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1、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 一、相關(guān)知識介紹l可溶性抗原（如細(xì)菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖質(zhì)、類脂體等）與其相應(yīng)的抗體相遇后，在電解質(zhì)參與下，抗原抗體結(jié)合形成白色絮狀沉淀，出現(xiàn)白色沉淀線，此種現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,與沉淀原發(fā)生反應(yīng)的抗體稱為沉淀素（precipitin）。 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體示意圖親 水 膠 體 疏 水 膠 體轉(zhuǎn) 化 NaCl 可 見 反 應(yīng) 二、瓊脂擴(kuò)散原理l12%瓊脂凝膠所形成的構(gòu)架網(wǎng)孔較大，空隙中是9899%的水，允許分子量在20萬以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在

2、20萬以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力甚小。二者在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，結(jié)合物分子量一般大于20萬，此結(jié)合物因顆粒較大而不擴(kuò)散，故形成沉淀帶。 三、瓊脂擴(kuò)散的種類l瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)根據(jù)其擴(kuò)散方向可分單相（向）擴(kuò)散和雙相擴(kuò)散，根據(jù)抗原抗體二者是一方擴(kuò)散還是雙方擴(kuò)散，又有單擴(kuò)散和雙擴(kuò)散之別。因此，瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)就有單相單擴(kuò)散、單相雙擴(kuò)散，雙相擴(kuò)散、雙相雙擴(kuò)散4種類型。 四、以診斷禽流感為例講解雙相雙擴(kuò)散l（一）材料與試劑l1標(biāo)準(zhǔn)禽流感診斷血清，購買自生物制品 所。l2標(biāo)準(zhǔn)禽流感診斷抗原，購買自生物制品所。l3待檢血清l4瓊脂板 l5打孔器 （二）操作方法（步驟）

3、l1凝膠的配制 稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.81.5%）的比例加入8%鹽水，水浴煮沸融化20min。l2制板 將融化的瓊脂倒入平板上，使厚度2mm3mm。自然冷卻。 l3打孔 根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。打成梅花形孔（共7孔）。用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米。 4挑孔 挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣。l l5封底 把溶化瓊脂7uL左右加入孔中，以免加樣后液體從孔底滲漏。 l6加樣 以加樣器（槍）吸取樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果。 l7放置 加樣完畢后，37自由擴(kuò)散24h48h。 （三）結(jié)果判定l當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原之間出現(xiàn)一條明顯致密的沉淀線時，再進(jìn)行被檢血清孔的判定。l若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。若在72小時仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時至少要做一陽性對照。出現(xiàn)陽性對照與被檢樣品的沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽性。