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1、環(huán) 境 生 物 工 程 1 微生物生態(tài)及其對污染物的作用 環(huán)境工程的微生物學基礎 Chapter 2 2.1 微生物多樣性 2.4 微生物的馴化 2.2 微生物的營養(yǎng) 2.5 常見污染物治理的微生 物操作技術 2.3 微生物對污染物的作用 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 2 第二節(jié) 微生物的營養(yǎng) 營養(yǎng)：生物體從外界攝取物質和能量，滿足自身 生長和繁殖需要的一種生理功能。 類 型 碳源 能源 微生物舉例 光能自養(yǎng)菌 光能異養(yǎng)菌 化能自養(yǎng)菌 化能異養(yǎng)菌 CO2 有機物 CO2 有機物 光能 光能 無機還原物 有機物 藍細菌、紫 /綠硫細菌、藻 類 紫色非硫細菌

2、（紅螺菌科細 菌） 硝化細菌、硫化細菌、鐵細 菌、氫細菌 絕大多數(shù)細菌和全部的真核 微生物 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 3 微生物的營養(yǎng)要求 六大要素： C、 N、 Energy、 GF、 H2O、 Mineral salts Carbon source: “細胞骨架 ” ，能生物降 解的菌可以利用多種有機物作為碳源。但 利用的能力不同： eg： Pseudomonas cepacia可以利用 90 種不同的有機物，而 Methanobacterium 僅僅利用 CO2和少數(shù) C1和 C2化合物。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境

3、生 物 工 程 4 Nitrogen source： 蛋白質合成和核酸合成的必需物質。 1. 環(huán)境中 N的存在形式：氮氣、銨鹽、硝酸 鹽、尿素、有機含氮化合物等； 2. 微生物可以利用多種形式的氮源： 肺炎克雷伯氏菌：利用農(nóng)藥溴苯腈 氨 假單胞菌：二硝基苯酚 硝酸鹽 氨 3、有機污染環(huán)境中， N源是微生物種群的生 長限制因子。 污染物完全降解的碳氮比范圍： 200:1 10:1 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 5 Growth factors: 主要是氨基酸 amino acid、嘌呤 purine、 嘧啶 pyridine、維生素 vitamin 需要的

4、量少，但有些微生物不能自身合成， 必需依賴外源提供，如乳酸菌必需提供多 種維生素的供應。 Auxoautotroph：生長素自養(yǎng)型 Auxoheterotroph：生長素異養(yǎng)型 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 6 Mineral salts： 微生物生長需要多種礦質元素： Macroelements常量元素：構成生物分子成 分，如磷是核酸、細胞膜的重要成分，硫是 蛋氨酸、硫胺素的成分，這些元素有 P、 S、 K、 Mg、 Ca、 Na、 Fe，濃度 10 4 10 3mol/L； Microelements微量元素： Cu、 Zn、 Mn、 Co、 Mo，

5、濃度 10 8 10 6mol/L；酶代謝 中起作用。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 7 自然環(huán)境中礦質元素含量較高，但是少數(shù)難 溶的礦質如磷，成為水環(huán)境和土壤環(huán)境中的 限制因子 。 一般要求碳磷比的范圍： 1000:1100:1 用 C/N和 C/P來評判環(huán)境的營養(yǎng)狀況要謹慎！ FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 8 水： 一般用 水活度 （ Water activity， Aw)或 水勢 （ water potential， ）來表示微生物可利用的水。 水活度 水活度事實上與平衡相對濕度含義一致，但它不是 以 0 1

6、00%RH標志 ,而是以 0 .1.0 Aw標志。平衡濕 度定義為沒有了物質與空氣中水的交換情況下，由 周圍空氣獲取的濕度值。 水勢 某一系統(tǒng)中水的化學勢與處于相同溫度和壓力的純 水的化學勢之差，除以水的偏摩爾體積所得的商。 它是水分轉移本領大小的指標。 水總是從水勢高的一方流向水勢低的一方。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 9 一般微生物需要水活度在 0.900 1.000范 圍內存活，除了極少數(shù)菌體如 Halobacter外 。 水活度值和細菌繁殖 aw = 0.91 0.95 細菌最多 aw = 0.88 酵母最多 aw = 0.80 霉菌最多 aw

7、 = 0.75 喜鹽細菌 aw = 0.70 osmiophile某些酵母 aw = 0.65 xerophile 某些霉菌 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 10 第三節(jié) 微生物對污染物的作用 微生物對污染物的作用是多方面的。包括： 降解作用，共代謝作用，去毒作用，激活 作用。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 11 1.微生物的降解作用 降解微生物 種類繁多，細菌、真菌、藻類 1）細菌 降解污染物的主力軍， 29類，廣泛對污染 物產(chǎn)生降解，包括真細菌、藍細菌和古菌 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境

8、生 物 工 程 12 2）真菌 酵母、霉菌、大型真菌對污染物都有降解。 種類 種屬 代表污染物 酵母 Candida Saccharomyces Trichosporon Rhodotorula 石油烴 石油烴，克菌丹等 石油烴 石油烴 霉菌 Aspergillus Botrytis Cladosporium Cunninghamella 石油烴，敵百蟲 石油烴、撲草凈 石油烴、撲草凈 石油烴、甲霜靈 白腐菌 平革菌 云芝 PAHs/TCDD PCP FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 13 藻類 自然界藻類和菌類共棲，降解有機物。如氧 化塘。 藻類降解： A

9、、多種酚類化合物（苯酚、鄰甲酚、苯三酚 等）、萘。 B、偶氮染料：小球藻對 33種偶氮染料脫色 能力。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 14 2.基質代謝的生理過程 微生物降解基質過程和其他化合物的代謝 相似： 向基質接近 對固體基質吸附 分泌胞外酶 可滲透物質的吸收和胞內代謝 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 15 向基質接近 接近的意思：微生物處在這種物質的可擴散 范圍內，或者胞外酶處于這種范圍內。 細菌和其他微生物表現(xiàn)出向基質的趨向性。 如：絲狀真菌向基質生長，擔子菌的探查環(huán) 境行為。 對固體基質的吸附 微生物和固

10、體基質間有非常緊密地結合 如：纖維素分解菌吸附纖維素，瀝青降解菌 牢固附著。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 16 胞外酶的分泌 天然和人工合成的大分子物質都難降解，生 物采取分泌胞外酶來達到降解作用。 胞外酶活動失效的原因： 1）酶被吸附； 2）變性； 3）被生物降解； 4）分解產(chǎn)物被競爭生物利用。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 17 細胞內代謝 異生素進入細胞后，可以通過周邊代謝途徑 被降解。 初始代謝產(chǎn)物通常匯集到少數(shù)中央代謝途徑， 參與細胞成分構建。 副反應產(chǎn)物：代謝產(chǎn)生的副反應產(chǎn)物可能產(chǎn) 生 終死產(chǎn)物 和

11、致死性產(chǎn)物 。終死產(chǎn)物本身 就是持久性的，若無其他生物代謝，將是 有害的；致死性產(chǎn)物就是代謝過程中產(chǎn)生 的產(chǎn)物抑制生物體生命循環(huán)的關鍵步驟使 得細胞死亡。如：氟代乙酸鹽是由氟取代 的基質降解形成，抑制 TCA循環(huán)。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 18 測定出不同基質條件下有機化合物的半衰期，這 些與環(huán)境因素關系很大。 類別 半衰期 生物降解快 17天 生物降解較快 728天 生物降解慢 424周 抗生物降解 612月 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 19 2.共代謝 現(xiàn)象： 1960s，一氯乙酸上生長的假單胞 菌使三

12、氯乙酸脫鹵，卻不能利用三氯乙酸 微生物不能從共代謝中受益，在純培養(yǎng)中， 共代謝 終死轉化 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 20 共代謝基質與共代謝微生物 許多化合物在培養(yǎng)物中行共代謝。如：環(huán)己 烷、氯酚、二氯苯胺、三硝基苯、甲草胺、 禾草敵、 2， 4 D。 微生物：無色桿菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌 屬、黃桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、諾卡氏菌屬、芽 孢桿菌屬；青霉屬、絲核菌屬等 共代謝轉化涉及單個或多種酶，進行羥基化、 氧化、去硝基、去氨基、水解、?；茸饔?。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 21 共代謝的原因 （ 1）缺少進一步

13、降解的酶系 （ 2）中間產(chǎn)物的抑制作用 最初的轉化產(chǎn)物抑制了后續(xù)酶的活性。 例如：惡臭假單胞菌共代謝形成 3-氯兒茶酚， 抑制了后續(xù)酶系活性導致不能降解。 2 BA Cc e l lECODCBA a cba FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 22 （ 3）需要另外的基質 需要第二種基質因為：可提供電子供體或者 起誘導作用。 如：銅綠假單胞菌要經(jīng)過正庚烷誘導產(chǎn)生羥 化酶系，使鏈烷烴轉化為相應的醇。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 23 共代謝的環(huán)境意義 共代謝是微生物轉化的一種特殊類型，會造 成不良的環(huán)境影響： a.進行

14、共代謝的微生物數(shù)量在環(huán)境中不增加， 物質轉化率降低。 b.共代謝使有機產(chǎn)物持久積累，母體的毒性 不能消除。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 24 3.去毒作用 去毒作用：污染物分子結構改變，降低或 去除對敏感物種的有害性。 去毒的酶反應通常在細胞內進行，形成的 產(chǎn)物通常有三種轉歸： a.直接分泌到胞外； b.經(jīng)過一步或多步反應，進入正常代謝途徑， 然后以有機廢物的形式分泌或： c.最后碳以 CO2的形式釋放出來。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 25 典型反應： （ 1）水解反應：酯鍵或酰胺鍵水解使得毒物脫毒 （ 2）

15、羥基化作用：在苯環(huán)或脂肪鏈上羥基化，使毒物失去 毒性 （ 3）脫鹵作用：脫鹵酶使工業(yè)廢物含鹵化合物轉化為無毒 產(chǎn)物。 （ 4）去甲基 or去烷基：許多殺蟲劑中與 N、 S、 O相連的甲 基或烷基脫去后，變成無毒。 （ 5）甲基化：有毒酚類加入甲基鈍化。 2 HORR C O O HOHR C O O R R O HRH H C lC H RR C HC H C LRR C H H C lRHR C l H C lR O HR C l H OH 2 2 2 3R O CHR O H FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 26 （ 6）硝基還原：硝基化合物對各種高等

16、 or低等生 物都是有害的，還原后毒性減輕： RNO2 RNH2 （ 7）去氨基： 如：有毒殺草劑醚草通脫氨形成對植物無毒害的 產(chǎn)物。 （ 8）醚鍵斷裂： 如：鹵代苯氧羧酸類除草劑醚鍵斷裂消除對植物 毒性。 （ 9）腈轉化為酰胺 （ 10）軛合作用（ conjugation）：生物體中間代 謝產(chǎn)物和異生素可進行合成反應，稱為軛合作用。 產(chǎn)物一般無毒性。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 27 4.激活作用 激活作用及其特點： 致癌物 致畸物 致突變物 急性毒物 毒植物素 抗菌素 迅速礦 化 活 化 緩慢礦化 無 毒 化 合 物 持久性 FEL,bio-vax

17、 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 28 激活作用的起始研究：某些農(nóng)藥本身不對靶標生物 有害，只有進入體內以后分子結構發(fā)生改變，才會 對生物體引起傷害和死亡。 激活反應： （ 1）脫鹵作用：三氯乙烯（ TCE）在微生物降解過 程中發(fā)生激活，產(chǎn)生強致癌物 氯乙烯。厭氧代 謝還可形成 1， 1二氯乙烯和反 -1， 2-二氯乙烯。 22 CHC l H CC H C lCCl FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 29 （ 2）亞硝胺的形成： 亞硝胺類化合物的基本結構為： 很強的致癌、致畸、和致突變物。 通過仲胺的 N-亞硝化作用形成。 a.仲胺和叔胺：工

18、業(yè)大量應用，河水、廢水、土 壤普遍存在。叔胺經(jīng)過脫烷基形成仲胺。 b.亞硝酸鹽形成：自然界含量低，經(jīng)過氨氧化成 硝酸鹽，再經(jīng)反硝化作用形成亞硝酸鹽。 c.亞硝胺形成：環(huán)境中極低的亞硝酸鹽足以激活 反應： N N R R O N N R R O H 2 O R R N H N O 2 - + FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 30 凡是合成的就是危險的，凡是天然的就是安全的。 植物和魚體中都含有仲胺、叔胺 消化道內微生物轉化使叔胺 仲胺，并使飲水和蔬 菜中的硝酸鹽 NO2- 微生物作用 or在低 pH值的胃內經(jīng)非生物作用形成 亞硝胺 FEL,bio-vax 環(huán)

19、 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 31 （ 3）環(huán)氧化作用：微生物可以使一些帶雙鍵的化 合物形成環(huán)氧化物，使得產(chǎn)物對動物更有毒性 （ 4）硫代磷酸酯轉化為磷酸酯： 激活反應在動物體內 or自然界中發(fā)生，氧化脫硫 造成的毒性增強可高達 1萬倍，如毒蟲畏激活后， 氧化脫硫形成強烈的膽堿酯酶抑制劑。 R O R O P S O X R O R O P O X O FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 32 其他激活方式有： 苯氧羧酸的代謝、硫醚的氧化、酯的水 解、甲基化、去甲基化等 激活的作用類型： a.典型激活：產(chǎn)物比前體物質更具有毒性； b.緩解 一種化

20、合物有兩種前途：變成毒性即 激活；轉化為無毒產(chǎn)物，從而避免了激活， 稱為緩解。 c.生物毒性譜的變化：結構改變對另一種生 物有害 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 33 第四節(jié) 微生物的馴化 馴化及其在污染物處理中的應用 土壤和水體受到污染后，特別在受到不容易 生物降解的有機物污染后，污染物開始不 發(fā)生降解或降解很慢，經(jīng)過一段時間后污 染物會迅速降解。 馴化期 （ acclimation period） :從污染物進入 環(huán)境到污染物開始迅速降解的時間間隔。 又稱：適應期（ adaptation period） ，停滯期 （ lag period） FEL,b

21、io-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 34 馴化期長短變化很大，時間取決于化學品 的種類、化學品的濃度以及環(huán)境條件。 化學品 環(huán) 境 馴化期 4硝基酚 水沉積物 40 80h 五氯酚 河水 21 35天 二硝酚 土壤 16天 氯代苯類 生物膜 10天 5個月 次氨基三乙酸 河口 50天 殺草強 土壤 7天 苯胺靈 土壤 20天 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 35 馴化：定向選育，即通過人工措施使微生 物逐步適應某種特定條件，最后獲得具有 較高耐受力和代謝活性的菌株。 原始菌株 靶化合物 靶化合物 靶化合物 高活性菌株 濃 度 逐 漸

22、 增 加 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 36 馴化的后效應 馴化期的結束標志著降解的開始。 降解某種化學品的微生物群落馴化出來， 能保持一段時期的活性。 不是所有的化合物都有馴化后效應?？赡?原因？化學品濃度太低。 例： 4硝基苯酚的馴化后 效應：在含有沉積物和天然 水的樣品中濃度高于 10g/L 才能降解，否則無法降解。 C10g/L C1 10g/L FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 37 農(nóng)藥加速降解 現(xiàn)象： 單一或反復使用某種殺蟲劑、殺菌 劑或除草劑，對有害生物的控制失效。 為什么？ 1、抗藥性產(chǎn)生； 2、化學

23、品迅速降解 農(nóng)藥加速降解 （ accelerated pesticide degradation）， 促進 生物降解 （ enhanced microbial degradation） FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 38 問題的產(chǎn)生由于馴化期長度和降解速率發(fā) 生了變化。 為了延長農(nóng)藥作用期，需要使用延緩劑 抑制生物降解菌 有些農(nóng)藥沒有此類問題：如毒死蜱、異丙 隆等 施用過的土壤比從未施用的土壤更迅速的 礦化農(nóng)藥 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 39 影響馴化的因素 1. 一種基質馴化出的微生物群落經(jīng)常同時馴 化出降解

24、部分有關結構分子的 群落 。 2. 環(huán)境因子影響馴化期的長短。如：溫度、 pH、通氣狀況、 N、 P、等等 3. 代謝化合物的濃度。微量濃度的化學品的 生物降解速率隨濃度增加而提高，但濃度 越高馴化期越長。 4. 微生物區(qū)系差異。同一種化學品在同一濃 度下，隨地點不同馴化期差異很大。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 40 產(chǎn)生馴化期的原因 對馴化期的認識，早期建立在純培養(yǎng)基礎上。 不足之處：純培養(yǎng)的細菌濃度遠遠超過自然界 單個種群密度。 重新設計的實驗來驗證假說，結果一些新的解 釋如下： 1. 群體數(shù)量太少與檢測的靈敏度不夠 2. 毒物的存在 3. 原生動

25、物的捕食作用 4. 新的基因型的出現(xiàn) 5. 二次生長 6. 酶的誘導和停滯期 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 41 1.群體數(shù)量太少和檢測靈敏度不夠 土壤、天然水、污水和廢水環(huán)境中能夠利 用合成有機化合物生長的微生物群體數(shù)量 是很少的，有時甚至只有幾個。 即使是幾個細胞在旺盛的代謝污染物，但不 會被觀察到明顯的濃度下降和細胞增加。 只有細胞分裂進入指數(shù)期，母體化合物濃度 的下降才會被觀察到。 有機物初始濃度越高，經(jīng)歷的停滯期越長！ FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 42 2.毒物的存在 抑制劑的存在影響了馴化期。 1.

26、化學品濃度很高，只有很少的微生物可以 降解； 2. 很多污染點都是有毒化學品的混合物，抑 制了微生物的降解。 地下水污染的羽狀帶，由于污染物流出使 抑制劑稀釋而發(fā)生降解。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 43 毒物有幾種方式讓馴化期延長或縮短 i. 單純抑制 ：如重金屬抑制降解 NTA，使得 活性淤泥的馴化期延長； ii. 抑制快生菌 ：毒物抑制快生菌，通常使降 解污染物的混合種群的優(yōu)勢菌株。 iii. 毒性產(chǎn)生：毒性最初不存在，在降解過程 產(chǎn)生。 如：在苯酚和 4硝基苯酚共存，苯酚 的降解受到 4硝基苯酚降解產(chǎn)物的抑制 iv. 毒性消除 毒性消除后降解菌

27、能夠繁殖， 馴化期為 2段時間之和。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 44 原生動物的捕食作用 實驗證明：設置對照組，添加真核抑制劑， 發(fā)現(xiàn)馴化期縮短 真核生物的存在抑制了 菌群？ 捕食作用不明顯的地方，如許多天然水體， 馴化期不受真核抑制劑的影響。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 45 新的基因型的出現(xiàn) 突變、種間基因轉移會導致發(fā)生遺傳改變。 新基因型產(chǎn)生后，若該選擇是有利的，降 解菌就會大量繁殖。 馴化反映的是突變或基因轉移發(fā)生的時間 與新降解菌繁殖達到高種群密度的總和。 假單胞菌 產(chǎn)堿菌 降解氯兒茶酚 基因轉移

28、FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 46 二次生長 二次生長產(chǎn)生的原因：微生物對不同基質 的利用有先后選擇。 較容易利用的基質被優(yōu)先利用：大腸桿菌 對葡萄糖、山梨糖混合液的利用；假單胞 菌對無機磷和有機磷混合液的利用。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 47 酶的誘導和停滯期 許多參與異生素分解的最初幾步酶都是誘 導酶。 誘導在幾分鐘或者幾個小時內完成，馴化 期需要幾天到幾周。 誘導酶的產(chǎn)生與基質濃度有關。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 48 2.3 微生物操作技術 1、菌株接種 接種

29、目的：生物強化作用 加速污染物的降解（對時間嚴格要求時） 克服降解微生物的不均勻性 縮短馴化期 恢復微生物區(qū)系：污染高濃度、高溫度或 其他條件抑制天然降解物種增長 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 49 接種注意點 a) 無須接種：條件有利，天然區(qū)系存在，時 間充裕 b) 接種失效：不適合降解微生物生存的條件 典型事例 烴類降解混合菌投入海水系統(tǒng)，并不能促進污染 降解 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 50 2、菌株的富集和分離 富集培養(yǎng)技術是一種常用的選擇性培養(yǎng)技術。 選擇生長因子造成特殊環(huán)境選擇優(yōu)勢微生物。 唯一碳源

30、or能源 必需無機鹽 其他條件控制 富集培養(yǎng) FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 51 3、異生素降解菌富集和分離的困難及其 解決方法 a)異生素的特點：高毒性、非水溶性、高揮發(fā)性 和熱不穩(wěn)定性 降解菌分離困難，因為有些可直接殺滅微生物， 如低分子量溶劑、醛、酚類 b)問題的處理方法： 毒性：強毒性的可以低濃度維持；水溶性差的 可以高濃度保持。 憎水性：通過分散作用或使用惰性親水載體。 具體方法：高速攪拌、超聲波乳化、硅藻土 吸附等 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 52 揮發(fā)性：適當封閉體系，注意及時補充 熱穩(wěn)定性：熱不穩(wěn)

31、定異生素不可用常規(guī)方 法加熱滅菌，過濾消毒（有機溶劑類過濾 會破壞硝化纖維素膜和聚碳酸酯膜，只能 用燒結陶瓷膜或燒結金屬膜過濾） 高毒性物質雖自身可以殺菌，但最好過濾除 菌 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 53 4、異生素降解菌富集和分離技術 富集分離的難度 常規(guī)微生物的富集分離可以直接挑選，而異 生素降解菌則不然，因為： a、生長緩慢，不易區(qū)分； b、補充的外源有機物增加了復雜性； c、不溶性異生素影響濁度觀察。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 54 可行方法： 殘留分析和生長狀況判斷 降解實驗要分析異生素殘留狀況：

32、 異生素 憎水性 萃 取 氣/ 液 相 色 譜 化 學 反 應 測 定 鹵 素 分 析 14C 標 記 生物呼吸儀 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 55 降解菌落的選擇 利用生理特征來挑選：如形成透明帶、 指示劑變色、特殊顏色反應等； 菌 落 觀 察 技 術 透明圈形成：雙層瓊脂技術 制備好的 礦物瓊脂支持平板上傾倒乳化好的異生素瓊脂， 用以觀察透明帶 顯色劑添加：利用顯色反應 ， 如降解氯代苯 胺 偶氮苯，可用茴香胺雙氧水噴灑，紅色褪 去者為降解菌落 酸堿指示劑： 有機氯的降解菌，加入酸堿指 示劑如伊紅、美藍、溴甲酚紫、溴百里酚藍，可 以檢測到顏色變化

33、FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 56 5、共代謝基質降解菌的富集和分離 共代謝基質降解菌的富集分離是困難的， 因為共代謝是不與微生物生長相聯(lián)系的基 質降解過程，不能使用降解基質作為唯一 碳源富集。 解決途徑：用類似物富集和測定富集菌中 有關的酶系。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 57 1類似物富集 使用類似物可以加速共代謝基質分解。以此 原理進行分離。 優(yōu)點：容易操作，有定向性； 缺點：不是總有效，要多多試驗。 2相關酶的測定 了解共代謝性質后，可以通過測定特定的酶 來篩選菌株，來得到降解菌。 FEL,bio-vax

34、 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 58 同生菌的富集和分離 同生菌 異生素上述方法失敗 原因？ 濃度？ 生長因子缺乏 純培養(yǎng)技術的缺陷 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 59 另一現(xiàn)象： 富集培養(yǎng)降解速率提高，但單一碳源在人工 培養(yǎng)時生長緩慢，轉管幾次后生長停止。 為何？ 培養(yǎng)基缺乏營養(yǎng)； 同生菌降解任務。 同生菌微生物的關系： 互養(yǎng)、協(xié)同共棲 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 60 有效分離手段：恒化器 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 61 “加速進化”與富集分離 在選

35、擇壓力存在的恒 化器中長期混合培養(yǎng) 微生物，通過各種微 生物間質粒的自然傳 遞和相互作用來完成 構建新菌株的目的， 又稱為 ” 質粒協(xié)助分 子育種 ” 。 A B C waste FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 62 接種試驗成功案例 在反應器中加入純培養(yǎng)、富集物或混合菌 株降解異生素容易獲得成功 土壤、含水層、地表水環(huán)境中成功的事例 不多 1、土壤：農(nóng)藥石油類以及一些特殊烴類 有：對硫磷 假單胞菌 苯胺靈 混合細菌 石油類 假絲酵母 硝基酚 混合菌株 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 63 2、其他環(huán)境 （ 1）水體

36、河口獲得的烴類降解菌可促進 石油泄漏污染，接種可促進海濱石油污染， 如將降解 PAHs的分支桿菌接種到水體可以 促進芘的礦化。 （ 2）活性淤泥系統(tǒng) 有代謝多樣的微生物，但對許多新的合成化 合物的馴化期過長，接種可加速降解。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 64 接種失敗的原因 經(jīng)?？梢砸姷浇臃N失敗的例子：海水中分 解石油烴的菌株接種到淡水中不起作用； 土壤中可利用脂肪烴的細菌接種到燃料油 污染的土壤，不促進降解 反映了引入的微生物受到多種生態(tài)因子限 制。 1. 營養(yǎng)限制 大量微生物在有機污染的水體 中競爭無機鹽，導致快速生長的非降解菌 占優(yōu)勢。證據(jù)：接種

37、體在滅菌條件下可以 分解污染物，而在非滅菌的自然環(huán)境中不 能分解的現(xiàn)象。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 65 2、捕食者和寄生物的抑制 環(huán)境中的捕食者和寄生物對細菌的抑制， 如 原生動物捕食多種細菌，要求細菌密 度在 106個 /ml(g). 證據(jù)：硝基苯利用菌 Corynebacterium spp. 對 4-硝基苯酚降解，接種到低濃度湖水中 數(shù)目下降，加入抑制原生動物和真核生物 的放線菌酮，降解正常數(shù)量增加。 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 66 3.細菌在土壤中的移動能力 一般土壤表面施用的接種物在土壤中移動不超過 5cm，通過土壤孔隙水分擴散，移動也不顯著。 通過對糞大腸桿菌的研究證實，細菌移動不超過化 糞池區(qū)域 10米。 另有研究認為細菌通過 裂隙基巖至少移動 30米 FEL,bio-vax 環(huán) 境 生 物 工 程 環(huán)境 生 物 工 程 67 4、其他原因 a 其他碳源的存在 微生物對易用碳源的利用降低污染物代謝 能力 b 有機基質濃度太低 c 需要添加額外碳源支持生長 共代謝微生 物 d 溫度 e pH值 f 鹽分：海水分離的菌不能降解淡水石油 g 毒物 天然抑制物