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第38講 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,,第十一單元 生物技術(shù)實踐,[考綱考頻] 1．微生物的分離和培養(yǎng)(3年8考) 2.培養(yǎng)基對微生物的選擇作用(3年5考) 3.利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物(3年3考),,第十一單元 生物技術(shù)實踐,一、微生物的實驗室培養(yǎng) 1．培養(yǎng)基 (1)概念：人們按照微生物對____________的不同需求，配制出供其_______________的營養(yǎng)基質(zhì)。 (2)營養(yǎng)構(gòu)成：一般都含有水、__________、氮源和無機(jī)鹽。此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及________的要求。 (3)種類：按照物理性質(zhì)可分為________培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和__________培養(yǎng)基。,營養(yǎng)物質(zhì),生長繁殖,碳源,氧氣,液體,固體,煮沸消毒法,紫外線消毒法,灼燒滅菌,高壓蒸汽滅菌,3．大腸桿菌的純化培養(yǎng) (1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 配制步驟：計算→________→溶化→_________→倒平板。 (2)純化大腸桿菌 ①純化大腸桿菌，其關(guān)鍵的步驟是_________。 ②純化培養(yǎng)方法：___________法和_______________法。 ③純化培養(yǎng)原理：在培養(yǎng)基上得到由一個細(xì)胞 繁殖而來的肉眼可見的_________，即可獲得較純的菌種。,稱量,滅菌,接種,平板劃線,稀釋涂布平板,菌落,二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù) 1．分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是由于它們能合成_________，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機(jī)物的過程中起_________作用。以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基能促進(jìn)分解尿素的細(xì)菌的生長和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生長，從而將目的菌分離。 2．統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計樣品中的活菌一般用_____________________法。 3．實驗流程：土壤取樣→制備____________→微生物的培養(yǎng)與觀察→細(xì)菌的計數(shù)。,脲酶,催化,稀釋涂布平板,培養(yǎng)基,三、分解纖維素的微生物的分離 1．纖維素酶 (1)組成：纖維素酶是一種復(fù)合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。 (2)作用,2．菌種篩選 (1)方法：_______________。,剛果紅染色法,是否產(chǎn)生透明圈,纖維素,纖維素酶,1．用平板劃線法或稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時( ) ①可以用相同的培養(yǎng)基 ②都需要使用接種環(huán)進(jìn)行接種 ③都需要在火焰旁進(jìn)行接種 ④都可以用來計數(shù)活菌 A．①② B．③④ C．①③ D．②④,C,解析：平板劃線法或稀釋涂布平板法都使用固體培養(yǎng)基，故①正確；平板劃線法采用接種環(huán)進(jìn)行操作，而稀釋涂布平板法采用涂布器進(jìn)行操作，故②錯誤；純化時，要進(jìn)行無菌操作，需要在火焰旁接種,避免空氣中的微生物混入培養(yǎng)基， 故③正確；平板劃線法一般用于分離而不是計數(shù)，故④錯 誤。,2．分離纖維素分解菌的實驗過程中操作有誤的是( ) A．經(jīng)選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng) 基上 B．選擇培養(yǎng)這一步可省略，但培養(yǎng)纖維素分解菌少 C．經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色 D．對照組可用等量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上 解析：經(jīng)選擇培養(yǎng)后，再經(jīng)稀釋，才能將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上；選擇培養(yǎng)可省略；經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色；設(shè)置對照能證明經(jīng)選擇培養(yǎng)的確得到了要分離的微生物。,A,3．微生物(除病毒外)需要從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)并通過代謝來維持正常的繁殖。下列有關(guān)微生物營養(yǎng)的說法正確的是 ( ) A．乳酸菌與硝化細(xì)菌所利用的碳源物質(zhì)是相同的 B．微生物生長中不可缺少的一些微量的無機(jī)物稱為生長因子 C．培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度越高對微生物的增殖越有利 D．生長因子一般是酶或核酸的組成成分，微生物本身合成這些生長因子往往不足,D,4．無菌技術(shù)常圍繞著如何避免雜菌的污染展開。下列常見的無菌技術(shù)中，屬于滅菌處理的是( ) A．操作者的雙手用酒精擦拭 B．實驗室用紫外線照射 C．對接種環(huán)進(jìn)行灼燒處理 D．水源用氯氣處理 解析：滅菌是用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生 物，包括芽孢和孢子。常用的滅菌方法有灼燒滅菌法、干熱 滅菌法和高壓蒸氣滅菌法。操作者的雙手用酒精擦拭、實驗 室用紫外線照射、水源用氯氣處理都屬于消毒，對接種環(huán)進(jìn) 行灼燒處理屬于灼燒滅菌。,C,考點(diǎn)一 培養(yǎng)基的類型及配制,考點(diǎn)二 微生物的純化培養(yǎng)——平板劃線法與稀釋涂布平板法,考點(diǎn)三 微生物的篩選與計數(shù),1．培養(yǎng)基的類型及作用,考點(diǎn)一 培養(yǎng)基的類型及配制,液體,半固體,固體,天然,合成,不明確,明確,選擇,特定種類的微生物生長,鑒別,指示劑或化學(xué)藥品,2.培養(yǎng)基的配制原則 (1)目的要明確：根據(jù)微生物的種類、_____________等 選擇原料配制培養(yǎng)基，如培養(yǎng)自養(yǎng)型的微生物就不用加入有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。 (2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的_______________。 (3)pH要適宜：各種微生物適宜生長的____________不同。,培養(yǎng)目的,濃度和比例,pH范圍,深度思考 為了檢測飲用水中是否含有某種細(xì)菌，配制了如表培養(yǎng)基配方： (1)該培養(yǎng)基所含的氮源是什么？ ___________________________ (2)該培養(yǎng)基屬于哪種培養(yǎng)基？作用是什么？ ___________________________,提示：(1)蛋白胨。 (2)鑒別培養(yǎng)基；鑒別是否有大腸桿菌。,1．(2015·銀川模擬)微生物的實驗室培養(yǎng)，最為關(guān)鍵的是不僅要為微生物提供合適的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，還要 能解決雜菌對培養(yǎng)物的污染問題。請結(jié)合微生物的實驗室培養(yǎng) 知識回答以下問題： (1)培養(yǎng)基能為微生物提供營養(yǎng)。各種培 養(yǎng)基的配方不同，但一般都含有_________________________，如蛋白胨除了提供氮源之外，還提供__________________________； 另外，培養(yǎng)基還需要滿足微生物對_____________________________的要求。,碳源、氮源、無機(jī)鹽、水,碳源、磷酸鹽和維生素,pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣,(2)獲得純正培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來微生物入侵。對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，需要進(jìn)行清潔和________(填“消毒”或“滅菌”)；而一般對培養(yǎng)基通常選擇________________法進(jìn)行滅菌。 (3)微生物的接種方法很多，其核心都是要防止雜菌污染，保證培養(yǎng)物的純正。微生物接種最常用的方法是________________和________________。 (4)對分離的微生物作進(jìn)一步鑒定和篩選，常需要借助生物化學(xué)方法，如在以____________為唯一碳源的培養(yǎng)基中加入____________，可用來鑒定纖維素分解菌；而 篩選纖維素分解菌，則依據(jù)培養(yǎng)基是否產(chǎn)生___________(特征)來篩選。,消毒,高壓蒸汽滅菌,平板劃線法,稀釋涂布平板法,纖維素,剛果紅,透明圈,考點(diǎn)二 微生物的純化培養(yǎng)——平板劃線法與稀釋涂布平板法,接種環(huán)上,殘留菌種,殘留菌種,滅菌,溫度太高,大小適當(dāng),酒精燈火焰,移液管管頭,深度思考 1．下圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為1、2、3、4、5。 (1)接種時不能劃破培養(yǎng)基的原因是什么？ ___________________________ (2)第1區(qū)和第5區(qū)的劃線能否相連？為什么？ ___________________________,2．為什么稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中菌落的數(shù)目往往比實際數(shù)目低？ ___________________________ 3．在制備固體培養(yǎng)基進(jìn)行倒平板操作時，平板冷凝后，某同學(xué)將平板倒置，其原因是什么？ ___________________________ 提示：1.(1)若劃破培養(yǎng)基難以達(dá)到分離單菌落的目的。 (2)不能。以便比較前后的菌落數(shù)。 2．這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。 3．培養(yǎng)皿上會凝有水珠，平板倒置可防止水珠落入培養(yǎng)皿中而造成污染，還可使培養(yǎng)皿表面的水分更好的揮發(fā)。,2．(2014·高考新課標(biāo)全國卷Ⅱ)為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細(xì)菌含量，并進(jìn)行了細(xì)菌分離等工作。回答下列問題： (1)該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中的細(xì)菌含量。在涂布接種前，隨機(jī)取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是______________________________； 然后，將1 mL水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為____________________。,檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格,3.8×107,(2)該小組采用平板劃線法分離水樣中的細(xì)菌。操作時，接種環(huán)通過________滅菌，在第二次及以后的劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是___________________________________________。 (3)示意圖A和B中，________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。,灼燒,將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落,B,(4)該小組將得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中并混勻，一部分進(jìn)行靜置培養(yǎng)，另一部分進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：振 蕩培養(yǎng)的細(xì)菌比靜置培養(yǎng)的細(xì)菌生長速度快。分析其原因是：振蕩培養(yǎng)能提高培養(yǎng)液中________的含量，同時可使菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高_(dá)_____________的利用率。,溶解氧,營養(yǎng)物質(zhì),解析：(1)取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)一段時間，可依據(jù)是否產(chǎn)生菌落確定培養(yǎng)基的滅菌效果是否理想。由樣品中菌株數(shù)計算公式：(C÷V)×M知：1 mL水樣中菌株數(shù)為(38÷0.1)×100＝3.8×104，故每升水樣中的活菌數(shù)為3.8×107。(2)利用接種環(huán)接種時，接種環(huán)需灼燒 滅菌。利用平板劃線法分離細(xì)菌時，在第二次及以后劃線時，總是從上一次劃線的末端開始，可以將聚集的菌體逐步稀釋以便得到單個菌落。(3)稀釋涂布平板法是用涂布器將菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，故培養(yǎng)后產(chǎn)生的菌落應(yīng)隨機(jī)分布在培養(yǎng)基 表面，即B表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。(4)液體培養(yǎng)基通過振蕩可提高溶氧量，同時使菌體與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而提高細(xì)菌的生長速度。,1．篩選菌株 (1)原則：人為提供有利于_______________生長的條件，同時抑制或阻止其他微生物的生長。,考點(diǎn)三 微生物的篩選與計數(shù),目的菌株,(2)菌株篩選原理的比較,尿素,纖維素,酚紅,紅色復(fù)合物,纖維素分解菌為中心的透明圈,2.幾種典型微生物的篩選方法 (1)培養(yǎng)基中加入__________可以分離出酵母菌和霉菌。 (2)培養(yǎng)基中加入_______________可得到金黃色葡萄球菌。 (3)培養(yǎng)基中缺乏___________時，可以分離固氮微生物。 (4)當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時，也具有分離效果。如當(dāng)石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離能消除石油污染的微生物的目的。 (5)改變微生物的____________，也可以達(dá)到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，只能得到耐高溫的微生物。,青霉素,高濃度的食鹽,氮源,培養(yǎng)條件,3．統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法 (1)顯微鏡直接計數(shù)法 ①原理：利用特定_______________________________，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。 ②方法：用計數(shù)板計數(shù)。 ③缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。,細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板,(2)間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法) ①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的_______________，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 ②計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。 ③操作：設(shè)置_______________，增強(qiáng)實驗的說服力與準(zhǔn)確性。同時為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。,菌落數(shù),重復(fù)組,深度思考 1．為了使結(jié)果接近真實值，應(yīng)如何設(shè)置平板，計算出菌落平均數(shù)？ ___________________________ 2．某同學(xué)在測定大腸桿菌的密度時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上還有其他雜菌的菌落，由此他判斷該品系大腸桿菌被污染了。他的判斷是否確切？為什么？ ___________________________ 3．計算時若本組實驗值與其他平板計數(shù)值相比，明顯偏離實際值，應(yīng)如何處理？ ___________________________,提示：1.設(shè)置三個或三個以上的平板。 2．不確切。因為不能確定雜菌是來自培養(yǎng)基還是來自培養(yǎng)過程。 3．要舍棄掉后求平均值。,3．下面是探究如何從土壤中分離出自生固氮菌與計數(shù)的實 驗。完成下列問題： (1)實驗原理：農(nóng)田的表層土壤中，自生固氮菌的含量比較 多。將用表層土壤制成的稀泥漿，接種到無氮培養(yǎng)基上進(jìn)行 培養(yǎng)。在這種情況下，只有自生固氮菌才能生長繁殖。用這 種方法，可以將自生固氮菌與其他細(xì)菌分離。 (2)材料用具：農(nóng)田的表層土壤、無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基、盛有9 mL無菌水的試管、無菌吸管、無菌涂布器、無菌培養(yǎng)皿、盛有90 mL無菌水的錐形瓶、恒溫箱。,(3)方法步驟： ①倒平板：分別將無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平 板，應(yīng)在____________________操作。 ②制備土壤稀釋液：取土樣10 g加入盛有 90 mL 無菌水的錐 形瓶中，充分搖勻。用無菌吸管吸取上清液1 mL，轉(zhuǎn)至盛有9 mL的無菌水的試管中，依次稀釋到107稀釋度。 ③涂布：按照由107～103 稀釋度的順序分別吸取 0.1 mL 進(jìn)行平板涂布，每個稀釋度下，無氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布_______個平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布____個。 ④培養(yǎng)：放入恒溫箱內(nèi)，在28～30 ℃下培養(yǎng)3～4 d。,酒精燈火焰旁,3,1,⑤細(xì)菌的計數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在________的平板進(jìn)行計數(shù)。如果測定的平均值為50，則每克樣品中的菌落數(shù)是________。(稀釋度是105) (4)預(yù)期結(jié)果：相同稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)________(選填“多于”或“少于”)無氮培養(yǎng)基上的數(shù)目，原因是____________________________________________________ ___________________________________________________。,30～300,5×107,多于,無氮培養(yǎng)基上只有土壤中的自生固氮菌能生存繁殖，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類生存,解析：在酒精燈火焰旁倒平板，可以減少雜菌的污染。為了 保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～ 300的平板進(jìn)行計數(shù)，并取平均值，則每克樣品中的菌落數(shù)為(50÷0.1)×105＝5×107。用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，以消除無關(guān)變量對實驗結(jié)果的影響，該培養(yǎng)基幾乎適 合所有細(xì)菌生存，所以，它比無氮培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目多。,易錯點(diǎn)1 誤認(rèn)為不同生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)不同 [點(diǎn)撥] (1)微生物需要的營養(yǎng)成分有水、無機(jī)鹽、碳源、氮源，有些微生物還需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如生長因子。 (2)在人和動物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括水、無機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。 (3)在植物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括礦質(zhì)元素、水、二氧化碳三類。,易錯點(diǎn)2 消毒與滅菌混為一談 [點(diǎn)撥],易錯點(diǎn)3 進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時，要將培養(yǎng)皿倒置 [點(diǎn)撥] 如果正放培養(yǎng)皿，則皿蓋上形成的水滴會落入培 養(yǎng)基表面并且擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的細(xì)菌會隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。因此恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿必須倒置。,1．(2015·北京海淀區(qū)期末T20C)培養(yǎng)基中一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽四種成分。( ) 2．將土壤浸出液涂布在無菌的選擇培養(yǎng)基上分離分解尿素的細(xì)菌，是否無菌操作影響較小。( ) 3．(2013·江蘇卷T18A)培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌。 ( ),√,√,×,4．(2013·江蘇卷T18C)從有機(jī)廢水中分離微生物用于 廢水 處理時，接種后的培養(yǎng)皿須放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。( ) 5．(2013·重慶卷T5A)消毒的原則是既殺死材料表面的微生 物，又減少消毒劑對細(xì)胞的傷害。( ) 6．統(tǒng)計樣品中的活菌一般使用平板劃線法。( ) 7．土壤中纖維素分解菌的篩選流程中的“選擇培養(yǎng)”是必不可少的。( ) 8．在富含纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅染色劑，若出現(xiàn)周圍存在透明圈的菌落，則說明篩選到了分解纖維素的微生物。 ( ),×,√,×,×,√,