脫水劑 5. 熱變性 一般蛋白質(zhì)在 7080C發(fā)生不可逆變性 如鏈霉素發(fā)酵液在 pH3.0，加熱到 70 C保 持 0.5h后過(guò)濾 檸檬酸發(fā)酵液在 80 C處理 6

5、. 加入絮凝劑 7. 吸附作用 （三）去除色素及其它物質(zhì) 1. 色素產(chǎn)生 微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生，培養(yǎng)基帶來(lái) 2. 去除方法 離子交換劑、離子交換纖維、活性炭等吸附 如 DEAE-纖維素從含酶溶劑中吸附色素物質(zhì) 時(shí)，可同時(shí)去除非活性蛋白質(zhì) 二 . 發(fā)酵液固液分離 （一）離心 （二）過(guò)濾 菌種對(duì)過(guò)濾速度影響很大 真菌容易過(guò)濾，放線菌則難 培養(yǎng)基組成對(duì)過(guò)濾也有影響 第三節(jié) 微生物細(xì)胞破碎 一 . 微生物細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu) 微生物種類，培養(yǎng)基組成影響細(xì)胞壁 二 . 常用細(xì)胞破碎方法 1. 珠磨法（ bead mill） 實(shí)驗(yàn)室： Mickle搗碎機(jī)、勻漿器 Braun 中試：膠質(zhì)膜處理 工業(yè)：高速珠磨機(jī)

6、（ High-speed bead mill） 2. 高壓勻漿法 （ High pressure homogenization） 大規(guī)模細(xì)胞破碎方法 高壓勻漿器 對(duì)于酵母等難破碎及高濃度細(xì)胞可采用多 次循環(huán)方法 絲狀真菌、較小的 G+菌，含有包含體 （ Inclusion body） 的基因工程菌不宜用此 法 3. 超聲波破碎（ Ultrasonication） 桿菌比球菌容易破碎 G-比 G+容易破碎 酵母菌不易破碎 實(shí)驗(yàn)室較常用的方法，樣品溫度？ 4. 酶溶法（ Enzymatic lysis） lysozyme protease cellulase zymolyase 價(jià)格高，通用性差，產(chǎn)物抑制的存在 自溶法（ Autolysis） 5. 化學(xué)滲透法（ chemical permeation） 改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性 TritonX-100：結(jié)合、溶解磷脂，破壞膜脂 雙層 EDTA：對(duì) G-菌外膜有破壞作用 有機(jī)溶劑：分解細(xì)胞壁中的脂類 變性劑：脲、鹽酸胍與水中氫鍵作用 優(yōu)點(diǎn)：選擇性，易于固液分離 缺點(diǎn)：通用性差，效率低，毒性 6. 其他方法 X-press法 滲透壓法（ osmotic pressure） 反復(fù)凍溶法 多種方法結(jié)合 與上游過(guò)程結(jié)合 與下游過(guò)程結(jié)合